专利名称：：防治蔬菜土传病害的ar156合剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种防治蔬菜土传病害的复合生防菌剂AR156合剂，属于农作物防病治病
技术领域：
，专用于多种蔬菜土传病害的无公害防治。二、技术背景植物土传病害多为土壤习居菌，如引起茄科作物青枯病的i"/加m'aw/a"acean'簡，弓l起多种植物禾古、黄萎病的Fw.ran'wmowon'w附，PfeW/"7/ZwmdaWae/，以及近年来在各地危害越来越严重的根结线虫病害(Afe/oWogy^spp.)等。茄科作物青枯病属世界性病害，病原细菌可侵染50多科200多种植物，全球范围内造成的经济损失多达120亿美元；辣椒疫病户/^o;^加/zwflc/n7/在我国蔬菜生产上常年造成巨大损失；根结线虫Ufe7oiVo^77espp.)侵染保护地蔬菜，致使寄主常年减产15-25%，有时达70%以上，严重地制约了蔬菜的生产和出口创汇，有的甚至到了无法种植的地步。据估计，我国农作物的生产每年因土传病害而遭受的经济损失达数十亿元以上。而生产上，这些病害往往同时发生，如番茄大棚土壤中根结线虫和细菌性青枯、真菌性枯萎、黄萎同时发生复合侵染，造成的损失非常严重。这些土传病害都有寄主范围广、抗逆性强、难以根除等特点，对复合侵染防治尤其困难。生产中往往既缺乏优良的抗病品种，又缺乏有效的化学防治药剂。而过多施用化学农药会带来一系列生态和社会问题，如病虫草产生的抗性，对非靶标生物的直接危害，对土壤、水、大气的污染，生物富集作用对人健康的影响，国际贸易对农药残留农产品的限制等。早在1992年世界环境与发展大会就要求"在全球范围内控制化学农药的销售和使用"，不能过份依赖化学农药已成为人类的共识。研究与开发生防制剂，利用生防细菌和PGPR细菌是一种比较有效的防治手段，通过空间位点竞争和营养的竞争，直接分泌胞外酶降解作用，产生抗生素抑制病原，诱导植物产生抗病性等机制，既可以减少化学农药使用带来的环境污染，提高农产品的价值，又可以改善土壤微生态环境，压低有害生物的种群数量，利于农作物的可持续生产，为我国无公害绿色蔬菜的生产提供有力保障。现有技术中按照本实验室的菌体保藏液专利(公开专利号CN1358838，公开日2002年7月17日)方法，菌体可室温保存23年。三、
发明内容技术问题本发明的目的是针对当前防治植物土传病害使用的化学农药污染严重、使用成本过高的缺陷，并且现有技术中的对多种植物土传病害没有同时具有较高防效的生防制剂，开发一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂，该菌剂的防效可达45%以上，并且有显著的促生作用。技术方案本发明为一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂AR156合剂，含三种细菌成分分别是菌株AR156，为芽孢杆菌属(泡w77iAssp.)于2007年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCN0.1929;菌株XY21为沙雷氏菌属(5"e/ratiaA于2007年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.2059;菌株SM21属芽孢杆菌属(fec/77ww.)，于2007年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCN0.2058。复合生防菌剂AR156合剂的制备方法为1)将以上所述的三种菌株接种到PDA培养液中分别培养37tU80rpm，1620小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的0D值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；2)当培养至OD值在0.50.8之间时，将种子菌液以l:IOO体积比加入PDA培养液中，30°C180rpm振荡培养2024小时，然后4000g离心10min，每1000ml培养液获得1316g湿菌，每克湿菌含4X10"10'5个菌体；3)取湿菌与菌体保藏液(公开专利号CN1358838，公开日2002年7月17日)按lg:40ml配成三种细菌单剂，再将三种细菌单剂按l:1:l混合均匀，即得复合生防菌剂，成品中活菌总浓度为lX109lX10'2cfu/ml，用于防治蔬菜土传病害。其中所用PDA培养液配制方法为用200克土豆削皮后切成小块放入水中，沸腾后至少煮20分钟以上，用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，PH值调至7.2-7.4，然后12rC15个大气压灭菌20分钟。有益效果本发明的优点和积极效果表现在本发明是专门针对蔬菜土传病害开发的生防制剂，在防治蔬菜土传病害方面与目前其他广谱生物杀菌剂相比防治效果显著提高。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于蔬菜的出口。同时，该菌剂还有增产功能，可为农民增加收入。该菌剂用湿菌与本实验室的菌体保藏液按1:40(g/ml)配成菌剂，可室温保存23年。温室实验表明该菌制剂能显著促进辣椒生长的作用，对多种病原有良好防效(表l3)。温室大棚实验表明使用该菌剂对多种蔬菜土传病害根防治效果可达5085%，增产可达5096以上(表47)。该菌剂可以在温室移栽前倒入有机肥中制成堆肥，然后随肥料在整地过程中埋到土里，也可以在移栽时灌根使用。对茄科作物青枯病温室与田间防效分别为90%和70%以上，茄科作物疫病防效为65%以上，对蔬菜根结线虫病的防效为6085%，增产可达50200%，同时该菌剂还可以改善土壤板结现象。四具体实施方式本发明为一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂AR156合剂，含三种细菌成分-分别是菌株AR156，为芽孢杆菌属(^a""^w.)于2007年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCN0.1929(保藏证明已于发明专利提交申请号200710021376.0防治温室蔬菜根结线虫病的生防菌株申请日2007.4.10);XY21为沙雷氏菌属(5ferra"aJ，于2007年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.2059;菌株SM21为芽孢杆菌属(fec/77^卬.)，于2007年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCN0.2058。AR156菌株，为芽孢杆菌属(fe"77ys砂.)分离自南京紫金山森林土，在LB培养基上12h产生单菌落，培养24h菌落乳白色，质地均一，圆形，干燥，中间隆起，表面粗糙，菌体为直杆状，G+，该菌株还可分泌产生蛋白酶。XY21菌株，为沙雷氏菌属(5"e汀afia印J;分离自镇江森林土壤，XY21在LB培养基上10h产生单菌落，培养24h菌落乳白色，质地均一，圆形，湿润，中间隆起，表面光滑，菌体为短直杆状，G—，该菌株还可分泌产生蛋白酶。SM21菌株，为芽孢杆菌属(feoz'"M5;.)，分离自镇江森林土壤，SM21在LB培养基上10h产生单菌落，培养24h菌落乳黄色，质地均一，圆形，干燥，中间隆起，表面粗糙，菌体为短直杆状，G'，该菌株还可分泌产生蛋白酶。AR156合剂采用常规细菌培养法获得将三种单菌株AR156、XY21、SM21用PDA培养液3(TC180rpm,约18小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的0D值，测定过程中以未接菌的培养液来调零。当有0D值不在0.11之间时将各菌继续培养，每隔3小时测一次，直到各0D值均在此范围内。当培养至0D值在0.50.8之间时，将种子菌液以l:100体积比加入PDA培养液中，30'C180rpm振荡培养2024小时，然后4000g离心lOmin，每1000ml培养液获得1316g湿菌，每克湿菌含4X10"10'5个菌体；取湿菌与菌体保藏液(公开专利号CN1358838，公开日2002年7月17日)按1g:40ml配成三种细菌单剂，再将三种细菌单剂按l:1:l混合均匀，即得复合生防菌剂，成品中活菌总浓度为lX109~lX1012cfU/ml，用于防治蔬菜土传病害。其中所用PDA培养液配制方法为用200克土豆削皮后切成小块放入水中，沸腾后至少煮20分钟以上，用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，PH值调至7.2-7.4，然后12rC15个大气压灭菌20分钟。应用方法温室试验中，培养基质(淮安市柴米河基质有限公司辣椒基质)中播种亨椒八号，立即将AR156合剂100ml稀释20倍浇于72孔穴盘基质中。分别于3日后浇青枯菌使每克基质含菌量为104cfu;出苗后浇辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液(105/ml)2m1/株播种21天浇南方根结线虫悬浮液，每株50条幼虫。播种8周后分别计算植株发病率、死亡率、根结线虫侵染率，根鲜重与地上部鲜重(随机io株的平均值)。田间试验将AR156合剂1000ml稀释40倍喷洒进500kg有机堆肥中，拌匀，堆放23天后施入辣椒田，翻地，起垄覆膜，移栽。实施效果(一)温室实验表明，AR156合剂(100ml/穴盘)在温室内对青枯病和辣椒疫病防效达90%以上，而且对根的促生作用明显，与对照相比鲜重增加162.18192%，地上部鲜重增加110.5131.8%。对根结线虫防效达75%，根鲜重和地上部鲜重分别增加189.3%和112.2%，对病原菌起到了很好的控制作用(表13)。(二)田间实验表明，AR156合剂(1000ml/亩)对多种土传病害复合侵染的田块起到了很好地抗病增产效果。两年两地的结果显示，在河北薬城对春季辣椒疫病和根结线虫防效分别达64%和85%，同时产量增加60%，在秋季辣椒上对两种病害防效为52%和71.5%,产量增加66.3%，明显优于化学农药的防效。在江苏淮阴，春季辣椒对青枯、疫病和根结线虫的防效分别是76%、65%和60%，产量增加54%;秋季对以上三种病害的防效分别为70%、75%和82%，防效稳定。产量平均增加85.9%，大大优于其他农药组合(表47)。表1.AR156复合菌剂对辣椒细菌性青枯病防治及促生作用温室实验处理防效(％)根鲜重(g)根鲜重增加(％)地上部鲜重(g)地上部增加(％)对照1*33.7±3.0854.670.552±0.05466.022.431±0.22444.19对照2*74.3±6.6700.333±0.04101.686±0.2840AR156+XY2121.88±3.8270.560.822±0.045147.323.424±0.217103.11SM21+XY2126.74±4.3064.020.610±0.09483.532.673±0.51158.56AR156+SM2119.79±2.0873.360.824±0.048147.823.683±0,471118.43AR15624.65±5.2466.820.790±0.114137.443.539±0.786109.92XY2138.54±3.8248.130.531±0.08159.702.454±0.44245.54SM2129.51±3.6560.280.565±0磨69.932.622±0.38155.52AR156mixture01000.972±0.227192.183.卯8±0.664131.81*对照1:用农用链霉素150ppm灌根.*对照2:清水处理表2.AR156复合菌剂对辣椒疫病防治及促生作用温室实验处理鍋率％)防效(%)根鲜重(g)根鲜重增加(％)地上部鲜重(g)地上部鲜重增加(％)对照1*27.8±2.5459.180.513±0.02152.532.519±0.35331.22对照2*68.1±5.4400.337±0.03701.920±0.2950AR156+XY2111.46±1.3383.160.816±0.069142.573.579±0扁86.44SM21+XY2122.57±3.0866.840.617±0.09783.212.682±0.47039.71AR156+SM2116.32±2.6376.020.793±0.048135.743.748±0.53595.25AR15619.8±3.2878.570.720±0.173113.973.667±0.24091.53XY2122.2±3.0067,350扁±0.01578.233.425±0.57978.43SM2136.8±4.6145.920.514±0.04652.822.440±0.32827.09AR156合剂01000.882±0.139162.184.042±0.576110.55*对照1:58%甲霜灵锰锌可湿性粉剂500倍--次浇灌，5天后喷施一次。对照2:清水表3.AR156复合菌剂对辣椒根结线虫防治及促生作用温室实验<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*对照l:阿维菌素50ppm灌根两次，间隔10天.对照2:清水对照**病害的发生按《植病研究方法》(中国农业出版社，1998，324页)分级统计.表42005年秋季AR156合剂及化学农药对河北藁城辣椒产量及土传病害防效的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表52006年春季AR156合剂及化学农药对河北藁城辣椒产量及土传病害防效的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表62005年秋季AR156合剂及化学农药对江苏淮安辣椒产量及土传病害防效的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表72006年春季AR156合剂及化学农药对江苏淮安辣椒产量及土传病害防效的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>数据用SAS统计软件在LSDtest(户=0.05)水平上检测差异显著性.所有处理都是4次重复，表中数据取4次重复的平均值和标准差权利要求1.一种防治多种蔬菜土传病害的AR156合剂，含三种细菌成分分别是菌株AR156，为芽孢杆菌(Bacillussp.)于2007年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.1929；菌株XY21为沙雷氏菌(Serratiasp.)，于2007年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.2059；菌株SM21属芽孢杆菌(Bacillussp.)，于2007年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.2058。2、权利要求1所述的一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂AR156合剂的制备方法，其特征在于，1)将权利要求1所述的三种菌株接种到PDA培养液中分别培养37。C180rpm，1620小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的0D值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；2)当培养至OD值在0.50.8之间时，将种子菌液以l:IOO体积比加入PDA培养液中，30°C180rpm振荡培养2024小时，然后4000g离心10min，每1000ml培养液获得1316g湿菌，每克湿菌含4X1(T10'5个菌体；3)取湿菌与菌体保藏液按lg:40ml配成三种细菌单剂，再将三种细菌单剂按l:1:l混合均匀，即得复合生防菌剂，成品中活菌总浓度为lX109lX1012cfU/ml。3、根据权利要求2所述的一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂AR156合剂的制备方法，其特征在于，所用PDA培养液配制方法为用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH值调至7.2-7.4，然后121。C灭菌20分钟。4、权利要求1-3之一所述一种防治多种蔬菜土传病害的复合生防菌剂AR156合剂在防治温室及大田蔬菜青枯病、疫病、和根结线虫等土传病害方面的应用。全文摘要一种防治蔬菜土传病害的生防复合菌剂AR156合剂，属于植病生防
技术领域：
。该菌剂由三种生防细菌组成，分别是AR156(Bacillussp.)、XY21(Serratiasp.)和SM21(Bacillussp.)。三种细菌分别在PDA培养液37℃180rpm振荡培养20～24小时，然后4000g离心10min，取湿菌与菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂，再按1∶1∶1比例混匀，成品中活菌总浓度为1×10<sup>9</sup>～1×10<sup>12</sup>cfu/ml。对茄科作物青枯病温室与田间防效分别为90％和70％以上，茄科作物疫病防效为65％以上，对蔬菜根结线虫病的防效为60～85％，增产可达50～200％，同时该菌剂还可以改善土壤板结现象。文档编号A01P5/00GK101273724SQ200810088388公开日2008年10月1日申请日期2008年4月3日优先权日2007年8月24日发明者刘红霞,李师默,郭坚华申请人:南京农业大学资产经营有限公司