专利名称：一种真姬菇单单杂交育种方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌的杂交育种方法，具体涉及一种高效的真姬菇(Hypsizygus marmoreus)单单杂交育种方法。公开了真姬菇单单杂交育种方法的整个流程及操作要求， 包括所需的培养基、亲本的选择、杂交的过程和技术、栽培出菇。
背景技术：
真姬菇(Hypsizigus marmoreus)又名玉覃、斑玉覃、海鲜菇、胶玉蘑、鸿喜菇、蟹味 菇、假松茸等。隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、离褶菌族、玉蕈属，是北温带一种 优良的食用菌。真姬菇味比平菇鲜，肉比滑菇厚，质比香菇韧，口感极佳，还具有独特的蟹香 味，在日本有“香在松口蘑、味在玉覃”之说。真姬菇分布在日本、北美和欧洲等北温带地区，是春秋季生木腐菌，主要生长在山 毛榉及其他阔叶树的枯木、风倒木和树桩上。真姬菇的蛋白质中氨基酸种类齐全，包括8种 人体必需氨基酸，其中赖氨酸、精氨酸含量高于一般菇类。并且真姬菇是一种低热量、低脂 肪的保健食品，其味鲜美、性平、甘温，有利尿渗湿，健脾止渴之功能，清热平肝之效。口感极 佳，常食可提高免疫力、预防衰老、延长寿命，深受广大消费者的喜爱。真姬菇的需温特性，属中低温型。菌丝生长的适宜温度为22°C _M°C，菇蕾分化的 适宜温度为ire -14°C，子实体成长的适宜温度是14°C -18°c。担子菌亚门中多数担子菌的双核菌丝，在进行细胞分裂时，于菌丝的分隔处形成 的一个侧生的喙状结构。只出现在双核菌丝上。其形成过程是首先，在细胞的两核之间 生出一个喙状突起，双核中的一个移入喙状突起，另一个仍留在细胞下部。两异质核同时分 裂，成为4个子核。分裂完成后，原位于喙基部的一子核与原位于细胞中的一子核移至细胞 上部配对；另外两子核，一个进入喙突中，一个留在细胞下部。此时细胞中部和喙基部均生 出横隔，将原细胞分成三部分。上部是双核细胞，下部和喙突部暂为两单核细胞。此后，喙 突尖端继续下延与细胞下部接触并融通。同时喙突中的核进入下部细胞内，使细胞下部也 成为双核。经如上变化后，4个子核分成2对，一个双核细胞分裂为两个。此过程结束后，在 两细胞分融处残留一个喙状结构，即锁状联合。锁状联合保证了双核菌丝在进行细胞分裂 时，每节(每个细胞)都能含有两个异质(遗传型不同)的核，为进行有性生殖，通过核配 形成担子打下基础。锁状联合是双核菌丝的鉴定标准，凡是产生锁状联合的菌丝均可断定 为双核。锁状联合也是担子菌亚门的明显特征之一。真姬菇也具有产生锁状联合的特征。现有的专业蕈菌遗传育种的方法，如《覃菌遗传育种》张树挺、林芳灿介绍，流程如 下(1)亲本的选择。选择优点多、能互补、亲缘关系较远、其中一个是当地大面积推广 的品种。(2)孢子采集、孢子稀释涂布、挑单孢。(3)镜检锁状联合的有无以获得单核菌丝。(4)单核菌丝配对。
(5)镜检锁状联合的有无以获得杂合子。(6)杂合子小试、大试和推广。因为真姬菇具有良好的市场，中国、日本和韩国的一些企业开始在控制温度、湿 度、光照和空气交换的人工环境进行工厂化栽培生产，但是真姬菇的菌株选育效率不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的高效的真姬菇单单杂交育种方法，通过此方法可 以提高优良菌株的选育效率。该发明适用于真姬菇的育种，特别适于真姬菇的工厂化栽培生产。担子菌亚门中多数担子菌的双核菌丝，在进行细胞分裂时，于菌丝的分隔处形成 的一个侧生的喙状结构。只出现在双核菌丝上。锁状联合保证了双核菌丝在进行细胞分裂 时，每节(每个细胞)都能含有两个异质(遗传型不同)的核，为进行有性生殖，通过核配 形成担子打下基础。锁状联合是双核菌丝的鉴定标准，凡是产生锁状联合的菌丝均可断定 为双核。锁状联合也是担子菌亚门的明显特征之一。真姬菇也具有产生锁状联合的特征。 应用锁状联合作为区分单核菌丝和双核菌丝的标准。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现一种真姬菇单单杂交育种方法，包括(1)亲本的选择根据育种目标选择合适的亲本，熟悉各亲本的特点，熟悉其优缺 点，亲本之间有较远的亲缘关系，有好的配合力；(2)孢子采集、孢子稀释涂布、挑单孢、镜检锁状联合的有无以获得单核菌丝；无 锁状联合的为单核菌丝；所述孢子采集主要采用钩悬法收集孢子；所述孢子稀释涂布为无菌操作，涂布浓度为在40倍显微视野中有2 3个孢子， 在16 21°C培养8-10天；所述挑单孢在稀疏的部位挑取单孢；(3)单核菌丝组合杂交亲本单核菌丝要进行配对杂交，选择发菌速度快、菌丝浓 密、洁白的单核菌丝进行配对杂交；所述单核菌丝镜检、扩繁保种操作在63倍视野中，在不同的区域寻找3 5个视 野，无锁状联合则为单核菌丝；配对杂交选择发菌速度快，菌丝浓密洁白的单核菌丝配对；(4)镜检锁状联合有无以获得杂合子，有锁状联合的为杂合子，然后进行杂合子挑 取；所述杂合子镜检操作在63倍视野中，在不同的区域寻找3 5个视野，若有锁状 联合则是杂合子挑取；所述杂合子挑取的条件a.当两单核菌丝生长到接触后，镜检锁状联合的有无，若有锁状联合则说明杂交 成功，挑取杂合子。所述杂合子挑取原则a. 一个杂交组合能得出多种杂交后代，这些后代间的拮抗并不一定明显；
b.若一个杂交组合的所有菌丝一股脑的都用来出菇，即便其中有优良的部分也得 不到好的菌株；(5)栽培出菇试管种转三角瓶种23-25天菌龄；三角瓶种转原种33-35天菌龄；原种转栽培种43-45天菌龄；栽培种搔菌83-85天菌龄；栽培出菇根据育种目标设计栽培参数；所述栽培参数栽培室温度设定为13 15°C，湿度90 95%，C02浓度1000 2000ppm,前1 7天光照强度50 lOOLux，后8 20天光照强度200 300Lux，每天间 隙式开启层架灯；22 M天开始采收；出菇试验菌株开发、小试根据育种目标设计合理的开发方案；a.每一个菌株有其营养和栽培条件的需要，对培养基、温、湿、光、气的要求不同；栽培种培养基玉米芯40 50%、大豆皮20 30%、米糠10 15%、麸皮15 20 %，玉米粉5 %，含水量64 66 %。栽培室温度设定为13 15°C，湿度90 95%，C02浓度1000 2000ppm，前1 7天光照强度50 lOOLux，后8 20天光照强度200 300Lux，每天间隙式开启层架灯； 22 M天开始采收。b.各个菌株有其优势方向，要发扬优势，避免劣势；比如低菌龄，开发出的白色蟹味菇菌株较普通白色蟹味菇的菌龄缩短19-21天， 开发出的棕色蟹味菇菌株较普通棕色蟹味菇缩短M-26天；又如无瘤盖，开发出的白色蟹味菇菌株的菌盖较普通白色蟹味菇的菌盖不会出现 瘤盖菇现象，开发出的棕色蟹味菇菌株的菌盖较普通棕色蟹味菇的菌盖不会出现瘤盖菇现象。c.根据育种目标设计有效地开发方法，比如目的获得短菌龄的菌株，要设计较 宽的从55天菌龄到100天菌龄，5天菌龄作为一个梯度的菌龄实验；(6)中试、大试、推广；将经过中试、大试的农艺性状优良的菌株进行常规经过法定技术鉴定而成为食用 菌新品种，进行推广。本发明的有益效果遗传有细胞质遗传和细胞核遗传，本发明方法满足了好的遗传物质(DNA、基因) 需要合适的环境(细胞质、细胞器)配合的要求，能发挥其最大效应。本方法大大提高了育种效率。把育种时间从几年降为18个月，得到多个高产、优 质、抗逆强的菌株，并且它们适合工厂化栽培。
以下结合附图和具体实施方式
来进一步说明本发明。
图1为本发明的真姬菇单单杂交流程图。图2为本发明的真姬菇杂合子挑取方式的示意图。
具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具 体图示，进一步阐述本发明。一种真姬菇单单杂交育种方法，如
图1所示所示，包括(1)亲本的选择根据育种目标选择合适的真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)亲本 F-ff(白色)和亲本F-4(棕色)，熟悉各亲本的特点，熟悉其优缺点，亲本之间有较远的亲缘 关系，有好的配合力；(2)孢子采集、孢子稀释涂布、挑单孢、镜检锁状联合的有无以获得单核菌丝；无 锁状联合的为单核菌丝；试管、平皿培养基、三角瓶培养基采用PDA培养基。孢子采集主要采用钩悬法收 集孢子；钩悬法取成熟菌盖的几片菌褶或一小块真姬菇，用无菌不锈钢丝或铁丝、棉线等 其他悬挂材料悬挂于三角瓶内的培养基的上方，培养基的厚度为1cm，勿使接触到培养基或 四周瓶壁。25°C、24h现孢子粉，取出分离材料，22°C -25°C，挑健壮尖端菌丝转管，纯化。孢子稀释涂布为无菌操作，涂布浓度为在40倍显微视野中有2 3个孢子，在 16 21°C培养8-10天；所述挑单孢在稀疏的部位挑取单孢；(3)单核菌丝组合杂交亲本单核菌丝要进行配对杂交，选择发菌速度快、菌丝浓 密、洁白的单核菌丝进行配对杂交；单核菌丝镜检、扩繁保种操作在63倍视野中，在不同的区域寻找3 5个视野，无 锁状联合则为单核菌丝；配对杂交选择发菌速度快，菌丝浓密洁白的单核菌丝配对；(4)镜检锁状联合有无以获得杂合子，有锁状联合的为杂合子，然后进行杂合子挑 取；杂合子镜检操作在63倍视野中，在不同的区域寻找3 5个视野，若有锁状联合 则是杂合子挑取；所述杂合子挑取的条件a.当两单核菌丝生长到接触后，镜检锁状联合的有无，若有锁状联合则说明杂交 成功，挑取杂合子。杂合子挑取原则如图2所示。a. 一个杂交组合能得出多种杂交后代，这些后代间的拮抗并不一定明显；b.若一个杂交组合的所有菌丝一股脑的都用来出菇，即便其中有优良的部分也得 不到好的菌株；(5)栽培出菇，每个育种者必须也会栽培，良种还要有良法栽培室温度设定为13 15°C，湿度90 95%，C02浓度1000 2000ppm，前1 7天光照强度50 lOOLux，后8 20天光照强度200 300Lux，每天间隙式开启层架灯。 22 M天开始采收；试管种转三角瓶种23-25天菌龄；三角瓶种转原种33-35天菌龄；原种培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g；原种转栽培种43-45天菌龄；栽培种培养基玉米芯40 50%、大豆皮20 30%、米糠10 15%、麸皮15 20%，玉米粉5%，含水量64 66%。栽培种搔菌83-85天菌龄；栽培出菇根据育种目标设计栽培参数，栽培室温度设定为13 15°C，湿度90 95%,C02浓度1000 2000ppm，前1 7天光照强度50 lOOLux，后8 20天光照强度 200 300LUX，每天间隙式开启层架灯。22 M天开始采收；出菇试验(菌株开发、小试)根据育种目标设计合理的开发方案；a.每一个菌株有其营养和栽培条件的需要，对培养基、温、湿、光、气的要求不同；栽培种培养基玉米芯40 50%、大豆皮20 30%、米糠10 15%、麸皮15 20%，玉米粉5%，含水量64 66%。栽培室温度设定为13 15°C，湿度90 95%，C02浓度1000 2000ppm，前1 7天光照强度50 lOOLux，后8 20天光照强度200 300Lux，每天间隙式开启层架灯。 22 M天开始采收。b.各个菌株有其优势方向，要发扬优势，避免劣势；比如低菌龄，开发出的白色蟹味菇菌株较普通白色蟹味菇的菌龄缩短19-21天， 开发出的棕色蟹味菇菌株较普通棕色蟹味菇缩短M-26天；又如无瘤盖，开发出的白色蟹味菇菌株的菌盖较普通白色蟹味菇的菌盖不会出现 瘤盖菇现象，开发出的棕色蟹味菇菌株的菌盖较普通棕色蟹味菇的菌盖不会出现瘤盖菇现象。c.根据育种目标设计有效地开发方法，比如目的获得短菌龄的菌株，要设计较 宽的从55天菌龄到100天菌龄，5天菌龄作为一个梯度的菌龄实验；(6)中试、大试、推广；将经过中试、大试的农艺性状优良的菌株进行常规经过法定技术鉴定而成为食用 菌新品种，进行推广。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
权利要求
1.一种真姬菇单单杂交育种方法，包括如下步骤(1)亲本的选择根据育种目标选择合适的亲本，熟悉各亲本的特点，熟悉其优缺点， 亲本之间有较远的亲缘关系，有好的配合力；(2)孢子采集、孢子稀释涂布、挑单孢、镜检锁状联合的有无以获得单核菌丝；无锁状 联合的为单核菌丝；(3)单核菌丝组合杂交亲本单核菌丝要进行配对杂交，选择发菌速度快、菌丝浓密、 洁白的单核菌丝进行配对杂交；(4)镜检锁状联合有无以获得杂合子，有锁状联合的为杂合子，然后进行杂合子挑取；所述杂合子挑取的条件a.当两单核菌丝生长到接触后，镜检锁状联合的有无，若有锁状联合则说明杂交成功， 挑取杂合子。(5)栽培出菇试管种转三角瓶种23-25天菌龄；三角瓶种转原种33-35天菌龄；原种转栽培种43-45天菌龄；栽培种搔菌83-85天菌龄；栽培出菇根据育种目标设计栽培参数；出菇试验菌株开发、小试根据育种目标设计合理的开发方案；(6)中试、大试、推广。
2.根据权利要求1所述的一种真姬菇单单杂交育种方法，其特征在于，步骤2中所述孢 子采集主要采用钩悬法收集孢子；所述孢子稀释涂布为无菌操作，涂布浓度为在40倍显微 视野中有2 3个孢子，在16 21°C培养8-10天；所述挑单孢在稀疏的部位挑取单孢。
3.根据权利要求1所述的一种真姬菇单单杂交育种方法，其特征在于，步骤3中所述单 核菌丝镜检、扩繁保种操作在63倍视野中，在不同的区域寻找3 5个视野，无锁状联合则 为单核菌丝；配对杂交选择发菌速度快，菌丝浓密洁白的单核菌丝配对；单核菌丝组合杂 交亲本单核要进行合适的组合，选择发菌速度快、菌丝浓密的单核菌丝进行组合。
4.根据权利要求1所述的一种真姬菇单单杂交育种方法，其特征在于，所述杂合子镜 检操作在63倍视野中，在不同的区域寻找3 5个视野，若有锁状联合则是杂合子。
5.根据权利要求1所述的一种真姬菇单单杂交育种方法，其特征在于，步骤5中所述栽 培参数栽培室温度设定为13 15°C，湿度90 95%，C02浓度1000 2000ppm，前1 7天光照强度50 lOOLux，后8 20天光照强度200 300Lux，每天间隙式开启层架灯； 22 M天开始采收。
全文摘要
一种真姬菇单单杂交育种方法，包括亲本的选择；孢子采集、孢子稀释涂布、挑单孢、镜检无锁状联合的为单核菌丝；所述孢子稀释涂布为无菌操作，涂布浓度为在40倍显微视野中有2～3个孢子，在16～21℃培养8-10天；在稀疏的部位挑取单孢；单核菌丝组合杂交亲本单核菌丝要进行配对杂交，选择发菌速度快、菌丝浓密、洁白的单核菌丝进行配对杂交；镜检有锁状联合的为杂合子，然后进行杂合子挑取；所述杂合子镜检操作在63倍视野中，在不同的区域寻找3～5个视野，若有锁状联合则是杂合子；栽培出菇；中试、大试、推广；本方法把育种时间从几年降为18个月，得到多个高产、优质、抗逆强的菌株。
文档编号A01H15/00GK102047839SQ200910221369
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月6日 优先权日2009年11月6日
发明者刘玉, 程继红, 陈传喜 申请人:上海丰科生物科技股份有限公司