专利名称：一种高抗氧化低致敏性饲用发酵豆粕的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵技术领域，以豆粕和麸皮为原料，利用微生物发酵技术有效 去除豆粕中的大豆抗营养因子，同时得到富含分子量低于15KDa的多肽的优质发酵豆粕， 尤其是一种固态发酵的制备高抗氧化低致敏性豆粕的微生物发酵工艺。
背景技术：
我国是世界上最大的养殖生产国之一，同时也是世界上饲料原料特别是蛋白质原 料的需求大国。饲料粮主要是玉米原料再加鱼粉、豆粕及各种微量元素配制而成。占饲料 比重很大的蛋白质、能量饲料接近或超过70%。我国饲料工业生产中蛋白质饲料资源的严 重不足已成为事实，对国际原料市场有很深的依赖性，已使我国配合饲料的生产成本居高 不下，价格波动使生产企业处于亏损的边缘，抑制了饲料工业发展。饲料蛋白作为是制约中 国畜牧业发展的第一大权重因子，主控权受制于国外，因此饲料蛋白成为我国畜牧业发展 的第一大原料供给瓶颈和食物供给安全瓶颈，具有重要的国计民生和国民经济意义，更具 有重要的国家安全意义。由于动物源蛋白资源日益短缺，价格居高不下，使得植物性蛋白饲 料在动物饲料中的应用逐渐增加，其中豆粕是用量最大，也是最重要的一类植物性蛋白质 饲料。发酵豆粕指是通过现代生物发酵技术对原料豆粕进行发酵处理后的产物。发酵过 程中可产生蛋白酶、非淀粉多糖酶等多种酶活，消除抗营养因子，消解大豆抗原蛋白实现大 豆生物脱敏，把大分子量的大豆蛋白质分解为多肽、寡肽、甚至小肽，从而增加水溶性，提高 消化率，利于动物消化吸收。纤维类物质分解为糖，部分糖被转化为乳酸，并产生大量有益 微生物，使豆粕转化成高营养价值的功能性饲料。可作为断奶仔猪、幼禽，尤其是高档经济 动物的优良蛋白质来源。饲料原料和全价饲料的氧化可使自身的饲喂价值显著降低。最终 的结果是营养成分的质量降低、动物的健康受损、动物的性能降低以及生产成本增高。本发明技术主要针对上述的提供豆粕营养价值的关键问题，通过研究米曲霉固体 发酵的工艺参数，最终获得一种饲用高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法。为解决优质饲 料蛋白资源紧缺特别是为幼龄动物提供优良蛋白原料和发酵豆粕饲料产品的抗氧化稳定 性提供了技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于通过米曲霉固态生物发酵，提供一种具有高抗氧化低致敏性发 酵豆粕的制备方法，促进豆粕在幼龄动物饲喂中的应用，解决优质蛋白饲料资源的紧缺问题。本发明的目的通过以下技术方案予以实现。本发明提供的一种饲用高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法，其步骤如下a.原始出发菌株米曲霉经过马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基活化，28°C，静止培养 60h，作为活化孢子。
b.挑取活化孢子一环划线接种马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，28°C，静止培养 48h后，用含有0. 12%吐温(Tween)SO的无菌水制备孢子数目为106/ml的孢子悬浮液，作 为豆粕发酵接种液。C.将b中的豆粕发酵接种液以10%的接种量接种到豆粕发酵基料中(豆粕粉碎 过20目，豆粕麸皮=3 1，料水比=1 0.9。)，混合均勻，于28°C发酵48h。于60°C 烘干，对发酵前后的豆粕进行营养成分分析。本发明步骤a中所述的活化孢子的马铃薯葡萄糖琼脂培养基按照马铃薯200g提 取液11，葡萄糖20克，琼脂20克。本发明步骤a中所述的菌种为米曲霉(Aspergillus oryzae) 1株，该菌株保藏于 中国工业微生物菌种保藏中心(CICC 40188)。本发明步骤b中所述的制备豆粕发酵接种液 的培养基配方与步骤a相同。本发明具有以下有益效果与其他化学和物理方法比较，本发明所用的微生物发酵法具有对饲料营养成分的 影响与破坏较小。同时大大提高了豆粕的营养品质。豆粕发酵后，蛋白溶解度增加，大分 子蛋白质被明显降解，通过专用软件(GlyKo BandScan Version 5.0)针对豆粕发酵前后 的蛋白的磷酸缓冲液抽提液(PBS, ρΗ7· 4 =KH2PO4O. 24g/L，Na2HPO4L 44g/L，NaCl 8. Og/L, KCl 0. 2g/L)的十二烷基硫酸钠一聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条带浓度分析表明， 分子量大于45KDa的蛋白质在未发酵豆粕中占40%，发酵豆粕中为8% ；分子量介于15KDa 和45KDa之间的蛋白质在未发酵豆粕中占55%，发酵豆粕中为57% ；分子量小于15KDa的 蛋白质在未发酵豆粕中仅占5%，发酵豆粕中提高为35% .胰蛋白酶抑制剂含量由发酵前 3. 508mg/g降至发酵后0. 655mg/g ；发酵后水解度为21. 72%;从表3和图1可以看出发酵 豆粕中主要的抗原蛋白如β-伴球蛋白α亚基(分子量为57_76KDa)和大豆球蛋白的5 个亚基(分子量均大于58KDa)都得到有效地降解，从而可以降低其抗原性。尤其是抗氧化 活性的提高方面，发酵后豆粕质量浓度为8mg/ml时，对二苯代苦味胼基自由基(DPPH)的清 除率达到55%，为相同浓度未发酵豆粕的2. 36倍。
图1豆粕发酵前后的SDS-PAGE蛋白质电泳图谱下面结合附图对本发明做进一步说明。图1为豆粕发酵前后的SDS-PAGE蛋白质电泳图谱，其中泳道1为蛋白质分子量标 准，从上至下依次为94. OkDa, 66. 2kDa，45. OkDa, 35. OkDa, 28. 5kDa，20. OkDa, 14. 4kDa ；泳 道2为未发酵豆粕样品；泳道3和4为发酵豆粕样品。
具体实施例方式本发明提供的一种饲用高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法的具体实施方式
如 下本实施例所用的菌株为米曲霉(Aspergillus oryzae)，保藏于中国工业微生物菌 种保藏中心(CICC 40188)。a.去皮马铃薯200g，切成小块，加入到装有700ml双蒸水的烧杯中，沸水煮30min，两层纱布过滤，定容至1L，加入20g葡萄糖和20g琼脂，加热溶解后，分装到试管中，蒸汽灭 菌121°C，20min,制成活化孢子和培养孢子的马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基。b.原始出发菌株米曲霉经过马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基活化，28°C，静止培养 60h，作为活化孢子。c.挑取活化孢子一环划线接种马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，28°C，静止培养 48h后，用含有0. 12% TweenSO的无菌水制备孢子数目为106/ml的孢子悬浮液，作为豆粕 发酵接种液。d.豆粕发酵接种液以10%的接种量接种到豆粕发酵基料中(豆粕粉碎过20 目，豆粕麸皮=3 1，料水比=1 0.9。)，混合均勻，于28°C发酵48h，于60°C烘干.e.对发酵前后的豆粕进行营养成分分析。经上述实例中微生物发酵法制备的高抗氧化低致敏性豆粕与未发酵豆粕相比，营 养特性得到明显改善。豆粕发酵后，蛋白溶解度增加，大分子蛋白质被明显降解，通过专用 软件(GlyKoBandScan Version 5.0)针对豆粕发酵前后的蛋白的PBS抽提液(PBS pH7. 4 KH2PO4O. 24g/L, Na2HPO4L 44g/L, NaCl 8. Og/L, KCl 0. 2g/L)的 SDS-PAGE 电泳条带(图 1) 浓度分析表明，分子量大于45KDa的蛋白质在未发酵豆粕中占40%，发酵豆粕中为8% ；分 子量介于15KDa和45KDa之间的蛋白质在未发酵豆粕中占55 %，发酵豆粕中为57 % ；分子 量小于15KDa的蛋白质在未发酵豆粕中仅占5%，发酵豆粕中提高为35% (表3).胰蛋白 酶抑制剂含量由发酵前3. 508mg/g降至发酵后0. 655mg/g ；发酵后水解度为21. 72% ；豆粕 中主要的抗原蛋白如β-伴球蛋白α亚基(分子量为57_76KDa)和大豆球蛋白的5个亚 基(分子量均大于58KDa)都得到有效地降解(表3和图1)，从而可以降低其抗原性。尤其 是抗氧化活性的提高方面，发酵后豆粕质量浓度为8mg/ml时，对DPPH的清除率达到55%， 为相同浓度未发酵豆粕的2. 36倍。通过米曲霉固态发酵豆粕，营养价值得到大大提高，其 效果如下表1豆粕发酵前后成分的比较
权利要求
1.一种饲用高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法，其步骤为a.原始出发菌株米曲霉经过马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基活化，28°C，静止培养60h， 作为活化孢子。b.挑取活化孢子一环划线接种马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，280C，静止培养48h后， 用含有0. 12% Tween 80的无菌水制备孢子数目为106/ml的孢子悬浮液，作为豆粕发酵接 种液。c.将b中的豆粕发酵接种液以10%的接种量接种到豆粕发酵基料中(豆粕粉碎过20 目，豆粕麸皮=3 1，料水比=1 0.9。)，混合均勻，于28°C发酵48h。于60°C烘干， 对发酵前后的豆粕进行营养成分分析。
2.根据权利要求1所述的高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法，其步骤a所述的活化 孢子和培养孢子的马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，将去皮马铃薯200g，切成小块，加入到装 有700ml双蒸水的烧杯中，沸水煮30min，两层纱布过滤，定容至1L，加入20g葡萄糖和20g 琼脂，加热溶解后，分装到试管中，蒸汽灭菌121°C，20min。
3.根据权利要求1所述的高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法，其步骤a所述的菌种 为米曲霉(Aspergillus oryzae, CICC 40188) 1 株。
4.根据权利要求1所述的高抗氧化低致敏性发酵豆粕制备方法，其步骤b所述的悬浮 孢子制备液为含有0. 12% Tween 80的无菌水。
全文摘要
本发明涉及生物发酵技术领域，以豆粕和麸皮为原料，利用微生物发酵技术有效去除豆粕中的大豆抗营养因子，同时得到富含分子量低于15KDa的多肽的优质发酵豆粕，尤其是一种固态发酵的制备高抗氧化低致敏性豆粕的微生物发酵工艺。原始出发菌株米曲霉(Aspergillus oryzae，CICC 40188)1株经过活化，扩大培养后，用含有0.12％土温(Tween)80的无菌水制备孢子数目为106/ml的孢子悬浮液，作为豆粕发酵接种液。以10％的接种量接种到豆粕发酵基料中(豆粕粉碎过20目，豆粕∶麸皮＝3∶1，料水比＝1∶0.9)，混合均匀，于28℃发酵48h。于60℃烘干，对发酵前后的豆粕进行营养成分分析。
文档编号A23K1/14GK101990984SQ20091016966
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月31日 优先权日2009年8月31日
发明者杨雅麟, 滕达, 王建华, 田子罡, 高美云 申请人:中国农业科学院饲料研究所