专利名称：一种小分子(＜15kd)发酵饲用多肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵技术领域，以豆粕、棉粕和麸皮为原料，利用微生物发酵 技术有效去除豆粕和棉粕中的主要抗营养因子，同时得到富含凝结芽孢杆菌的优质发酵 豆粕，尤其是一种固态发酵的制备分子量低于15道尔顿(KD)的饲用植物性多肽的工 艺。
背景技术：
近年来，进口优质鱼粉、乳清粉价格大幅攀升，给饲料加工企业的生产带来空 前的压力，也给生物发酵饼粕产品带来空前的发展机遇。开发进口优质动物蛋白(如鱼 粉、血浆蛋白、肠膜蛋白等)替代产品，是实现饲料工业与养殖业的可持续发展，保持 乳仔猪养殖户赢利能力的重要举措发酵饼粕指是通过现代生物发酵技术对原料豆粕、棉粕、菜子粕等进行发酵处 理后的产物。发酵过程中可产生蛋白酶、非淀粉多糖酶等多种酶活，消除抗营养因子， 消解大豆抗原蛋白实现大豆生物脱敏，降解转化有毒游离棉酚，把大分子量的饼粕蛋白 质分解为多肽、寡肽、甚至小肽，从而增加水溶性，提高消化率，利于动物消化吸收。 纤维类物质分解为糖，部分糖被转化为乳酸，并产生大量有益微生物，使饼粕转化成高 营养价值的功能性饲料。本发明技术主要针对上述的提供豆粕和棉粕营养价值的关键问题，通过研究芽 孢杆菌固体发酵的工艺参数，最终获得一种富含小分子(< 15KD)发酵饲用多肽的制备 方法。为解决优质饲料蛋白资源紧缺特别是为幼龄动物提供优良蛋白原料和益生菌提供 了技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于通过凝结芽孢杆菌固态生物发酵，提供一种小分子 (< 15KD)发酵饲用多肽的制备方法，促进豆粕和棉粕在幼龄动物饲喂中的有效应用， 解决优质蛋白饲料资源的紧缺问题。本发明的目的通过以下技术方案予以实现。本发明提供的一种小分子(< 15KD)发酵饲用多肽的制备方法，其步骤如下a.原始出发菌株凝结芽孢杆菌划线在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上，30°C， 静置培养48h进行活化。b.从斜面上挑取一环菌体，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30°C， 200-250rpm,培养12_16h，作为种子液。在液体扩大牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以 5%的接种量接种种子液，30°C，200-250rpm,培养OD6tltlnm = 4时，作为发酵接种液。C.将b中的发酵接种液以10%的接种量接种到饼粕发酵基料中(豆粕和棉粕粉碎 过20目，豆粕棉粕麸皮=4:4:2，料水比=1 0.9。)，混合均勻，于30°C发 酵48h。于60°C烘干，对发酵前后的饼粕进行营养成分分析。
本发明步骤a中所述的活化菌体的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按质量百分比含有 1.0%蛋白胨，0.5%氯化钠，0.3%牛肉膏，2.0%琼脂。本发明步骤b中所述的菌体种子液和扩大培养培养基按质量百分比含有1.0%蛋 白胨，0.5%氯化钠，0.3%牛肉膏。本发明步骤a中所述的菌种为凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans，CGMCC 1.2009) 1 株。本发明具有以下有益效果与其他化学和物理方法相比，本发明所用的微生物发酵法具有对饲料营养成分 的影响与破坏较小的特点。同时降低了豆粕和棉粕抗营养因子的含量，蛋白溶解度增 加，大分子蛋白质被明显降解，从而大大提高了豆粕和棉粕的营养品质。通过专用软 件(GlyKoBandScanVersion 5.0)针对饼粕发酵前后的蛋白的磷酸缓冲液抽提液(PBS， pH7.4 KH2PO4 0.24g/L, Na2HPO4 1.44g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L)的三羟甲基甘氨 酸一十二烷基硫酸钠一聚丙稀酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)条带浓度分析表明， 分子量大于45KDa的蛋白质在未发酵饼粕中平均占40%，发酵饼粕中平均为2% ；分子 量介于15KDa和45KDa之间的蛋白质在未发酵饼粕中平均占55%，发酵饼粕中平均为 35% ；分子量小于15KDa的蛋白质在未发酵饼粕中平均占5%，发酵饼粕中提高平均为 63% (表2).胰蛋白酶抑制剂含量由发酵前1.749mg/g降至发酵后0.082mg/g;发酵后水 解度为22.72%;从表2和图1可以看出发酵饼粕中主要的抗原蛋白如β-伴球蛋白α 亚基(分子量为57-76KDa)和大豆球蛋白的5个亚基(分子量均大于58KDa)和棉粕中 有毒游离棉酚都得到有效地降解，从而可以降低其抗原性和毒性，益生菌凝结芽孢杆菌 达到5.0X 108CFU/g。有益微生物发酵植物性饼粕(豆粕和棉粕)基料的8大关键指标 包括小于15kD的小分子肽质量比例>60%，水解度>20%，真蛋白质表观含量提高 2.55%,主要致敏蛋白降解率> 90%，胰蛋白酶抑制剂含量< 0.20mg/g，蛋白酶酶活> 1000U/g,棉酚含量< 80mg/Kg，益生菌凝结芽孢杆菌活菌数量> 1.0 X 108CFU/g，是一 种在现代畜牧业和饲料工业中有着重要应用前途的高值饲料蛋白。
图1饼粕在发酵前后的Tricine-SDS-PAGE蛋白质电泳图谱下面结合附图对本发明做进一步说明。图1为饼粕发酵前后的SDS-PAGE蛋白质电泳图谱，其中泳道1为蛋白质分子 量标准，从上至下依次为94.0kDa，66.2kDa, 45.0kDa, 35.0kDa, 28.5kDa, 20.0kDa, 14.4kDa ；泳道2为未发酵基料样品；泳道3为发酵饼粕产品。
具体实施例方式本发明提供的一种小分子(< 15KD)发酵饲用植物性多肽的制备方法的具体实 施方式如下本实施例所用的菌株为凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans，CGMCC 1.2009)。a.l0g蛋白胨，5g氯化钠，3g牛肉膏，定容至1L，加入20g琼脂，加热溶解后，
分装到试管中，蒸汽灭菌121°C，20min,制成活化菌体的牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基。IOg蛋白胨，5g氯化钠，3g牛肉膏，定容至1L，分装到三角瓶，蒸汽灭菌121°C， 20min,制成菌体种子液和扩大培养液体培养基。b.原始出发菌株凝结芽孢杆菌划线在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上，30°C， 静止培养48h进行活化。C.从斜面上挑取一环菌体，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30°C， 200-250rpm,培养12_16h，作为种子液。在液体扩大牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以 5%的接种量接种种子液，30°C，200-250rpm,培养OD6tltlnm = 4时，作为发酵接种液。d.发酵接种液以10%的接种量接种到植物性饼粕发酵基料中(豆粕和棉粕粉碎 过20目，豆粕棉粕麸皮=4:4:2，料水比=1 0.9)，混合均勻，于30°C发酵 48h。于60°C烘干。e.对发酵前后的豆粕进行营养成分分析。经上述实例中微生物发酵法制备的植物源性小分子多肽与未发酵植物性饼粕相 比，营养特性得到明显改善。豆粕发酵后，蛋白溶解度增加，大分子蛋白质被明显降 解，通过专用软件(GlyKo BandScan Version 5.0)针对豆粕、棉粕发酵前后的蛋白的PBS 抽提液(PBS pH7.4 KH2PO40.24g/L，Na2HPO41.44g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L)的 Tricine-SDS-PAGE电泳条带(图1)浓度分析表明，分子量大于45KDa的蛋白质在未发 酵饼粕中平均占40%，发酵饼粕中平均为2%;分子量介于15KDa和45KDa之间的蛋白 质在未发酵饼粕中平均占55%，发酵饼粕中平均为35%;分子量小于15KDa的蛋白质 在未发酵饼粕中平均占5%，发酵饼粕中提高平均为63% (表2).胰蛋白酶抑制剂含量由 发酵前1.749mg/g降至发酵后0.082mg/g ；中性蛋白酶酶活> 1331U/g，发酵后水解度为 22.72%；豆粕中主要的抗原蛋白如β-伴球蛋白α亚基(分子量为57-76KDa)和大豆球 蛋白的5个亚基(分子量均大于58KDa)都得到有效地降解(表2和图1)，从而可以降低 其抗原性；同时发酵培养基中棉粕所含有毒游离棉酚由330mg/Kg降低到77mg/Kg，降 低76.67% ；益生菌凝结芽孢杆菌达到5.0X 108CFU/g。通过凝结芽孢杆菌固态发酵以豆 粕和棉粕为主的饲料蛋白培养基，营养价值得到明显改进，其效果见表1和表2。有益微 生物发酵植物性饼粕(豆粕和棉粕)基料所得产品的8大关键指标分别是小于15kD的 小分子肽质量比例> 60%，水解度>20%，真蛋白质表观含量提高2.55%，主要致敏蛋 白降解率>90%，胰蛋白酶抑制剂含量<0.20mg/g，蛋白酶酶活> 1000U/g，棉酚含量 <80mg/Kg,益生菌凝结芽孢杆菌活菌数量>1.0X108CFU/g，是一种在现代畜牧业和饲 料工业中有着重要应用前途的高值饲料蛋白。表1培养基发酵前后成分的比较
权利要求
1.一种小分子(< 15KD)发酵饲用多肽的制备方法，其步骤为a.原始出发菌株凝结芽孢杆菌划线在牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上，30°C，静置 培养48h进行活化。b.从斜面上挑取一环菌体，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30°C， 200-250rpm,培养12_16h，作为种子液。在液体扩大牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以 5%的接种量接种种子液，30°C，200-250rpm,培养OD6tltlnm = 4时，作为发酵接种液。C.将b中的发酵接种液以10%的接种量接种到植物性饼粕(豆粕和棉粕)发酵基料中 (豆粕和棉粕粉碎过20目，豆粕棉粕麸皮=4 4 2，料水比=1 0.9)，混合均 勻，于30°C发酵48h。于60°C烘干，对发酵前后的豆粕进行营养成分分析。
2.根据权利要求1所述的小分子(<15KD)发酵饲用多肽的制备方法，其步骤a所 述的活化菌体的牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基，IOg蛋白胨，5g氯化钠，3g牛肉膏，定 容至1L，加入20g琼脂，加热溶解后，分装到试管中，蒸汽灭菌121°C，20min。
3.根据权利要求1所述的小分子(<15KD)发酵饲用多肽的制备方法，其步骤b所述 的菌体种子液和扩大培养液体培养基，IOg蛋白胨，5g氯化钠，3g牛肉膏，定容至1L， 分装到三角瓶，蒸汽灭菌121°C，20min。
4.根据权利要求1所述的小分子(<15KD)发酵饲用多肽的制备方法，其步骤a所 述的菌种为凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans, CGMCC 1.2009) 1株。
5.根据权利1，2，3，4制作的发酵植物性饼粕(豆粕和棉粕)产品的8大关键指标 如下小于15kD的小分子肽质量比例> 60%，水解度>20%，真蛋白质表观含量提高 2.55%,主要致敏蛋白降解率> 90%，胰蛋白酶抑制剂含量<0.20mg/g，蛋白酶酶活> 1000U/g,棉酚含量< 80mg/Kg，益生菌凝结芽孢杆菌活菌数量> 1.0 X 108CFU/g，是一 种在现代畜牧业和饲料工业中有着重要应用前途的高值饲料蛋白。
全文摘要
一种小分子(＜15KD)发酵饲用多肽的制备方法本发明涉及生物发酵技术领域，以豆粕、棉粕和麸皮为原料，利用微生物发酵技术有效去除豆粕中的大豆抗营养因子和棉粕中的棉酚，同时得到富含凝结芽孢杆菌的优质发酵植物性饼粕，尤其是一种固态发酵的制备分子量低于15KDa的饲用植物性多肽的工艺。原始出发菌株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)1株经过活化，扩大培养后，OD600nm达到4时的培养液，作为饼粕发酵接种液。以10％的接种量接种到植物性饼粕发酵基料中(豆粕和棉粕粉碎过20目，豆粕∶棉粕∶麸皮＝4∶4∶2，料水比＝1∶0.9)，混合均匀，于30℃发酵48h。于60℃烘干，对发酵前后的豆粕进行营养成分分析。
文档编号A23K1/00GK102008006SQ20091016950
公开日2011年4月13日 申请日期2009年9月8日 优先权日2009年9月8日
发明者杨雅麟, 滕达, 王建华, 田子罡 申请人:中国农业科学院饲料研究所