专利名称：一种玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种玉米蛋白激酶编码基因 及其编码蛋白的应用。
背景技术：
干旱缺水、盐渍等逆境因子是限制我国北方广大地区农、林、牧业生 产的主要因素之一。近年来大量的研究表明，植物具有对逆境胁迫快速感 知和主动反应的能力，这种快速感知和主动反应能力的获得是通过一系列 逆境信息传递过程实现的。植物可以通过一系列的信息传递产生各种抗逆 的生理、生化反应，以渡过短暂的不利环境。蛋白激酶是植物逆境早期信 号转导途径中的重要元件。其中CIPK (Calcineurin B-like protein -Interacting Protein Kinase)是参与渗透胁迫、盐、低温、脱落酸(abscisic acid,ABA)和糖等信号转导途径的、植物所特有的一类蛋白激酶。拟南芥 AtCIPKl与AtCBLl和AtCBL9交替形成两种复合体，分别调控ABA不 依赖和ABA依赖的两种胁迫信号转导途径(The Plant Journal, 2006, 48: 857-872)。
AtCIPK24 (SOS2)与AtCBL4 (SOS3)结合后，激活位于质膜上的 Na+/H+反向运输器SOSl，在盐胁迫下，将胞内多余Na+运至胞外(Plant Physiol, 2002, 128:544-55)。 Ohta等(2003)发现(ProcNatl Acad Sci USA, 2003, 100:11771-11776)
SOS2通过其C端临近但独立于NAF结构域的37个氨基酸序列PPI 与2C类蛋白磷酸酶ABI2互作，而拟南芥abi2-l和abil-1幼苗耐盐性增 强，说明ABI2是SOS耐盐途径中的负调节因子，可能对SOS2的磷酸化底 物起去磷酸化作用，或者对被上游蛋白激酶磷酸化的SOS2起去磷酸化作 用。PPI序列在AtCIPKl5、 AtCIPK20、 AtCIPK8和AtCIPK3中是保守的， 而这些蛋白也都与ABI2或ABI1互作。Lee等(2007)的研究显示(Proc Natl Acad Sci USA, 2007， 104: 15959-15964)， 2C类蛋白磷酸酶AIP1与 CBL-CIPK激活的AKT1互作并抑制其活性，说明AIP1对CIPK激活的AKT1有去磷酸化作用。水稻中有20个OsCIPK基因受包括干旱、盐、低 温、渗透胁迫和ABA在内的至少一种胁迫的诱导。过量表达OsCIPK3、 OsCIPK12和OsCIPK15的水稻植株分别在耐寒、耐旱和耐盐性上有显著 提高(Plant Physiol. 2007, 144 :1416-1428)。
玉米中有关CBL/CIPK研究的报道并不多，最近，Wang等(2007) 在玉米中克隆得到了 ZmCSW基因，ZmC^Z4与拟南芥AC万丄4同源性很 高，过量表达ZmCBL4的拟南芥耐盐离子能力明显提高，这暗示CBL/CIPK 信号转导系统很可能也存在于玉米中(Plant Mol Biol, 2007,65:733-746)。 相对于拟南芥和水稻来讲，有关玉米蛋白激酶的研究报道较少，其原因可 能在于玉米基因组序列的复杂性。
发明内容
本发明提供一种受甘露醇(mannitol)、氯化钠(NaCl)和脱落酸(abscisic acid， ABA)诱导的玉米蛋白激酶编码基因ZmC7尸/2及其编码蛋白 ZmCIPK2的应用；该玉米蛋白激酶编码基因ZmC/i^T2在GenBank接受号 为EF158033。该基因能够提高植物的抗逆性；尤其是能够提高拟南芥在种 子萌发期和幼苗发育早期的抗旱性和抗盐性。
本发明的有益效果为
本发明中，ABA、 NaCl和甘露醇处理的玉米胚芽鞘中，所述的蛋白激 酶ZmCIPK2均被诱导表达。本发明所述的蛋白激酶ZmCIPK2是属于CIPK 类蛋白激酶，而CIPK类蛋白激酶是植物早期逆境响应的关键调控因子， 所以调控CIPK类蛋白激酶的表达能够调节植物抗逆性。所述的因此所述 的编码玉米蛋白激酶ZmCIPK2的基因ZmC/尸K2在植物抗逆领域，特别是 玉米的抗旱、抗盐领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。
图1:玉米胚芽鞘中ZmC/尸《2基因响应逆境胁迫的表达模式电泳图2: ZmC7尸《2基因植物表达载体构建过程流程图； 图3:转ZwC/P《2基因的拟南芥种子和对照在不同培养基中的发芽率 柱状图4:转ZmC/PK2基因的拟南芥种子发芽对ABA和渗透胁迫超敏感 的照片；
图5: ABA合成抑制剂对ZmC/尸/。转基因种子和对照在不同培养基中发芽的影响的照片；
图6:转ZmC/PX2基因的拟南芥幼苗生长对ABA、渗透胁迫和盐敏 感的的照片；
图7:转ZmC/PK2基因的拟南芥幼苗生长对ABA、渗透胁迫和盐敏 感柱状图。
具体实施方式
实施例l:材料处理
玉米(ZeamaysL.)品种京玉7号；购自北京市农林科学院玉米中心。 玉米材料处理
A. 消毒挑选饱满的玉米种子，用1%的次氯酸钠表面消毒5分钟， 蒸馏水冲洗5遍，最后在蒸馏水中浸泡12小时，使其充分吸水。
B. 发芽将所述的充分吸水的种子在28。 C，黑暗条件下发芽；具体 的操作为将所述的充分吸水种子播在铺有一层吸水棉的瓷盘中，上面再
覆盖两层湿的吸水纱布，黑暗条件下生长三天。
C. 胁迫处理将发芽的种子进行ABA、甘露醇(mannitol)和NaCl 胁迫处理；所述的处理中，ABA溶液的浓度为100 uM，甘露醇溶液的 浓度为600mM， NaCl溶液的浓度为250mM;处理的时间分别为2小时、 6小时、12小时、24小时、48小时；胁迫处理后的玉米作为试验组，剪 取主根及胚芽鞘做试验材料；采用未做胁迫处理的玉米幼苗作为对照组， 剪取主根及胚芽鞘做试验材料。
实施例2: Z附C7/^2基因的克隆 A.玉米mRNA的分离和纯化
a. 玉米主根和胚芽鞘的总RNA的提取
按照Invitrogen公司总RNA提取试剂盒(TRIzol Reagent)(货号 15596-026)的方法分别进行提取，得到玉米主根和胚芽鞘的总RNA。
b. 玉米主根和胚芽鞘的mRNA的分离纯化
按照Promega公司试剂盒(PolyAtract m脂A Isolation System III (with Magnetic Stand)货号Z5300)方法，将所述的玉米主根和胚芽鞘的总RNA 分别进行分离纯化处理，得到玉米主根和胚芽鞘的mRNA。 B. RT-PCR扩增玉米ZmC/P《2基因
a.玉米主根和胚芽鞘的第一链cDNA反转录将所述的玉米主根和胚芽鞘mRNA，分别按照按照Invitrogen公司的 SuperScript1M RNaseH— Reverse Transcriptase产品说明分另U进行反转录， 得到玉米主根和胚芽鞘的第一链cDNA。
b. ZmC/i^2基因的PCR扩增
分别以所述的玉米主根和胚芽鞘的第一链cDNA作为模板，进行 ZmC/尸K2基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物。
根据网站http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/中玉米达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST)信息和水稻的基因信息设计玉米的C7尸K2基因的保 守引物为
上游引物5，-GGATCCATGGAGAAGAAGCCGACC-3，； 下游引物5 ，-AGGCCTTGATGGCTGAACCACTGA-3 ，。 PCR反应体系的组成为
模板(约5ng): 1 pl，上游引物1 fil，下游引物l|il， lOXTaqbuffer : 5pl，lOXdNTP: 4|il ， Ex-Taq酶0.5 [il， ddH20: 38.5 (il。
PCR程序为
94 °C 3min
94 °C 45s 、
58°Clmin 「 35个循环
72 °C 2min
72 °C 7min。
将所述的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶，在1XTAE电泳缓冲液中进行 电泳。
c. 电泳结束后，用QIAGEN GEL EXTRACTION KIT (#28704)试剂盒 回收纯化所述的PCR扩增产物。
C. PCR扩增产物的检测
a.连接和转化将所述的回收纯化的PCR扩增产物连接在pGEM-T载 体上，并利用热击法转入大肠杆菌(￡.co/0 DH5a中；
C.提质粒筛选抗性菌落后将其进行扩大培养，按照《分子克隆》(第 三版)所述的碱裂解法小提质粒；
d. 酶切验证将得到的质粒利用限制性内切酶5^///进行酶切验证，检 测到分子量约为3700bp的大片段和分子量约为lOOObp的小片段，初步证明PCR产物为ZwC/尸《2基因；
e.测序将酶切验证正确的质粒进行测序，测序正确的质粒用于进一
步构建其他载体。
本实施例中，也可以将PCR扩增产物用QIAGEN GEL EXTRACTION KIT (#28704)试剂盒回收纯化后直接进行测序，测序正确的质粒用于进一 步构建其他载体。
本实施例中所使用的各种限制性内切酶、Ex-Taq DNA聚合酶、T4 连接酶均购自TaKaRa公司。
实施例3: ZwCW^T2基因的表达分析
A.本实施例中，利用RT-PCR的方法来分析ZmC7fX2基因在不同逆境 条件下的表达情况。试验的样品为实施例1中所述的试验组和对照组中的 玉米的胚芽鞘。
每个样品中，按照实施例2中所述的方法，提取5iig的总RNA并反 转录成第一链cDNA作为模板。
根据ZmC7P《2基因序列分析设计得到的引物为 上游弓l物5，-CGTCATCCTCTTCGTGCTCCTC-3' 下游弓l物5，- GGTGCTGCTGTCCTTGTGGTC -3' PCR反应体系(25pl体系)的包括
模板(约5 ng): 1 (il，上游引物0.4 )il，下游引物0.4|_il ， IX PCR reaction buffer, dNTP: 0.2mM， Ex-Taq酶1单位。
PCR程序为
94 °C 3min
94 °C 45s 、
58°C lmin^ 28个循环
72 °C lmin
72 °C 7min。
B .同时，分另lj以5 ， -CCATAAACGATGCCGA-3-CACCACCCATAGAA TCAAGA-3 ，作为上、下游引物来扩增玉米18S rRNA，扩增片段作为内参。PCR反应体系和程序如本实施例中所述。
C.将得到的PCR产物在iy。浓度的琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕后用 HigherPerformanceUltravioletTransilluminator(GDS-8000, GelDocumentation System, UVP, USA)对电泳条带亮度进行定量。目的条带与 18SrRNA条带的强度比代表了目的基因的相对表达水平。 D. ZmCIPK2受逆境诱导表达分析
玉米胚芽鞘中ZmC/尸《2基因响应逆境胁迫的表达模式见图1;
图1A表示用100 ABA处理，图IB表示用600 mM甘露醇处理， 图1C表示用250mM氯化钠处理；图1A、图1B、图1C中，泳道 l一5 表示处理时间，分别为0小时，2小时，6小时，12小时，24小时。
如图1所示，在ABA、 NaCl和甘露醇处理的玉米胚芽鞘中，ZwC/户』0均能 被诱导表达。在100 ABA处理下，随着诱导时间的延长，》wC/尸i:2的表达 量逐渐上升，到24小时时仍保持较高的转录水平(见图1A)。在600mM甘露 醇诱导时间达12小时，ZmC/Z^:2的表达量达到最高值，随后有所降低，但在24 小时时仍有表达(见图1B)。 250 mM NaCl处理2小时，ZwC7Pi:2即有明显表 达，12小时表达量升至最高，到24小时仍有较高的表达量(见图1C)。 本实施例中PCR反应及其检测所使用的仪器与实施例2中相同。
实施例4: Z柳C7/^2基因转化拟南芥及转基因植株检测
A.植物表达载体的构建
将ZmC/i^O基因构建在含有dHA序列的PUC18载体上，然后把含有 目的基因、dHA序列及CaMV35S启动子的片断构建在pGreen0029上，得 到植物表达载体；同时构建仅含35S启动子的pGreen0029作为对照。
ZwOW^基因植物表达载体构建过程参见图2。在ZmC7/^2 ORF两端 引入酶切位点Ba附///和&w/，以Baw///和酶切本实验室保存的克隆 载体pUC18，切除外源cDNA，同时酶切？€&产物5￡ 附///-2^^/尸^0-15^/， 回收，将基因与pUC18大片段连接，酶切验证连接正确，再以Xbal/EcoRI 酶切连接产物和pGREEN0029,回收，将35S-ZmCIPK2-DHA-NOS片段连 接入植物表达载体pGREEN0029，酶切验证连接正确并测序，酶切和测序 结果证实ZmC/尸尺2已正确连接入pGREEN0029，并且在PCR过程中， ZmC7户A:2序列没有发生碱基突变。测序正确的重组质粒转化农杆菌 GV3101，挑取能在筛选培养基上正常生长的GV3101单菌落,提取质粒，首 先进行PCR验证，选取两管扩增出阳性条带的质粒再一次转化大肠杆菌， 提取质粒，酶切验证正确，表明所述的植物表达载体已经转化进GV3101 中，可以用来进行下一步的拟南芥转化。B. 农杆菌介导的基因转化拟南芥植株及其转基因植株鉴定 将含有所述的植物表达载体的农杆菌GV3101转入拟南芥(^^6^0;^&
决a/Za"a, ecotype Colombia)中，进行转基因植株鉴定，鉴定的项目包括 抗性培养基初步筛选、PCR扩增进一步筛选阳性植株、West-blotting鉴定 阳性植株；最终从通过West-blotting鉴定得到阳性植株中选出条带清晰的 株系T3，收获其种子，进行实施例5和实施例6中的抗逆表型鉴定。可确 定所述的株系T3为转ZmC/PW基因植株。
本实施例中PCR反应及其检测所使用的仪器与实施例2中相同。 实施例5:转Z iC7i^O基因拟南芥的抗逆表型鉴定——种子萌发期 表型鉴定
A. 试验方法
a. 种子消毒将实施例4中所述的转基因的拟南芥和对照的纯合体种 子分别在70%酒精溶液中消毒2分钟，灭菌蒸馏水冲洗一次，再用11%次 氯酸钠溶液消毒12分钟，灭菌蒸馏水冲洗5-6次。
b. MS培养基平板和在MS培养基的基础上分别添加有200mM甘露 醇、500mM甘露醇、100mM氯化钠、150mM氯化钠、0.3 pMABA、 0.5 ^MABA、 1.0 ABA、 2.0 jiMABA和100pMABA的平板。
C. 播种和培养将对照和转基因种子点播在同一平板上，置4"C下层积 处理4天，然后移置无菌培养间，竖直放置平板，23°C， 16小时光照下生 长。
d. 发芽率统计当胚根出现时开始统计发芽率，每天计数，连续六天。
e. ABA合成抑制剂(norflurazon, NF):将ABA合成抑制剂norflurazon 加入MS培养基、含200mM甘露醇的MS培养基、含lOOmM氯化钠MS 培养基、含0.3 nMABA的MS培养基中，终浓度为100|iM，播种对照和 转基因种子于同一平板。
B. 结果分析
a.组成型表达ZmC//^2基因的拟南芥种子发芽对ABA和渗透胁迫超 敏感
图4中，图4A—图4D分别表示转基因拟南芥种子与对照种子在MS (A)、 MS+0.3 ^MABA (B)、 MS+100pM manntol (C)、 MS+100pMNaCl
(D)培养基上的发芽情况。转ZmC/PK2基因的拟南芥种子在MS培养基上发芽率和对照相比没有 明显差异，播种七天后发芽率均达到100%，子叶均完全展开，见图3和 图4A，对照为转35S空载体拟南芥种子。转ZmC/尸《2基因的拟南芥种子 在MS+0.3pM ABA培养基上发芽率与对照相比明显降低，播种七天后对 照发芽率为68%转基因种子发芽率为11%，见图3和图4B。转ZmC/尸《2 基因的拟南芥种子在MS+200pM mannitol培养基上发芽率与对照相比明 显降低，播种七天后对照发芽率达到96%，转基因种子发芽率为79%，见 图3和图4C。转ZmC7尸i:2基因的拟南芥种子在MS+100jiMNaCl培养基 上发芽率和野生型相比明显降低，播种七天后对照发芽率为82%转基因 种子发芽率为36%，见图3和图4D。
ABA作为一种植物激素能促进种子成熟和休眠，抑制种子萌发 (Finkelsteinet al， 2002)。转空载体的拟南芥种子在MS培养基上播种7 天后，发芽率达到100%，而在含0.3pMABA的MS上播种7天后，发芽 率仅达到68%,甘露醇和盐胁迫下，转空载体的拟南芥种子发芽也受到抑 制，甘露醇处理的发芽率虽然达到96%，但根和子叶的生长明显弱于未处 理的，盐处理的转空载体拟南芥种子发芽率降至82%。与转空载体拟南芥 相比，组成型表达ZmC/尸K2基因的拟南芥种子发芽对ABA和渗透胁迫更 敏感，受抑制程度更大，发芽率分别仅达到11%， 79%和36%。高渗透胁 迫引起植物体内ABA合成增力口(Leung et al,1998; Seo and Koshiba, 2002)， 因此认为高渗胁迫可能是通过ABA对种子萌发起抑制作用，也就是说可 能转ZmC7/^2基因种子内ABA合成作用更强或ABA信号转导活性更强。
为验证转ZmC7尸K2基因的拟南芥种子发芽对渗透胁迫的超敏感性是 依赖于ABA的，在MS培养基中加入了 ABA合成抑制剂norflurazon (NF)。
图5中，图5A—图5C分别表示转基因拟南芥种子与对照种子在 MS+100|iM NF (A)、 MS+0.3 (iM ABA +100, NF (B)、 MS+200|iM mannitol+lOOpMNF (C)培养基上的发芽情况。
试验结果显示，在MS+100inMNF培养基中，转ZmC/尸K2的拟南芥种 子发芽率与对照相比没有明显区别，播种5天后发芽率均达到100%(幼苗 失绿是ABA合成抑制剂norflurazon引起的)，见图3和图5A;在 MS+200^VI mannitol+100pM NF培养基中，播种5天后，对照发芽率达 100%，转基因拟南芥种子发芽率为89%，见图3，图5B;在MS+100iiiMNaCl+10(HiMNF培养基中，播种5天后，对照发芽率达100%，转基因拟南芥 种子发芽率为68%，见图3,图5C。
在抑制了 ABA合成时，转空载体的拟南芥种子在不同培养基中的发芽率5 天内均达到100%，受甘露醇和盐胁迫的转基因种子的发芽率也分别恢复 到89%和91%，这说明甘露醇和盐对拟南芥种子发芽的抑制作用是通过使 种子内ABA合成来实现的，与对照相比，高渗胁迫使转ZmC/尸尺2基因拟 南芥种子内ABA合成量更多，这说明所述的ZmC7尸《2基因对甘露醇和盐 胁迫诱导的拟南芥种子ABA合成途径起正调控作用。所以说，向拟南芥 中转入所述的ZmC/户i:2基因，能够提高拟南芥在种子萌发期的抗旱性和 抗盐性。
实施例6:转ZmC7WO基因拟南芥的抗逆表型鉴定——种子幼苗期表 型鉴定
A. 试验方法将在MS平板上正常发芽的子叶刚展平的生长一致的
幼苗在无菌条件下移至含有400mM甘露醇、150mM氯化钠和100pMABA 的MS平板上，置培养间，竖直放置平板，23°C， 16小时光照下生长。 一周后测量根长，计数真叶的叶数。
B. 试验结果转ZmC/i^2基因拟南芥种子发芽后的幼苗生长对ABA 和渗透胁迫超敏感。
将在MS培养基中正常发芽的子叶刚展开的大小一致的转基因和对照 幼苗移至MS和含100pMABA、 400pM mannitol、 150mMNaCl的MS培 养基中，继续培养10天后拍照。
图6中，图6A—图6D分别表示转基因拟南芥种子与对照种子在MS (A)、 MS+100|iiMABA (B)、 MS+400pM mannitol (C)、 MS+150mMNaCl 培养基上的幼苗的生长情况。
图7中，图7A表示转基因拟南芥幼苗与对照幼苗的平均根生长量；图 7B表示转基因拟南芥幼苗与对照幼苗的平均叶数。相对根生长量是胁迫培 养基中根生长量与MS中根生长量的比值，数据为三次重复的平均值和标 准误差。
在MS培养基中，转ZwC//^2基因的拟南芥幼苗生长和对照相比没 有明显差别。播种10天后拍照，见图6A。在MS+100nM ABA、 MS+400^iM mannitol和MS+150 mMNaCl的培养基中，转基因幼苗生长受抑制程度均大于对照，见图6B、图6C和图6D。在MS+100^iMABA培养基中，对照 平均相对根生长量为92%,平均叶片数8片；转基因幼苗平均相对根生长 量为50%，平均叶片数5片，见图7A和图7B。在MS+400nM mannitol 培养基中，对照平均相对根生长量为76%，平均叶片数6片；转基因幼苗 平均相对根生长量为53%，平均叶片数4.2片，见图7A和图7B。在MS+150 mMNaCl培养基中，对照平均相对根生长量为25,平均叶片数4.3片，转 基因幼苗平均相对根生长量为11%,平均叶片数3.3片，见图7A和图7B。 以上试验表明，转ZmC/PK2基因拟南芥种子发芽后的幼苗生长对ABA 和渗透胁迫仍表现敏感，ABA不仅抑制种子萌发而且抑制萌发后幼苗的早 期发育(Finkelsteinetal， 2002; Lopea-Molina et al, 2001)，与对照相比， ABA处理下的转ZmC/尸X2基因幼苗生长明显受到抑制，而甘露醇和盐胁 迫诱导植物体内ABA合成，所以转ZmC/Z^2基因拟南芥发芽后幼苗早期 发育阶段对甘露醇和盐的敏感性至少有一部分是依赖于ABA的，这说明 ZwC/尸/^对甘露醇和盐胁迫诱导的拟南芥幼苗早期发育中的ABA信号转 导起正向调控作用。所以说，向拟南芥中转入所述的ZmC/尸《2基因，能 够提高拟南芥在幼苗早期发育中的抗旱性和抗盐性。
脱落酸(abscisic acid, ABA)作为一种植物激素，几乎存在于所有高等 植物中，不仅在植物种子成熟和休眠、气孔运动以及基因表达调控中起重 要作用，而且在植物对逆境胁迫的反应中起重要的调节作用。ABA既是环 境胁迫信号的诱导产物，又是胁迫信号的传导者，通过ABA使环境信号 迅速级联放大。研究表明，ABA与干旱、高盐、低温、损伤、低氧、光照 以及病原体侵染等多种生物和非生物胁迫有关，是植物体响应逆境胁迫信 号并引起体内适应性调节反应和基因表达的重要因子。实施例5中和实施 例6中，转ZwC7/^2基因的拟南芥种子发芽和发芽后的幼苗生长对ABA、 甘露醇和氯化钠超敏感，ZmC/P《2对甘露醇和盐胁迫诱导的拟南芥种子 ABA合成途径起正调控作用，ZmC7P70对甘露醇和盐胁迫诱导的拟南芥 幼苗早期发育中的ABA信号转导起正向调控作用。所以说，向拟南芥中 转入所述的ZmC7尸尺2基因，能够提高拟南芥的抗旱性和抗盐性。
实施例1至实施例6中，玉米(Zea mays L.)京玉7号购自北京市农林 科学院玉米中心，拟南芥(Arabidopsis thaliana， ecotype Colombia)种子购自国际上保存拟南芥种质资源的机构(ABRC Arabidopsis Biological Resource Center) ， http:〃www.biosci.ohio-state.edu/pcmb/Facilities/abrc/abrchome.htm ， 大肠杆菌(E.coli)DH5 a 、质粒pUC18、pGreen0029、pGEM-T均购自Promega
公司；
实施例1至实施例6中，主要分子生物学试剂DNA凝胶回收试剂 盒购自杭州V-gene生物技术公司；DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、 Ex Taq酶、DNA Blunting Kit、 DNA Marker DL2000+15000购自宝生物大 连有限公司(TakaRa产品)；TRIzol试剂.No.05596-026)购自Invitrogen公 司；质粒pUC18、 pGreen0029、 pGEM-T均购自Promega公司。
实施例1至实施例6中，PCR引物由北京三博远志生物技术有限公司 合成；DNA测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
实施例1至实施例6中，所述的PCR反应使用PTC-100 Peltier Thermal Cycler基因扩增仪，购自MJ Research Inc公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使 用UVP Gel Documentation凝胶分析系统，购自基因公司；所述的琼脂糖 凝胶电泳使用DYCP-31DN电泳仪，购自北京六一仪器公司。
实施例1至实施例6中，所采用的PCR、酶切、连接、转化等基因工 程基本操作方法记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美)J.萨姆布鲁 克等著，科学出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理与技术》中 (王关林，方宏筠著，科学出版社,1998)。
权利要求
1.一种玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白的应用，其特征在于向拟南芥中转入该基因，能够提高拟南芥的抗逆性。
2. 根据权利要求1所述的玉米蛋白激酶编码基因ZmC/尸尺2及其编码 蛋白的应用，其特征在于向拟南芥中转入该基因，能够提高拟南芥的抗 旱性。
3. 根据权利要求1所述的玉米蛋白激酶编码基因ZmC7尸《2及其编码 蛋白的应用，其特征在于向拟南芥中转入该基因，能够提高拟南芥的抗 盐性。
4. 根据权利要求1或2或3所述的玉米蛋白激酶编码基因Z/nC/尸K2 及其编码蛋白的应用，其特征在于向拟南芥中转入该基因，能够提高拟 南芥在种子萌发期中的抗旱性。
5. 根据权利要求1或2或3所述的玉米蛋白激酶编码基因ZmC/尸K2 及其编码蛋白的应用，其特征在于向拟南芥中转入该基因，能够提高拟 南芥在种子萌发期中的抗盐性。
6. 根据权利要求1或2或3所述的玉米蛋白激酶编码基因ZmC/尸《2 及其编码蛋白的应用，其特征在于向拟南芥中转入该基因，能够提高拟 南芥在幼苗早期发育中的抗旱性。
7. 根据权利要求1或2或3所述的玉米蛋白激酶编码基因ZmC/尸K2 及其编码蛋白的应用，其特征在于向拟南芥中转入该基因，能够提高拟 南芥在幼苗早期发育中的抗盐性。
全文摘要
本发明提供一种受甘露醇(mannitol)、氯化钠(NaCl)和脱落酸(abscisicacid，ABA)诱导的玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2及其编码蛋白ZmCIPK2的应用；该玉米蛋白激酶编码基因ZmCIPK2在GenBank接受号为EF158033。该基因能够提高植物的抗逆性；尤其是能够提高拟南芥的抗盐性和抗旱性。所述的因此所述的编码玉米蛋白激酶ZmCIPK2的基因ZmCIPK2在植物抗逆领域，特别是玉米的抗旱、抗盐领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。
文档编号A01H1/00GK101407818SQ200810227599
公开日2009年4月15日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者吴忠义, 张秀海, 李春华, 梁宏霞, 王永勤, 黄丛林 申请人:北京市农林科学院