专利名称：：以放射肋为标记的菲律宾蛤仔制种工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及利用放射肋这一数量性状为标记，定向改良经济性状，通过定向选育、单体杂交、建立杂交家系获得优良性状的选育系和杂交系。具体地说，是一种通过数量性状定向改良经济性状的有效方法，尤其适用于壳型变异比较大的贝类。
背景技术：
：贝类在一定程度上表现出壳型的多态性，这种多态性和生长指标作为数量性状是贝类遗传育种研究的主要内容。通过壳型与生长指标相关分析，筛选出与经济性状紧密相关的壳型，在贝类遗传改良中具有重要意义。生物在遗传上的差异及其与数量性状的关系即在研究遗传变异的同时，对数量性状进行全面的分析比较，用更多的有效参数来研究形态性状与基因变异的关系及不同群体间的差异，是现代群体遗传学研究的一个热点领域。由于菲律宾蛤仔(iz^/to;^/M^//wwwm)的壳型随环境变化很大,壳色和壳面花纹各异，分类学家曾将其定为许多不同的种(庄启谦，2000)。刘仁沿等(1999)探讨了中国沿海6个菲律宾蛤仔群体形态性状与遗传变异的关系，发现不同地理群体菲律宾蛤仔壳型存在多态现性；闫喜武等(2005)在对菲律宾蛤仔莆田群体与大连群体生物学比较中发现，大连群体和莆田群体在壳型上存在明显差异；张跃环等(2006-2008)对大连群体不同壳型菲律宾蛤仔的生长发育进行了比较，并开展了两种极端壳型品系的双列杂交，在此基础上，建立了不同壳型品系蛤仔的杂交家系，并从中筛选出生长快、抗逆性强的选育系和杂交系。本发明用壳型和生长指标来共同探讨不同壳型菲律宾蛤仔亲本与后代生长发育的关系，从而最终达到利用放射肋这一数量性状作为标记对菲律宾蛤仔生长发育、经济数量性状进行定向改良的目的。
发明内容依据菲律宾蛤仔壳表明的放射肋数量的不同，将菲律宾蛤仔分为两种壳型，放射肋为5070条的为壳宽蛤，放射肋为90120条的为壳扁蛤。本发明分为以下三部分内容(1)两种壳型菲律宾蛤仔品系的定向选育，包括壳宽蛤、壳扁蛤的生长发育比较。(2)两种壳型品系间的单体杂交，即壳宽蛤x壳扁蛤的双列杂交。(3)通过单体杂交获得的子一代，建立3种两两壳型品系的杂交家系，包括壳宽蛤x中间型、中间型x壳扁蛤、壳宽蛤x壳扁蛤的杂交。其中两种壳型菲律宾蛤仔品系的定向选育的具体步骤如下第一步、亲贝来源与选取从野生群体或养殖群体中，以放射肋为标记，选出放射肋为5070条的壳宽蛤和放射肋为90120条的壳扁蛤作为繁殖群体。第二步、产卵及孵化当亲贝性腺成熟时，将不同壳型蛤仔亲贝单独放置，经过阴干、流水刺激，放到澄有新鲜海水的水泥池中产卵，为了提高孵化率，孵化密度为3040个/ml，在温度202fC的条件下，经过24~26h全部孵化至D形幼虫。第三步、幼虫培养用300目筛绢网制作的网箱选育D形幼虫，幼虫培养密度68个/ml，每天换2次水，换水量为50%，水温为20.423.6。C，盐度为2428，饵料每天投喂2次，前期为绿色巴夫藻，后期为绿色巴夫藻与小球藻以l:l的比例混合投喂，投饵量根据幼虫摄食情况进行调整，绿色巴夫藻可以用湛江等鞭金藻替换。为防止不同壳型蛤仔幼虫之间混杂，换水网箱单独使用。期间为了消除养殖密度的影响，根据幼虫的生长情况，定期对培养密度进行调整。第四步、稚贝培育幼虫变态后，培育条件同第三步，当稚贝生长至60日龄时，将稚贝装入60目的网袋中，转移至室外生态池进行中间育成，并保证每种壳型蛤仔稚贝密度一致；第五步、稚贝中间育成采用60目网袋在生态池中进行，定期按60目、40目、20目的顺序更换网袋，消除网目对稚贝生长的影响，同时对密度进行调整，使每个重复密度保持一致；第六步、经过以上环节，获得子一代的两种壳型的蛤仔品系，次年子代性腺成熟，可以产卵，重复第二步第五步，从而获得子二代，循环36代，使壳型得到进一步纯化。两种壳型品系间的单体杂交，即壳宽蛤x壳扁蛤的双列杂交的具体方法如下亲贝来源同上述第一步，当其亲贝性腺成熟时，通过阴干、流水刺激，亲贝开始产卵排精，将正在产卵排精的个体抓出来，用自来水冲洗干净，放到盛有新鲜海水的2.0L塑料桶中，大约经过515min,单独放置的个体会继续产卵排精。共选取4个，壳宽蛤、壳扁蛤雌雄各一个，采用单体杂交方式，建立了壳宽蛤x壳扁蛤的双列杂交。受精前检査卵子是否已经受精，已受精个体的卵子弃掉，换取未受精的个体进行杂交，将获得的精卵组合好受精，在事先处理好的备用塑料桶中迅速混合，搅拌均匀。用150目筛绢网过il杂质，转入100L桶中孵化，调整密度45个/ml，充气孵化。各实验组严格隔离，使其不受外来精卵的影响。其它同上述第三步第五步。可获得自交个体壳宽蛤、壳扁蛤和杂交子一代中间型个体。建立两两壳型品系间的杂交组合，其亲贝来源于两种壳型品系间单体杂交的子一代，当其亲贝性腺成熟时，将获得的自交个体壳宽蛤、壳扁蛤和杂交子一代中间型个体，通过阴干、流水刺激，24h后亲贝就开始产卵排精，共选取12个，3种壳型蛤仔各4个，从而得到了3个两两壳型品系间的杂交组合，即壳宽蛤x中间型、中间型x壳扁蛤、壳宽蛤x壳扁蛤。其它同上述第三步第五步。本发明无需转基因等复杂技术导入外源基因，不会对生物和环境安全造成影响。以放射肋作为遗传标记，通过定向选育，使壳型不断纯化，得到选育系；在此基础上进行杂交，获得具有杂种优势的外观一致的杂交品系。最终达到利用放射肋这一数量性状控制生长、存活性状，从而有效改良经济性状。具体实施例方式通过实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。实施例1、两种壳型菲律宾蛤仔品系的定向选育，包括壳宽蛤、壳扁蛤的生长发育比较。其具体步骤如下第一步、亲贝来源与选取于2006年5月18日，从野生群体中，以放射肋为标记，选出处于临产状态的壳宽蛤(放射肋5070条)、壳扁蛤(放射肋90120条)各20Kg作为繁殖群体。第二步、产卵及孵化将两种壳型蛤仔亲贝单独放置，经过阴干、流水刺激，放到澄有新鲜海水的水泥池G0m3)中产卵。为了提高孵化率，孵化密度控制在30-40个/ml。在温度20.421.2。C的条件下，大约经过26h全部孵化至D形幼虫。第三步、幼虫培养用300目筛绢网制作的网箱选育D形幼虫，幼虫培养密度6-8个/ml，每天换2次水，换水量为50%。饵料每天投喂2次，前期为绿色巴夫藻(湛江等鞭金藻)，后期为绿色巴夫藻(湛江等鞭金藻)与小球藻以l:l的比例混合投喂，投饵量视幼虫摄食情况而定。为防止不同壳型蛤仔幼虫之间混杂，换水网箱单独使用。幼虫培育期间，水温为20.423.6i:，盐度为2428。为6了消除养殖密度的影响，在幼虫期定期对密度进行调整。第四步、稚贝培育幼虫变态后，正常培育同第三步。当稚贝生长至60日龄时，将稚贝装入60目的网袋中，转移至室外生态池进行中间育成，并保证每种壳型蛤仔稚贝密度一致。第五步、稚贝中间育成于2006年的710月在生态池中进行中间育成。中间育成采用60目网袋(40cmx60cm)，在稚贝中间育成阶段，定期按60目、40目、20目的顺序更换网袋，消除网目对稚贝生长的影响；同时，对密度进行调整，使每个重复密度保持一致。第六步、经过幼虫培养、稚贝培育、中间育成等环节，获得了两种壳型蛤仔品系的子一代。2007年的6月初子代性腺成熟，可以产卵，从而获得子二代，如此循环下去使得壳型得到进一步纯化。从中筛选出生长快、存活率高的壳扁型品系(见表l、表2)。表l、菲律宾蛤仔两种壳型品系幼虫、稚贝生长速度的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注生长速度为幼虫、稚贝、幼贝的平均日增长(pmd—1)，下同。表2、菲律宾蛤仔两种壳型品系幼虫、稚贝存活率的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注幼虫存活率为浮游期足面盘幼虫与D形幼虫数量的百分比；变态率为出现次生壳稚贝数与足面盘幼虫的百分比；室内培育期稚贝存活率为出池稚贝数与刚刚完成变态稚贝数的百分比；中间育成存活率为获得的幼贝数量与出池时稚贝数量的百分比，下同。实施例2、两种壳型品系间的单体杂交，即壳宽蛤x壳扁蛤的双列杂交。其亲贝来源同实施例l中的第一步，当其亲贝性腺成熟时，通过阴干、流水刺激，亲开贝始产卵排精，将正在产卵排精的个体抓出来，用自来水冲洗干净，放到盛有新鲜海水的2.0L塑料桶中，大约经过515min，单独放置的个体会继续产卵排精。共选取4个，壳宽蛤、壳扁蛤雌雄各一个，采用单体杂交方式，建立了壳宽蛤x壳扁蛤的双列杂交。受精前检查卵子是否已经受精，已受精个体的卵于弃掉，换取未受精的个体进行杂交，将获得的精卵组合好受精，在事先处理好的备用塑料桶中迅速混合，搅拌均匀。用150目筛绢网过滤杂质，转入100L塑料桶中孵化，调整密度45个/ml，充气孵化。各实验组严格隔离，使其不受外来精卵的影响。其它同实施例1中的第三步第五步。两种壳型品系蛤仔的双列杂交实验设计(表3)及自交组、杂交组的生长、存活性状见表4、表5，发现杂交组具有较高的生长、存活优势，且PW〉WP。表3、两种壳型蛤仔双列杂交的实验设计_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例3、通过实施例2单体杂交获得的子一代，建立3种两两壳型品系的杂交家系，包括壳宽蛤x中间型、中间型x壳扁蛤、壳宽蛤x壳扁蛤的杂交。2007年9月，实施例2中的子一代性腺成熟时，将获得杂交获得壳宽型蛤仔W(放射肋5070条)、中间型M(放射肋7090条)、壳扁型P(放射肋90~120条)，通过阴干、流水刺激，2~4h后亲贝就开始产卵排精，共选取12个，3种壳型蛤仔各4个，从而得到了3个两两壳型品系间的杂交组合(PW、WM、PM)，每个杂交组合由4个杂交家系组成，一共建立了12个杂交家系(表6)。其它同实施例1中的第三步第五步。各杂交组合的幼虫、稚贝的生长、存活如表7、表8。同实施例2，PW杂交组合表现出较高生长与存活优势，尤其是在幼虫存活率和变态率上表现得更为显著。表6、不同壳型蛤仔杂交家系建立的实验设计亲本w2Sp,$PiW,P2W,P2W2w3$---p3-一p4--MiPW丽PMW媽W4MjW3M2W4M2P3M3P3M4P4M3P4M4表7、各杂交组合幼虫、稚贝生长速度的比较类别PW杂交组合WMPM幼虫浮游期(0~9日龄，nmd-1)10.21±0.429.96±0.529.29±0.52幼虫变态期(915日龄，拜(T1)1.72±0.481.93±0.532.08±0.39室内稚贝期(15~40日龄，MmcT1)16.74±3.0613.08±2.2415.20±2.55表8、各杂交组合幼虫、稚贝存活率的比较类别PW杂交组合WMPM幼虫浮游期(0~9日龄，％)76.22±9.0042.75±10.467.15±2.30幼虫变态率(9~15日龄,％)83.20±8.458.42±3.0610.75±3.70室内稚贝期(15~40日龄，％)93.25±2.99卯.75±2.2187.25±4.8权利要求1、以放射肋为标记的菲律宾蛤仔制种工艺，其特征在于两种壳型菲律宾蛤仔品系的定向选育，具体步骤如下第一步、亲贝来源与选取从野生群体中，以放射肋为标记，选出放射肋为50～70条的壳宽蛤和放射肋为90～120条的壳扁蛤作为繁殖群体；第二步、产卵及孵化当亲贝性腺成熟时，将不同壳型蛤仔亲贝单独放置，经过阴干、流水刺激，放到澄有新鲜海水的水泥池中产卵，孵化密度为30～40个/ml，在温度20～24℃的条件下，经过24～26h全部孵化至D形幼虫；第三步、幼虫培养用300目筛绢网制作的网箱选育D形幼虫，幼虫培养密度6～8个/ml，每天换2次水，换水量为50％，水温为20.4～23.6℃，盐度为20～32，饵料每天投喂2次，前期为绿色巴夫藻，后期为绿色巴夫藻与小球藻以1∶1的比例混合投喂，投饵量根据幼虫摄食情况进行调整，期间定期对培养密度进行调整；第四步、稚贝培育幼虫变态后，培育条件同第三步，当稚贝生长至60日龄时，将稚贝装入60目的网袋中，转移至室外生态池进行中间育成，并保证每种壳型蛤仔稚贝密度一致；第五步、稚贝中间育成采用60目网袋在生态池中进行，定期按60目、40目、20目的顺序更换网袋，消除网目对稚贝生长的影响，同时对密度进行调整，使每个重复密度保持一致；第六步、经过以上环节，获得子一代的两种壳型的蛤仔品系，次年，子代性腺成熟，可以产卵，重复第二步～第五步，从而获得子二代，循环3～6代，使壳型得到进一步纯化。2、根据权利要求l所述的以放射肋为标记的菲律宾蛤仔制种工艺，其特征在于两种壳型菲律宾蛤仔品系的定向选育，亲贝可从养殖群体中进行选取。3、根据权利要求l所述的以放射肋为标记的菲律宾蛤仔制种工艺，其特征在于两种壳型菲律宾蛤仔品系的定向选育，饵料绿色巴夫藻可以用湛江等鞭金藻替换。4、根据权利要求l所述的以放射肋为标记的菲律宾蛤仔制种工艺，其特征在于两种壳型菲律宾蛤仔品系的定向选育，幼虫培养期间，不同壳型蛤仔幼虫的换水网箱单独使用。5、根据权利要求l所述的以放射肋为标记的菲律宾蛤仔制种工艺，其特征在于采用单体杂交方式，建立壳宽蛤x壳扁蛤的双列杂交，当亲贝性腺成熟时，通过阴干、流水剌激亲贝产卵排精，从中选取壳宽蛤、壳扁蛤雌雄各一个，用自来水冲洗干净，放到盛有新鲜海水的2.0L塑料桶中，经过515min,将获得的精卵组合好受精，迅速混合，搅拌均匀，用150目筛绢网过滤杂质，转入100L桶中孵化，调整密度45个/ml，充气孵化。6、根据权利要求l所述的以放射肋为标记的菲律宾蛤仔制种工艺，其特征在于，当壳宽蛤x壳扁蛤的双列杂交的子一代性腺成熟时，通过阴干、流水刺激其产卵排精，分别选取自交个体壳宽蛤、壳扁蛤和杂交子一代中间型个体各4个作为亲贝，从而得到3个两两壳型品系间的杂交组合，即壳宽蛤x中间型、中间型x壳扁蛤、壳宽蛤x壳扁蛤。全文摘要一种以放射肋为标记的菲律宾蛤仔制种工艺，利用可以稳定遗传的放射肋这一数量性状为标记，以不同壳型的菲律宾蛤仔为材料，通过定向选育、单体杂交、建立杂交家系来获得具有优良经济性状的选育系和杂交系。具体地说，选育系包括生长快、抗逆性强的壳扁型品系；同时，进行了壳扁型和壳宽型品系的双列杂交，得到了具有杂种优势的中间型品系；在此基础上，建立了3种壳型品系的杂交家系，进一步证实了中间型品系具有优良的表型性状。本发明获得的选育系和杂交系具有生长快，存活率高的特点，为提高菲律宾蛤仔产量及品种改良奠定了良好的基础。文档编号A01K61/00GK101317554SQ20081001175公开日2008年12月10日申请日期2008年6月11日优先权日2008年6月11日发明者澎张,张国范,张跃环,凤杨,金晶宇,闫喜武申请人:大连水产学院