专利名称：：灵芝液体发酵液制备含灵芝活性成分的饲料和饲料添加剂的方法
技术领域：
：木发明涉及一种利用灵芝液体发酵液制备含灵芝活性成分饲料和饲料添加剂的方法，属于生物发酵与饲料领域。
背景技术：
：灵芝(Ga"ode/"wa/M"Wwm(LeyssexFr.)Karst.)是中国传统的珍稀药用真菌，属担子菌纲。儿千年来，灵芝由于其优良的疗效而被誉为"仙草"。现代科技研究结果表明灵芝的主要活性成分为灵芝多糖和灵芝酸。灵芝多糖是一大类以(3-(1，3)和|3-(1，4)键连接而成的多糖或杂多糖类大分子物质，是一种重要的免疫增强剂，可显著激活自身免疫系统，同时它还具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射以及改善动物生产性能等一系列生物活性。灵芝酸为一类三萜类化合物，研究表明灵芝酸口T以抑制7种致病菌(如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌、痢疾志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、伤寒沙门氏菌)的生长，维持动物肠道的健康；它与灵芝多糖同时使用，对灵芝多糖具有增效作用。灵芝的生产目前主要采用液体发酵和固体栽培两种方式。采用液体发酵方式，在发酵过程中，一部分多糖和灵芝酸直接分泌于发酵液中，形成胞外多糖和胞外灵芝酸；而灵芝菌丝体内则存在着胞内多糖和胞内灵芝酸，需要先进行破壁处理后才能进行进一步的提取。研究表明灵芝液体发酵获得的胞内、胞外的灵芝活性物质均有相类似的活性。采用固体栽培方式，其多糖和灵芝酸成分均存在于胞内，同样需要先进行破壁处理后才能进行进一步的提取。饲料添加剂在畜禽养殖过程中提高动物免疫力、加速生长、提高饲料转化率、降低饲养成本等方面起着不可或缺的作用。随着人们食品安全意识的提高和健康意识的增强，以及畜禽产品的国际市场化步伐的进一步加快，发展无公害畜牧业，生产绿色畜禽产品，增强我国畜禽产品的市场竞争力已经成为我国畜牧产业的首要任务。而研究开发高效无公害的绿色饲料添加剂则成为本研究领域的当务之急。绿色饲料添加剂从广义上讲是指无污染、无残留、抗疾病、促生长的天然添加剂，国外在30多年前已着手相关的研究与开发，而国内只在近些年才启动。目前，科学工作者已经研究开发了中草药制剂、酶制剂、微生物制剂、酸化剂、防霉剂、益生元或化学益生素等绿色饲料添加剂。但这些添加剂都存在着下述一种或几种不足之处，如热稳定性差，容易失活，添加比例偏大，成本高，资源有限等。由于灵芝所含活性物质具有高效、无毒、提高免疫力、抗菌抗病毒、无残留等特点，符合绿色饲料及绿色养殖的要求，是一种全新的天然绿色饲料添加剂。目前，己有少量关于灵芝制备饲料添加剂的报道，有学者将固体栽培的灵芝子实体或/和菌丝体直接烘干粉碎制备饲料添加剂，也有学者将固体栽培的灵芝子实体或/和菌丝体通过进一步提取灵芝多糖，将灵芝多糖制备伺料添加剂。但是采用固体栽培的方式存在着生物周期长，由于培养基的不均一性而导致其生物活性成分的含量波动从而影响饲料添加剂质量等缺点；而a如将灵芝子实体或/和菌丝体直接烘干粉碎制备饲料添加剂，其有效成分灵芝多糖和灵芝酸依旧在胞内，很难被动物充分吸收消化，达不到预期效果；而从灵芝子实体或/和菌丝体中获取灵芝多糖进一步制备饲料添加剂，需要提取、浓縮、醇沉、固液分离等更为复杂的提取步骤，生产成本大大提高。而专利ZL200410042719.8提供了一种糖肽复合物免疫强化饲料添加剂的制备方法，其主要成分为灵芝或/和云芝的发酵液，经过进一步后加工后分别得到四种剂型的饲料添加剂即结晶精制品、吸附粉剂、液剂、菌丝体粉剂，其中前三种是通过液体发酵液制备获得，第四种是通过液体菌种固体栽培的方式获得菌丝体后进一步加工制备获得。该专利在一定程度上克服了固体栽培方式获得的灵芝子实体或菌丝体制备饲料添加剂的不足。但是，该方法在灵芝发酵液的处理上需要较多的步骤(如制备结晶精制品、吸附粉剂过程)，或者不能完全充分利用灵芝发酵液中所有的有效成分(如制备结晶精制品和液剂过程)。
发明内容本发明的目的在于针对上述绿色饲料添加剂的一些不足，提供了一种成本低、步骤少、灵芝发酵液有效成份完全充分利用的含灵芝活性成分的饲料和饲料添加剂的方法。实现本发明的目的是通过以下步骤来实现的步骤一灵芝发酵液的固液分离采用液体发酵方式，将发酵结束的灵芝发酵液在5000转每分钟的条件下离心分离，得到灵芝发酵上清液和灵芝菌渣。步骤二含灵芝活性成分饲料的制备采用后喷涂工艺将步骤一所获得的灵芝发酵上清液与词料混合，制备含灵芝活性成分的饲料，添加比例为每公斤饲料添加0.51.5毫升灵芝发酵上清液。所述饲料主要为禽类动物饲料，所述的后喷涂工艺可以采用压力喷涂工艺，其操作条件为喷雾压力0.20.5MPa，物料温度2040'C，进料速度10mL/s;也可以采用真空喷涂工艺，其操作条件为真空度0.020.04MPa，泻压时间80120s，液体温度3050°C。步骤三灵芝菌渣二次发酵制备含灵芝活性成分的饲料添加剂将步骤一所获得的灵芝菌渣为基础组成二次发酵的培养基，接入乳酸菌种，接种量为5%8%(体积质量比)，在304(TC条件下发酵2448小时，发酵结束后可以按本领域常规方法进行干燥。本发明所述的二次发酵培养基的组成为灵芝菌渣、玉米粉、麸皮，其中玉米粉和麸皮添加比例为1:1，将灵芝菌渣和一定量的玉米粉、麸皮混合后，使得二次发酵培养基中所含水份控制在60%65%(质量百分比)；将培养基加热至10(TC，并保持40min;冷却至6(TC，按培养基中每克玉米粉添加100个国际单位的量在培养基中加入糖化酶并混合均匀；继续冷却至4(TC以下即可接入乳酸菌屮发酵。本发明所述的乳酸菌种为常用的嗜酸乳杆菌，例如可以是购自中国普通微生物齒种保藏管理中心(CGMCC)的CGMCCNo.1.1854。乳酸种子的制备采用本领域常用的技术方法。本发明所述的灵芝发酵液的制备可以采用本领域常用的制备方法。如灵芝菌可以是购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)的CGMCCNo.5.535;灵芝发酵液的制备可以采用如下过程a、斜面培养将灵芝菌种接种于斜面培养基上，在25t:下培养至菌丝体长满斜面。所述的斜面培养基的具体制备方法为将马铃薯去皮后切成小片状或小块状，称取200克加入500毫升水中煮沸40分钟后用4层纱布过滤，在滤汁中加入20克葡萄糖，然后加水定容至1000毫升，再加入20克琼脂并加热，待琼脂完全溶解后分装，灭菌，备用。b、种子培养将斜面长好的菌种接入种子培养基中，摇床转速150转每分钟，25。C培养7天。所述种子培养基为(单位为克每升)玉米粉20，蔗糖20，麸皮15，磷酸二氢钾0.75，七水硫酸镁0.5，起始pH为自然pH。c、液体发酵培养将获得的液体种子按10%(体积百分比)的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中，28'C培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率120转每分钟，通风量1:0.5v/v/m，培养3天。所述发酵培养基为(单位为克每升)玉米粉22，蔗糖18，麸皮IO，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁l.O，起始pH为自然pH。本发明所提供的含灵芝活性成分饲料主要可以作为禽类动物饲料使用，使用该饲料能够达到促进动物的生长速度，增加免疫力和抗病能力，降低料肉比的效果。本发明所提供的含灵芝活性成分饲料添加剂主要可以作为禽类动物饲料的添加剂使用，按干重计，每公斤饲料按0.5%。2%。(质量百分比)的比例添加该饲料添加剂，可以促进动物的生长速度，刺激免疫系统发育，增加免疫力和抗病能力，降低料肉比的效果。本发明的优点在于-1)本发明提供的含灵芝活性成分的饲料及饲料添加剂含有丰富的灵芝多糖和灵芝酸，具有调剂免疫系统，抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射等广泛的生理活性，可以大大提高免疫抗病能力，维持动物肠道的健康，提高动物的生产性能和市场效率。2)本发明采用后喷涂工艺将灵芝发酵液与词料混合，可以大大增加饲料混合的均匀度，大大减少因膨化、膨胀、制粒等程序造成有效成分的损失，充分保证饲料的品质。3)本发明将灵芝菌渣进行二次发酵，其好处在于通过"10(TC，保持40min"的处理以及后继的乳酸菌发酵过程，使得灵芝菌丝体自溶，胞内的灵芝多糖和灵芝酸充分释放于饲料添加剂中，而在二次发酵过程中灵芝活性成分的总损失仅在3%以下，能够被动物很好的充分吸收消化；4)同时，在本发明将灵芝菌渣进行二次发酵的过程中，通过乳酸菌发酵使饲料添加剂中增加乳酸和肽类的含量，每克饲料添加剂中乳酸菌数量达到2亿以上(按干物质计)，使其在具备灵芝活性成分的基础上又含有大量益生菌，从而大大提高了该添加剂的总体功效。5)本发明所提供的方法将灵芝发酵液全部充分利用，无废水废渣排除，歩骤简单、成本低廉，易于大规模产业化。具体实施例方式在下面所述的所有具体实施方式中，灵芝多糖的测定采用苯酚-硫酸测定，该方法在《糖复合物生化研究技术(第二版)》(张惟杰编著，浙江大学出版社，1999年)以及其它众多的著作和国内外学术期刊论文中均有详细的表述，在这里不再详述。灵芝酸的测定方法按照钟建江等所描述的紫外分光光度法测定(EffectofinitialpHonproductionofganodericacidandpolysaccharidebysubmergedfermentationofGawcxierma/wc/dwm.ProcessBiochemistry.2002,37:769-774.)。在下述的具体实施方式中，所用原料玉米粉和麸皮的含水量均为12%(质量百分比)；糖化酶由无锡赛德生物技术有限公司提供，糖化酶的活力为每毫升10万个国际单位，在使用前用纯净水将其稀释成每毫升1000个国际单位的水平，在4"C条件下保存使用，其目的在于使糖化酶与培养基物质充分混合均匀。根据本发明所述的发酵培养工艺，结合本领域的基本知识可以进一步根据生产需要扩大发酵规模。在扩大发酵规模的过程中，可以根据实际需要来确定将糖化酶直接使用或稀释后使用。实施例1灵芝发酵液制备及发酵液的离心分离(1)斜面培养将灵芝菌种CGMCCNo.5.535接种于斜面培养基上，在25。C下培养至菌丝体长满斜面，所述的斜面培养基的具体制备方法为将马铃6薯去皮后切成小片状或小块状，称取200克加入500毫升水中煮沸40分钟后用4层纱布过滤，在滤汁中加入20克葡萄糖，然后加水定容至IOOO毫升，再加入20克琼脂并加热，待琼脂完全溶解后分装，灭菌，备用。(2)种子培养将斜面长好的菌种接入种子培养基中，种子培养基的体积为100毫升，装入500毫升的三角瓶中，共21瓶。种子培养基为(单位为克每升)玉米粉20，蔗糖20，麸皮15，磷酸二氢钾0.75，七水硫酸镁0.5，起始pH为自然pH;培养条件为摇床转速150转每分钟，25T培养7天。(3)液体发酵培养将培养好的种子接入30升发酵罐中，接种量为2.1升，发酵液总体积21升。发酵培养基为(单位为克每升)玉米粉22，蔗糖18，麸皮IO，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁l.O，起始pH为自然pH。28。C培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率120转每分钟，通风量为每分钟10.5升，培养3天。最终得到20升发酵液。(4)将灵芝发酵液在5000转每分钟的条件下离心分离，最终得到灵芝发酵上清液16.5升，其中每升发酵上清液中含灵芝多糖3.0克，灵芝酸352.22毫克；得到灵芝菌渣3.6公斤，含水量77.2%，其中每公斤灵芝菌渣中(按干重计)含灵芝多糖50.4克，灵芝酸13.66克。实施例2含灵芝活性成份词料的制备按每公斤词料添加l.O毫升灵芝发酵上清液的比例，采用压力喷涂工艺将灵芝发酵上清液喷涂于饲料颗粒表面，其操作条件为喷雾压力0.2MPa，物料温度20。C，进料速度10mL/s。喷涂指标饲料混合均匀度0.06%，颗粒硬度降低5%，灵芝活性成分损失率5.2%。所述的词料为典型的豆粕-玉米型鸡饲料，其营养成分(质量百分比)粗蛋白质19%，粗脂肪3.0%，粗纤维6.0%,粗灰分8.0%，钙1.20%，总磷0.60%,食盐0.6%;代谢能为每克3.0千卡。实施例3含灵芝活性成份饲料的制备按每公斤饲料添加0.8毫升灵芝发酵上清液的比例，釆用真空喷涂工艺将灵芝发酵上清液喷涂于饲料颗粒表面，其操作条件为真空度0.02MPa，泻压时间80s,液体温度30°C。喷涂指标饲料混合均匀度0.03%，颗粒硬度降低3%，灵芝活性成分损失率3.8%。所述的饲料为典型的玉米-豆粕-杂粕型鸭饲料，其营养成分(质量百分比)粗蛋白质15%，粗脂肪3.0%，粗纤维6.0%，粗灰分8.0%，钙0.91%，总磷0.68%，食盐0.3%;代谢能为每克2.8千卡。实施例4含灵芝活性成份饲料的制备按每公斤饲料添加1.5毫升灵芝发酵上清液的比例，采用压力喷涂工艺将灵芝发酵上清液喷涂于饲料颗粒表面，其操作条件为喷雾压力0.5MPa，物料温度4(TC，进料速度10mL/s。喷涂指标饲料混合均匀度0.07%，颗粒硬度降低4%，灵芝活性成分损失率5.8%。所述的饲料同实施例3.7实施例5含灵芝活性成份饲料的制备按每公斤词料添加1.5毫升灵芝发酵上清液的比例，采用真空喷涂工艺将灵芝发酵液喷涂于饲料颗粒表面，其操作条件为真空度0.04MPa，泻压时间120s，液体温度50°C。喷涂指标饲料混合均匀度0.04%，颗粒硬度降低3%，灵芝活性成分损失率3.5%。所述的饲料同实施例2。实施例6含灵芝活性成份饲料的制备按每公斤词料添加0.5毫升灵芝发酵上清液的比例，采用压力喷涂工艺将灵芝发酵上清液喷涂于饲料颗粒表面，其操作条件为喷雾压力0.35MPa，物料温度3(TC，进料速度10ml/s。喷涂指标喷涂指标饲料混合均匀度0.06%，颗粒硬度降低5%，灵芝活性成分损失率4.6%。所述的词料同实施例2.实施例7含灵芝活性成份伺料的制备按每公斤饲料添加0.5毫升灵芝发酵上清液的比例，采用真空喷涂工艺将灵芝发酵液喷涂于饲料颗粒表面，其操作条件为真空度0.03MPa，泻压时间100s，液体温度40°C。喷涂指标喷涂指标饲料混合均匀度0.03%，颗粒硬度降低4%，灵芝活性成分损失率2.9%。所述的饲料同实施例3。实施例8含灵芝活性成份饲料添加剂的制备在1公斤灵芝菌渣中加入179.16克玉米粉和179.16克麸皮，并混合均匀，培养基中的含水量为60%(质量百分比)；将培养基加热至IO(TC，并保持40min;冷却至6(TC，加入糖化酶稀释17.9毫升，并混合均匀；当温度降低到3(TC，接入乳酸菌种108.7毫升，在3(TC条件下发酵48小时结束。其中，乳酸菌种子液的制备如下(1)斜面培养将乳酸菌种CGMCCNo.1.1854接种于斜面培养基上，在37'C下培养至菌体长满斜面，所述的斜面培养基为(单位为克每升)酵母膏5，蛋白胨7.5，葡萄糖10，磷酸二氢钾4，，吐温800.5，七水硫酸镁1，琼脂粉15，pH6.5，12rC灭菌20分钟。(2)种子培养将斜面长好的菌种接入种子培养基中，种子培养基的体积为100毫升，装入250毫升的三角瓶中，共两瓶。37。C恒温静置培养18小时，种子培养基为(单位为克每升)葡萄糖10，蛋白胨5，七水硫酸镁0.5，磷酸二氢钾l，氯化钠5，pH5.5，12rC灭菌20分钟。实施例9含灵芝活性成份饲料添加剂的制备在1公斤灵芝菌渣中加入115.09克玉米粉和115.09克麸皮，并混合均匀，培养基中的含水量为65%(质量百分比)；将培养基加热至IO(TC，并保持40min;冷却至6(TC，加入糖化酶稀释11.5毫升，并混合均匀；当温度降低到35。C，接入乳酸菌种61.5毫升，在35"C条件下发酵38小时。其中，乳酸菌种子液的制备同实施例8。实施例10含灵芝活性成份饲料添加剂的制备在1公斤灵芝菌渣中加入135克玉米粉和135克麸皮，并混合均匀，培养基中的含水量为63.3%(质量百分比)；将培养基加热至10(TC，并保持40min;冷却至6(TC，加入糖化酶稀释13.5毫升，并混合均匀；当温度降低到35。C，接入乳酸菌种88.9毫升，在32"C条件下发酵42小时。其中，乳酸菌种子液的制备同实施例8。实施例11含灵芝活性成份词料添加剂的制备在1公斤灵芝菌渣屮加入150克玉米粉和150克麸皮，并混合均匀，培养基中的含水量为62.1%(质量百分比)；将培养基加热至IO(TC，并保持40min;冷却至60。C，加入糖化酶稀释15毫升，并混合均匀；当温度降低到4(TC，接入乳酸菌种78毫升，在37。C条件下发酵32小时。其中，乳酸菌种子液的制备同实施例8。实施例12含灵芝活性成份饲料添加剂的制备在1公斤灵芝菌渣中加入120克玉米粉和120克麸皮，并混合均匀，培养基中的含水量为64.6%(质量百分比)；将培养基加热至IO(TC，并保持40min;冷却至60'C，加入糖化酶稀释12毫升，并混合均匀；当温度降低到40'C，接入乳酸菌种99.2毫升，在40'C条件下发酵24小时。其中，乳酸菌种子液的制备同实施例8。实施例13含灵芝活性成份饲料添加剂的制备在1公斤灵芝菌渣中加入165克玉米粉和165克麸皮，并混合均匀，培养基中的含水量为61%(质量百分比)；将培养基加热至IO(TC，并保持40min;冷却至6(TC，加入糖化酶稀释16.5毫升，并混合均匀；当温度降低到4(TC，接入乳酸菌种99.7毫升，在35"C条件下发酵38小时。其中，乳酸菌种子液的制备同实施例8。实施例14喂养试验采用实施例2获得的词料进行鸡饲养试验，共设两个平行的饲养组和1个对照组(所用词料为实施例2中不含灵芝发酵液的饲料)，饲养45天后，具有较明显的效果(具体如下表)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例15喂养试验将实施例8获得的饲料添加剂添加入鸭基础饲料中，鸭基础饲料同实施例3中典M的玉米-Q粕-杂粕刑鸭饲料。共设两个平行的词养组和1个对照组(不添加该词料添加剂)，其中饲料添加剂在小鸭饲养阶段(10天)的添加暈为0.596。；在大鸭饲养阶段(20天)的添加量为2.0%。。饲养30天后，使用该饲料添加剂后，具有较明显的效果(具体如下表)。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以上己详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。权利要求1、一种利用灵芝液体发酵液制备含灵芝活性成分的饲料和饲料添加剂的方法，其特征在于通过以下步骤实现a、灵芝液体发酵获得的发酵液在5000转每分钟的条件下离心分离获得灵芝发酵上清液和灵芝菌渣；b、按照每公斤饲料添加0.5～1.5毫升的比例，采用后喷涂工艺将灵芝发酵上清液与饲料混合，制得含灵芝活性成分的饲料；c、将灵芝菌渣进行二次发酵制备成含灵芝活性成分的饲料添加剂，二次发酵的培养基组成为灵芝菌渣、玉米粉和麸皮，玉米粉和麸皮添加比例为1∶1；灵芝菌渣和玉米粉、麸皮混合后，将二次发酵培养基中所含水份控制在60％～65％；发酵条件为将培养基加热至100℃，并保持40min；冷却至60℃，按培养基中每克玉米粉添加100个国际单位的量在培养基中加入糖化酶并混合均匀；继续冷却至40℃以下即可接入乳酸菌种发酵，接入体积质量比5％～8％的乳酸菌种，在30～40℃条件下发酵24～48小时，发酵结束后干燥，制得含灵芝活性成分的饲料添加剂。2、根据权利要求1所述的含灵芝活性成分饲料的制备方法，其特征在于所述的后喷涂工艺采用压力喷涂工艺，其操作条件为喷雾压力0.20.5MPa，物料温度204(TC，进料速度10mL/s;或采用真空喷涂工艺，其操作条件为真空度0.020.04MPa，泻压时间80120s，液体温度3050。C。3、按照权利要求1或2所述方法制备的含灵芝活性成分伺料的应用，其特征在于用作禽类动物的饲料。4、按照权利要求l所述的含灵芝活性成分饲料添加剂的应用，其特征在于用作禽类动物饲料的添加剂，每公斤饲料按质量百分比0.5%。2%。的比例添加该饲料添加剂。全文摘要灵芝液体发酵液制备含灵芝活性成分的饲料和饲料添加剂的方法，属于生物发酵与饲料领域。本发明步骤为a.灵芝液体发酵液在5000转每分钟离心分离获得灵芝发酵上清液和灵芝菌渣；b.按照每公斤饲料添加0.5～1.5毫升的比例，采用后喷涂工艺将灵芝发酵上清液与饲料混合，制备含灵芝活性成分的饲料；c.将灵芝菌渣进行二次发酵制备成含灵芝活性成分的饲料添加剂。本发明将灵芝发酵液全部充分利用，无废水废渣排放，步骤简单、成本低廉，易于大规模产业化。产品中含有丰富的灵芝多糖和灵芝酸，具有调剂免疫系统，抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射等广泛的生理活性，可以大大提高免疫抗病能力，维持动物肠道的健康，提高动物的生产性能和市场效率。文档编号A23K1/16GK101455274SQ20081024328公开日2009年6月17日申请日期2008年12月29日优先权日2008年12月29日发明者丁重阳,梁张,王玉红,石贵阳,章克昌申请人:江南大学