专利名称：：一种甘蓝型油菜双重不育系的选育方法
技术领域：
：本发明属于农作物杂种优势利用方法领域，涉及油菜雄性不育系的选育方法，特别是一种甘蓝型油菜"环境敏感细胞核+Nap细胞质"双重雄性不育系的选育方法。
背景技术：
：细胞质雄性不育(CMS，包括雄性不育三型说的"质一核互作型"雄性不育)是甘蓝型油菜杂种优势利用的主要方式。世界上发现较早、得到广泛研究的有Ogura、Polima、Nap三大CMS系统。OguraCMS在欧洲、北美应用很多，但其恢复系以及恢复基因受到专利保护。在中国广为应用的是Polima、陕2ACMS等，其遗传方式、恢保关系、育性表现等都具有Polima型CMS特征(杨光圣等，甘蓝型油菜细胞质雄性不育的遗传分类研究.中国农业科学1998(1):27-34)，育性不稳定，大多数保持系选育的不育系对低温敏感，前期花粉量大。为此，华中农业大学和西南农业大学提出了"细胞核不育十PolimaCMS"双重不育系思路(杨光圣等.作物学报，1997,23(2):144-149;李加纳，油菜细胞核+细胞质双重不育系选育初报.西南农业大学学报，1994，16(4):403-405)，但只能解决群体中50%的微粉株，没有彻底解决微粉问题。NapCMS又称Shiga—Thompson系统，加拿大、欧洲、日本、中国的很多甘蓝型油菜品种都具有Nap细胞质，例如Karat，Regent,ACElect,Amazon,Arctik，Cyclone,Defender,Ebony,Falcon,Korell，Pearl,Topas等，所以绝大多数正常品种可以恢复NapCMS的育性，目前仅发现波兰品种Bronowski、日本品禾中Isuzunatane、Muraskinatane、法国品禾中Brio、捷克品禾中Ceska、中国品种湘矮B等极少数品种可以保持NapCMS(ShigaT，BabaB.Cytoplasmicmalesterilityinrapeplan《5mss/ca加;wsL.).JapaneseJournalofBreeding.1971.Suppl，2:16-17;ThompsonKF.Cytoplasmicmalesterilityinoilseedrape.Heredity.1972，29:253-257;傅廷栋，杨光圣.油菜细胞质雄性不育系杂种.见杂交油菜的育种和利用(傅廷栋主编)，湖北科学技术出版社，1995，46-51)。NapCMS恢复基因和PolimaCMS恢复基因被定位在同一座位上(LiX-Q，JeanM，LandryB.S"BrownG.GRestorergenesfordifferentformsofBrassicacytoplasmicmalesterilitymaptoasinglenuclearlocusthatmodifiestranscriptsofseveralmitochondrialgenes.ProcNatlAcadSciUSA，1998,95:10032~10037)。NapCMS的优点是对Fi代杂交种没有明显的细胞质副效应，恢复系广泛，不育系在凉爽环境下比较稳定，但最大缺点是对高温环境敏感，平均气温高于20摄氏度，会有花粉产生(FanZ，StefanssonBR.InfluenceoftemperatureonsterilityoftwoCMSsystemsinrape.CanJPlantSci1986,66:221-227)，而世界上各个冬油菜和春油菜产区，在油菜开花期都会或长或短出现这样的天气，因此该不育系生产杂交种的风险很大，种子纯度难以保障，很难投入商业应用。目前在甘蓝型油菜中发现了温敏核不育或光温敏核不育，都表现为在低温及(或)短日照条件下雄性可育，在高温及(或)长日照条件下雄性不育，已经公开报道的分别是①湖南省农科院育成的湘91S(甘蓝型油菜温敏核不育系湘91S的选育，作物研究，1995年S1期；)、②贵州油料科学研究所育成的H90S(中国油料作物学报.2001(4):11-15)、③刘尊文等报道的N196S(江西农业大学学报.2006,28(5):654-656)、④于澄宇等报道的373S(中国农学通报.2007，(7):255-258)。温敏核不育、光敏核不育、光温敏核不育等都属于环境敏感细胞核雄性不育(VirmaniSSandIlyasAhmedM.2001.Environmentsensitivegeniemalesterility(EGMS)incrops.AdvancesinAgronomy72:139-195)，但从概念上来讲，环境敏感细胞核雄性不育概念更广泛，还包括对湿度或者其他复杂环境条件敏感的不育系。环境敏感细胞核雄性不育用于两系法杂交制种的优势是多为隐性基因控制，可以通过杂交回交，把不育基因转入到任何一个目标品种或自交系，选育新型不育系；其它品种一般都可用作恢复系，恢复源广，容易获得较高产量潜力杂交组合。其致命弱点是对气候条件的要求更为严格，可供选择的制种区不多，制种失败的风险更大。湖南省农科院研究人员用温敏不育系湘油91S保持PolimaCMS，育成了没有微粉的PolimaCMS新不育系"湘新A"、湘油66A(邬贤梦等，甘蓝型油菜无微量花粉细胞质雄性不育系湘油66A的选育.湖南农业大学学报，2006，32(4):347-351)，可见结合温敏细胞核不育和细胞质不育实践上是可行的。
发明内容为了克服环境敏感细胞核不育系与NapCMS的缺点，解决杂交油菜制种难题，本发明的目的在于，提出一种新的甘蓝型油菜双重不育系的选育方法，该方法将环境敏感细胞核不育基因导入到NapCMS的保持系和不育系，选育出"环境敏感核不育+Nap细胞质"双重不育系(代号EGMS+NapCMS)。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种甘蓝型油菜双重不育系的选育方法，其特征在于，按如下步骤实现步骤一，采用环境敏感核不育材料与NapCMS的保持系杂交，得到F,代，F,自交得到F2，F2自交得到F3;步骤二，在F2或F3分离世代选择育性随环境变化而变化的环境敏感不育株，作为父本与NapCMS测交；步骤三，淘汰不能保持NapCMS的环境敏感不育株，保留能保持NapCMS的环境敏感不育株，继续自交；步骤四，保留下来的环境敏感不育单株自交后代同时作为父本继续与上一代保持下来的NapCMS测交；步骤五，重复步骤三和步骤四，经过4个世代以上的连续自交兼测交，即可得到一种自身雄性育性对环境敏感的NapCMS保持系，其细胞核中含有环境敏感细胞核不育基因，但细胞核中不含NapCMS的恢复基因，而细胞质为正常可育细胞质；与此同步测交保持下来的NapCMS就是兼有环境敏感细胞核不育和Nap细胞质不育特征的双重不育系。上述方法选育的双重不育系可以用于杂交油菜制种。即将双重不育系作为母本，和可以恢复双重不育系育性的父本间隔种植，开花后由父本给母本授粉，收获母本上所结的种子，即为杂交种。本发明的方法将环境敏感核不育与细胞质不育结合，取得了良好的技术效果，选育出的双重不育系达到100%完全不育，花瓣平展，雄蕊白色无花粉，花期育性稳定。大部分正常品种可以恢复其育性，大大扩展了油菜杂种优势可利用的范围，减少了制种风险，能够提高杂交种制种纯度，并为提高杂交种产量提供了技术保障。图1是双重不育系选育过程示意图；以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。具体实施例方式由于环境敏感细胞核雄性不育的表达不依赖于细胞质，可以把不育基因导入任何品系以及CMS，作为选育"环境敏感细胞核+Nap细胞质"双重不育系的良好供体。本发明所述环境敏感核不育是指由隐性细胞核不育基因控制的雄性不育材料，其雄蕊的育性可随气温、光周期或其它环境因素变化而变化。目前国内发现的几种光温敏、温敏细胞核不育系均属于这一范围，均可以用作选育双重不育系的基因供体。本发明的甘蓝型油菜新型双重不育系的选育方法，经过如下步骤选育200810231885.0说明书第5/9页用环境敏感核不育材料作为父本与NapCMS的保持系(例如Bronowski、Isuzunatane等)杂交，F!自交得到F2，F2自交得到F3;在F2或F3分离世代选择不同的环境敏感不育株，作为父本与NapCMS测交，此时初步将环境敏感核不育基因导入NapCMS，但核不育基因不纯合，尚不能表现效应；淘汰不能保持NapCMS的环境敏感不育株，保留能保持NapCMS、而且农艺性状、品质优良的环境敏感不育株，继续自交纯化，同时每代作为父本继续与上一代保持下来的NapCMS单株测交，这一过程类似回交步骤，在逐步置换NapCMS细胞核的同时，反复将环境敏感核不育基因导入NapCMS，核不育基因纯合，可以表现出双重不育系统的效应；经过4个世代以上自交兼测交，就能得到一种NapCMS的特殊保持系，其细胞核中含有环境敏感细胞核不育基因但不含有NapCMS的恢复基因，而细胞质为正常可育细胞质；以这种特殊保持系作为父本反复测交保持下来的就是与父本细胞核基因相似，兼有不育细胞质的EGMS+NapCMS双重不育系。以后用双重不育系和其保持系杂交即可繁殖不育系。环境敏感不育株的鉴定繁殖方法是在低温短光湿润环境下(例如日均温<13摄氏度，日长〈12h，湿度>50。/0使其自交繁殖；而在高温长光干燥环境下(例如日均温〉15摄氏度，日长〉12.5h，湿度<50%)使其达到高度不育。由于双重不育系育性很稳定，远大于两种不育系统独立表达的效果，为保证双重不育系的保持系的自交结实能力强一些，在后一种环境下，对环境敏感核不育的选择标准可以降低，不需要完全不育，只要能达到高度不育(不育度〉90%)即可。EGMS+NapCMS在杂交油菜制种中的使用方法与一般CMS三系制种体系相似EGMS+NapCMS作为母本，和可以恢复双重不育系育性的父本间隔种植，开花后由父本给母本授粉，收获母本上所结的种子，即为杂交种。亲本繁殖方法也与一般CMS相似，双重不育系和其相应保持系杂交即可繁殖不育系，区别是保持系的自交繁殖需要在低温短光湿润环境下，这种条件可以在冬油菜区实现，也可以在人工控制环境下实现。环境敏感核不育、NapCMS是分别对低温和高温敏感的不育系统，单独应用于商业生产风险很大，而申请人提出的方法将环境敏感核不育与细胞质不育结合，取得了良好效果双重不育系花瓣平展，花丝很短，雄蕊低于花瓣水平面，花药白色，整个花期稳定无微粉。由于环境敏感细胞核不育基因和NapCMS基因的表达机理不同，从概率论的观点来说是独立事件，而又同在花药中表达，存在目标的交叉性，环境敏感细胞核不育对低温敏感而NapCMS对高温敏感，二者相互制约，因此使得育性受环境影响而恢复的可能性大幅度降低。除过稳定性外，应用这种双重不育系还具有如下积极效果(1)采用Nap不育细胞质，避免了单一应用Ogura或Polima不育细胞质的潜在危险；(2)绝大多数普通品种可以同时恢复环境敏感核不育和NapCMS，因此可直接作为双重不育系的恢复系，大大扩展了可利用的杂种优势范围；(3)对杂交种制种区域生态环境的要求宽松，不像温敏不育系等在只能在中国北方或春油菜区制种。双重不育系在杂交油菜制种中的使用方法以双重不育系作为母本，和可以恢复双重不育系育性的父本间隔种植，开花后由父本给母本授粉，收获母本上所结的种子，即为杂交种。以下是发明人给出的实施例，本发明不限于这些实施例。在选育过程中，NapCMS的保持系包括但不限于下列品种波兰品种Bronowski、日本品种Isuzunatane、Muraskinatane、法国品种Brio、捷克品种Ceska、中国品种湘矮B。实施例1:由Bronowski连续回交加拿大品种ACElect得到不育系，代号BronowskiNapCMS,表现为前期稳定不育，后期恢复为半不育。利用选育的一个环境敏感不育系373S(中国农学通报，2007，(7》255-258，该不育系已经在青海省农林科学院、扬州农科所、山西农科院等单位种植鉴定，并赠送相关单位开展育种应用研究)与品种中双9号杂交、Fi代再和中双9号回交，用BCF2代分离出的环境敏感不育株连续自交，得到环境敏感不育系Z9—EGMS，该环境敏感不育系Z9—EGMS的性状为低硫甙、低芥酸、抗倒伏，将环境敏感不育系Z9—EGMS在陕西杨凌等地秋播，花期育性表现与373S相同，初花期低温短日照条件下可育或半不育，随着4月份气温升高、日照加强，逐渐转变为完全不育。用Z9—EGMS作父本与NapCMS的保持系Bronowski(硫甙<30nmol/g)杂交，在F2代135株分离出9株环境敏感不育株，育性变化过程与Z9—EGMS相同。经品质分析，其中的3株环境敏感不育株性状为低芥酸(脂肪酸中芥酸含量<1%)、低硫甙(饼粕硫甙〈30nmol/g)，用这3株环境敏感不育株性测交BronowskiNapCMS，筛选出1个株系BZ9—3可以保持CMS，然后把环境敏感不育株连续自交，同时每代测交上代保持下来的CMS，达到与连续回交相似的效果，快速置换BronowskiNapCMS的细胞核。其实经过第二代测交后，向NapCMS中导入的环境敏感不育基因已经纯合，含有双重不育系统的群体育性已经很稳定，初步显示了双重不育系的良好效应。如此经过保持系连续自交以及同步测交保持NapCMS，最终选育成低芥酸、低硫甙、高含油量的EGMS+NapCMS双重不育系Z9—ECMS。选育过程如图l所示。该EGMS+NapCMS双重不育系整个花期稳定无微粉，经测交大多数品种可以恢复其育性，表明该双重不育系是一种实用型授粉控制系统。实施例2:采用从湖南省农科院作物研究所选育的温敏雄性不育两系杂交种湘杂油5号(品种审定编号国审油2003011，2002年湖南省农作物品种审定委员会审定，原代号9705，品种来源湘91Sx中双4号。中国油料作物学报.2005(3):74-76)后代中分离出一个环境敏感不育系Xiang5S。用环境敏感不育系Xiang5S作父本与NapCMS的保持系Bronowski(硫甙〈30pmol/g)杂交，在F2代178株分离出2株环境敏感不育株。用这2个环境敏感不育株作父本测交BronowskiNapCMS,1个株系可以部分保持CMS。从这个环境敏感不育株自交后代选11株，测交上代保持下来的CMS，其中2个保持效果很好，接近完全不育，初步显示了双重不育系的良好效应。用这两个株系再次保持3个世代以上，就得到育性稳定的双重不育系。实施例3:双重不育系与其它不育系育性比较试验在陕西杨凌地区正常秋播双重不育系Z9—ECMS、双重不育保持系BZ9、环境敏感核不育系Z9—EGMS以及BronowskiNapCMS进行实验。次年花期各随机选取10株，每株取不同部位IO枚新鲜花朵，挤压花药使花粉释放出来，用醋酸洋红染色，在显微镜下统计有活力的花粉(形状椭圆、外形完整、能够染成红色)百分率。另选10株套袋自交，计算分别相对于正常品种中双9号及Bronowski的自交结实率，估算整个花期的雄性育性。结果表明双重不育系育性Z9—ECMS很稳定，在开花各个时期均没有可育花粉，不能自交结实，不育度远远高于其它3个材料。将恢复系YC2的花粉给每材料人工授粉50朵花，最终结实率都很好，实验结果见表1，表明双重不育系Z9—ECMS的雌蕊结实性能正常。表1.双重不育系与其它不育系育性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1.一种甘蓝型油菜双重不育系的选育方法，其特征在于，按如下杂交改良步骤实现步骤一，采用环境敏感核不育材料与NapCMS的保持系杂交，得到F1代，F1自交得到F2，F2自交得到F3；步骤二，在F2或F3分离世代选择育性随环境变化而变化的环境敏感不育株，作为父本与NapCMS测交；步骤三，淘汰不能保持NapCMS的环境敏感不育株，保留能保持NapCMS的环境敏感不育株，继续自交；步骤四，保留下来的环境敏感不育单株自交后代同时作为父本继续与上一代保持下来的NapCMS测交；步骤五，重复步骤三和步骤四，经过4个世代以上的连续自交兼测交，得到一种自身雄性育性对环境敏感的NapCMS保持系，其细胞核中含有环境敏感细胞核不育基因，但细胞核中不含NapCMS的恢复基因，而细胞质为正常可育细胞质；与此同步测交保持下来的NapCMS就是兼有环境敏感细胞核不育和Nap细胞质不育特征的双重不育系。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的NapCMS的保持系包括波兰品种Bronowski、曰本品种Isuzunatane、Muraskinatane、法国品禾中Brio、捷克品种Ceska或中国品种湘矮B。3.权利要求1所述的甘蓝型油菜双重不育系的选育方法在杂交油菜制种中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将权利要求l选育的双重不育系作为母本，和可以恢复双重不育系育性的父本间隔种植，开花后由父本给母本授粉，收获母本上所结的种子，即为杂交种。全文摘要本发明公开了一种新型甘蓝型油菜双重不育系的选育方法，该方法采用环境敏感核不育材料与NapCMS的保持系杂交，后代选择环境敏感核不育株测交保持NapCMS，把环境敏感核不育基因导入到NapCMS，选育出的双重不育系达到100％完全不育，花瓣平展，雄蕊白色无花粉，花期育性稳定。大部分正常品种可以恢复其育性，大大扩展了油菜杂种优势可利用的范围，减少了制种风险；能够提高杂交种制种纯度，并为提高杂交种产量提供了技术保障。文档编号A01H1/04GK101390493SQ20081023188公开日2009年3月25日申请日期2008年10月24日优先权日2008年10月24日发明者于澄宇,胡胜武申请人:西北农林科技大学