荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子及其应用的制作方法

本发明涉及启动子领域，具体地指一种荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子及其应用。

背景技术：

荔枝是华南一种重要的果树，在农业经济中占有重要地位。然而，采前果实易受蛀蒂虫等危害导致落果严重,从而降低荔枝产量；采后荔枝果实不耐贮藏，果皮褐变、病害严重和失水变干易裂等，严重缩短了荔枝货架期，降低了荔枝的商品价值，限制了荔枝产业发展。培育多抗优质耐贮的新品种是解决这些问题的根本途径。但由于荔枝遗传基础狭窄，缺乏抗性资源，使抗性育种进展缓慢。

历史上，杂交育种与实生选种是荔枝品种改良的主要途径。但是，荔枝童期长，杂交育种周期长,而且不同亲本之间可能存在生殖隔离而致杂交不亲和，或因花期不遇难以杂交，使杂交存在技术困难。从实生的半野生群体中筛选优株，进而培育为优良品种是一种行之有效的办法，但选择效率低。目前，随土地开发利用的加速，荔枝实生群体规模快速缩小，加上历史上已经过多次筛选，从实生群体中选择优株的难度越来越大，效率更低。

现代植物转基因技术的兴起与发展为荔枝育种提供了新的方向。转基因技术既可以在受体中表达受体的同源基因(同源转基因)，也可以打破物种的限制，在受体中表达来自于不同于受体的外源基因(异源转基因)，从而不受资源匮乏的影响达到定向改良某一或某些性状的目的。

转基因育种一般都是通过基因工程来完成的，供体、受体和载体是基因工程的三大要素。其中，启动子调控外源基因的表达，而成为基因工程表达载体的重要组成元件。启动子按作用方式可以分为三类：组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组织特异性启动子常具有诱导型启动子的特征。在转基因育种中，组织特异性启动子比组成型启动子具有更广泛的用途。因为组成型启动子可以调节基因在植物各组织中均有不同程度的表达，从而使得植株各器官中的异源蛋白质或代谢产物大量积累，打破植物原有的代谢平衡，甚至会产生毒素，进而影响植物的正常生长发育，甚至会导致植物死亡，另外，也会给人类带来食用安全等相关问题。而通过利用组织特异性启动子，定向调节目的基因在特定器官或组织中表达，定向改良作物性状，是可行的转基因作物育种策略之一。研究荔枝启动子特别是组织特异表达基因启动子，有助于对荔枝性状进行定性改良，从而为荔枝转基因育种提供方向。

技术实现要素：

本发明目的是提供了一种荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子及其应用，本发明为荔枝基因工程育种提供基础。

为实现上述目的，本发明提供的一种荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。其来源于无患子科荔枝(L.chinensis Sonn)妃子笑品种。

本发明提供了用于获得上述荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子的引物对，所述引物对为：

正向引物P1：5'-GTGCCCCATGACTTATTTTAT-3'；

反向引物P2：5'-TCTTTCACCAACCTTGCTATT-3'。

本发明提供了一种荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子的获得方法，以具有荔枝叶片特异表达基因LcGRX的荔枝基因组DNA为模板，采用以下引物对：

正向引物P1：5'-GTGCCCCATGACTTATTTTAT-3'；

反向引物P2：5'-TCTTTCACCAACCTTGCTATT-3'。

进行PCR扩增，其所获得的荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子序列为SEQ IDNO.1所示。

作为优选方案，所述PCR反应体系：

所述PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循环35次后；72℃延伸8min。

本发明还提供了一种重组表达载体，它含有上述荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子的植物表达载体。作为优选方案，植物表达载体为pCAMBIA1304。含有本发明启动子的重组载体、含有载体的宿主菌株、表达盒、转基因细胞系或者转基因植株均属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种上述重组表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)以荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子序列如SEQ IDNO.1所示为模板设计引物对，如下：

LcGRX-F：AACTGCAGGTGCCCCATGACTTATTTTAT(下划线为Pst I酶切位点)，

LcGRX-R：CGGAATTCTCTTTCACCAACCTTGCTATT(下划线为EcoR I酶切位点)；

2)以荔枝叶片特异表达基因LcGRX序列为模板进行PCR，PCR扩增条件如下：

反应体系：

反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循环35次后；72℃延伸8min；获得PCR产物1；

3)以荔枝类甜蛋白LcTLP基因为模板设计引物对，如下：

正向引物P3：5'-CG(GAATTC)TCATGAAGCTCTTCAAAATCC-3'，

反向引物P4：5'-GG(ACTAGT)GGGGCAAAAGACAACCTT-3'；

4)以荔枝类甜蛋白LcTLP基因为模板进行PCR，PCR扩增条件如下：

94℃预变性4min；94℃变性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循环35次后；72℃延伸8min；获得PCR产物2；

5)用Pst I、EcoRI对PCR产物1进行酶切，纯化回收得到回收产物1，用EcoRI、SpeI对PCR产物1进行酶切，纯化回收得到回收产物2，同时，用PstI、SpeI将pCAMBIA1304载体进行双酶切，去除CaMV35S启动子，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳检测并回收大片段；

6)在10μL体系中，将回收的pCAMBIA1304载体大片段、回收产物1和回收产物2用T4连接酶4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将筛选得到的阳性克隆用PstI、SpeI进行酶切验证，获得得到表达Gus基因的植物重组表达载体pCAMBIA1304-GRX-TLP。

本发明提供了一种下述各项之一在启动目的基因表达和培育植物新品种中的应用，

(1)上述的启动子；

(2)上述的重组表达载体；

进一步地，所述植物为双子叶植物。

再进一步地，所述植物为荔枝、番茄或拟南芥。

本发明的有益效果在于：

本发明的启动子具有叶片特异性高表达，果肉低表达的特性，可应用于转基因育种领域。通过构建含有该启动子的植物表达载体，转化到植物，例如双子叶植物荔枝等的基因组中，驱动目的基因在植物叶片中特异性高表达，可用于培育新的育种材料，为进一步的荔枝转基因育种提供基础。

附图说明

图1为LcGRX基因在荔枝不同组织中的定量PCR表达图；

图2为LcGRX基因启动子表达载体构建图；

图3为pCAMBIA1304-GRX-TPL表达载体在荔枝不同组织的表达活性图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1荔枝叶片特异性表达基因LcGRX启动子序列的获得

摘取结果母枝中部无病虫害的成熟功能叶片和刚刚开放的花朵，3h内运回实验室，无菌水清洗干净，吸干多余水分，液氮速冻，-80℃超低温冰箱保存备用。采摘八成熟“妃子笑”果实且3h内运回实验室，挑选无病虫害的健康果实，灭菌水冲洗数次，吸干多余水分，剥取果皮、种子和果肉，液氮速冻，-80℃超低温冰箱保存备用。“妃子笑”成熟种子在育苗塞中培育出健康幼苗，3个月后，取根，无菌水冲洗干净,吸干多余水分，液氮速冻，-80℃超低温冰箱保存备用。以上材料用华越洋多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取总RNA。

取1.6μg总RNA，用Invirtrogen的SuperScriptT"I III Reverse Transcriptase合成cDNA第一链。具体操作如下：

体系轻轻混匀，瞬时离心，25℃孵育10min；42℃孵育30min；85℃加热5s；-20℃冰箱保存。

从前期荔枝各个组织(根、叶、花、果皮、果肉、果核)转录组数据分析表明，荔枝LcGRX基因在叶中有很强的表达活性，而在果肉中表达量很低。根据荔枝转录组拼接的序列和基因组的序列设计针对LcGRX基因启动子的特异引物(P1、P2)。其序列为

正向引物P1：GTGCCCCATGACTTATTTTAT；

反向引物P2：TCTTTCACCAACCTTGCTATT。

以荔枝品种妃子笑叶片为材料，采用艾德莱公司的DNA小量提取试剂盒提取基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测其浓度和纯度。以其DNA为模板，P1、P2为引物进行PCR。

反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循环35次后；72℃延伸8min。

琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收目的条带。PCR回收产物连接PMD18-T载体，转化大肠杆菌感受态。蓝白斑筛选后，挑取阳性克隆单菌落用于摇菌，提取质粒。筛选具有扩增目的片段的单克隆，后送北京华大基因工程技术服务有限公司测序。测序获得LcGRX基因编码区及上游序列，将所获目的片段序列与前期所获序列比对分析，两条序列碱基组成一致。选取翻译起始位点上游1996bp作为启动子序列进行研究，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

实施例2荔枝LcGRX基因在不同组织的表达模式调查

由于荔枝actin(肌动蛋白)基因在荔枝各个组织的表达量基本一致，所以检测荔枝基因的相对表达量一般使用actin作为内参基因。

设计如下特异性的RT-PCR引物：

Act-F：CAACTGGTATTGTCTTGGATTCTG；

Act-R：TCATCAAGGCATCGGTTAGA。

LcGRX-RT-F：AAGACCTCTTGTTGCATCAGCT；

LcGRX-RT-R:CACCTCCTACGAGTTCTTGACC。

RT-PCR反应体系如下：

反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火34s；循环40次，72℃延伸8min。

定量PCR分析结果表明，LcGRX基因在荔枝叶片高表达，在其余5个组织中表达量较低，尤其是在果肉中表达量最低。证实LcGRX基因的启动子为荔枝叶片特异性表达启动子。

实施例3植物LcGRX基因启动子表达载体的构建

1)以荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子序列如SEQ IDNO.1所示为模板设计引物对，且引物对分别上加Pst I、EcoR I酶切位点和保护碱基，如下：

正向引物P1：5'-GTGCCCCATGACTTATTTTAT-3'；

反向引物P2：5'-TCTTTCACCAACCTTGCTATT-3'。

以荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子序列为模板进行PCR，PCR扩增条件如下：

反应体系：

反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循环35次后；72℃延伸8min；获得PCR产物1；

3)以如SEQ IDNO.2所示的荔枝类甜蛋白LcTLP基因为模板设计引物对，且引物对分别上加EcoR I、Spe I保护碱基，如下：

正向引物P3：

5'-CG(GAATTC)TCATGAAGCTCTTCAAAATCC-3'，

反向引物P4：5'-GG(ACTAGT)GGGGCAAAAGACAACCTT-3'；

4)以荔枝类甜蛋白LcTLP基因为模板进行PCR，PCR扩增条件如下：

94℃预变性4min；94℃变性30s；61℃退火30s；72℃延伸2min，循环35次后；72℃延伸8min；获得PCR产物2；

5)用Pst I、EcoR I对PCR产物1进行酶切，纯化回收得到回收产物1，用EcoR I、Spe I对PCR产物2进行酶切，纯化回收得到回收产物2，同时，用Pst I、Spe I将pCAMBIA1304载体进行双酶切，去除CaMV35S启动子，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳检测并回收大片段；

6)在10μL体系中，将回收的pCAMBIA1304载体大片段、回收产物1和回收产物2用T4连接酶4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将筛选得到的阳性克隆用Pst I、Spe I进行酶切验证，获得得到表达Gus基因的植物重组表达载体pCAMBIA1304-GRX-TLP。

7)挑取阳性克隆单菌落用于摇菌，提取质粒，经PCR检测和酶切鉴定后送北京华大基因工程技术服务有限公司测序。测序结果确认不同片段的插入顺序，且插入LcGRX基因启动子与SEQ IDNO.1所示的序列一致，构建的植物表达载体为pCAMBIA1304-GRX-TLP，载体如附图2所示。

实施例4基因枪转化与GUS基因瞬时表达验证启动子功能

摘取结果母枝中部无病虫害的成熟功能叶片和刚刚开放的花朵，3h内运回实验室，无菌水清洗干净，吸干多余水分。采摘八成熟“妃子笑”果实且3h内运回实验室，挑选无病虫害的健康果实，0.1％HgCl₂消毒1min后，灭菌水冲洗数次，晾干后，剥取果皮、种子和果肉。“妃子笑”成熟种子在育苗塞中培育出健康幼苗，3个月后，取根组织的伸长区、分生区以及根冠，无菌水冲洗干净,吸干多余水分。以上材料立即用于基因枪转化实验。

微弹载体制备

①称取10mg钨粉，置于2.0ml的无菌离心管中。

②向管中加入1ml 70％的乙醇，充分涡旋混匀3min，然后室温静置15min，3000rpm离心5min。

③弃上清液，加入1ml无菌水，充分涡旋3min，室温静置15min，3000rpm离心5min；用无菌水重复洗涤三次。

④弃上清液，加入50％的甘油(高压灭菌)，使钨粉的终浓度为60mg/ml。

⑤将上述制备的钨粉充分涡旋混匀后取50μL转入另一无菌的1.5mL离心管中。

⑥依次加入5μl质粒(1mg/ml)、50μl的CaCl2(2.5M，高压灭菌)溶液和20μL亚精胺(0.1M，过滤除菌，现配现用)。

⑦将混合物充分涡旋8min，室温静置15min，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，加入150μl的70％的乙醇，涡旋混匀1min，12000rpm离心1min。

⑨弃上清液，加入150μl的无水乙醇，涡旋混匀1min，12000rpm离心1min。

⑩弃上清液，加入50μl的无水乙醇，重悬颗粒，然后将离心管浸入超声波清洗器中10sec，分散颗粒，每个弹孔上样10μl，每次上样可轰击2-3次。

转化受体材料

①超净工作台灭菌后吹风。

②用75％的乙醇擦洗基因枪进行消毒，阻挡网和可破圆片是提前高压灭菌准备好。

③连接高压氦气瓶和基因枪(型号：SJ-500)，用灭菌镊子夹取可裂圆片和阻挡网，并旋紧安装好。

④每次取10μl制作好的微弹，均匀涂布于每个弹孔中。

⑤将装好微弹的弹夹装入基因枪中。

⑥把氦气压力调到3.5MPa，按基因枪使用说明按下扳机轰击受体材料。

⑦每次轰击完，更换弹夹，更换可列圆片和阻挡网，重复4～6步骤，然后轰击转化受体材料。

⑧分别以pCAMBIA1304质粒为阳性对照，钨粉为阴性对照，pCAMBIA1304-GRX-TLP质粒轰击上述荔枝不同组织材料。轰击完的荔枝实验材料置于28℃暗培养24～36h。

GUS组织化学染色

①将转化培养后的受体材料，用无菌水清洗样品数次，用滤纸将样品表面水吸干；

②将荔枝果皮剥出，并用无菌手术刀将基因枪轰击的果皮、种子和叶片，切成小块；

③将切好的样品转至10mL的无菌离心管中，每管中加入5mL的固定液(组份：1％(体积百分浓度)甲醛，0.05M磷酸钠缓冲液，0.05％(质量百分浓度)Triton-100)，放到摇床上200rpm温和摇动30min；

④将固定液去除，用0.05M磷酸钠缓冲液洗涤样品三次，每次于200rpm温和摇动10min；去除用过的缓冲液；

⑤每管中加入600μL的现配制的GUS染色液(配方：50mM磷酸钠缓冲液pH7.0，0.1M铁氰化钾，0.1M亚铁氰化钾，10mM EDTA，0.1％Triton-100，20％甲醛，0.5mMX-gluc)浸没转化材料，于37℃水浴保温1h；

⑥取出材料，用75％的乙醇漂洗20min；

⑦先后用20％乙醇、50％乙醇各浸泡20min；

⑧在显微镜下观察转化材料的GUS的染色结果并拍照。

分析染色结果发现，pCAMBIA1304质粒(阳性对照)在所有组织中均出现了蓝色斑点，表明CaMV35S启动子能调控pCAMBIA1304质粒中的GUS基因表达。钨粉(阴性对照)轰击在所有材料中均未出现蓝色斑点，表明钨粉轰击不会导致荔枝组织出现蓝色斑点，使实验结果出现假阳性。构建的植物表达载体pCAMBIA1304-GRX-TLP在叶片中表达强烈，同时在根、花、果皮和种子中均有微弱表达，但在果肉中没有出现，说明构建的植物表达载体pCAMBIA1304-GRX-TLP能调控GUS基因在荔枝的叶片中特异性高表达，但不能调控其在果肉中表达。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120> 荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子及其应用

<211> 1996bp

<212> DNA

<213> 荔枝叶片特异表达基因LcGRX启动子

<400>

GTGCCCCATGACTTATTTTATGCTTTAGAAATTTATTTTATACATGCAGTTATTGAGATGTGATCTATTGACTTGATAATGACTACTAATATGAAATAATAACTTTTTTTCCAACGTGGCAACAAAATGCTAGGAAGATTTTTTATAAAATCAGAAAAAAGGGCTATTTTAAAAACTTTTTCCTAAACGGTAAACATGAAAGGAGTTACAATATTATTAAAGGGTCGTTTATTTTTTCCACTTAAAATTTAATTGTATCAAATTATATCTATTAAGTTATTTTTGTTTGTATTTTTAAGTGATCAAACCACTTAAAACTATCAAAGAACAATTGAAAAAAATAAGTAAGAATTTTTAATATTTACTTTTTTTCTCCTGATACTTACAAAAAATATATTTGAAAAGTAAAAAATGAATGTTTAAATTGTAAATTATAATATATTAGTTTAATTTTAAGATAGCTTTTCACTTAATTGTAAATCATTTAATGATATTTAAAAGTTTTTATTTCAAATCTATCCTCCCAAAAATAACATAATTTTAAAGTTATCCTAATTTTACATTACTCAAATTTTCTTTTTTTTTTTCCCCTTGATACTTACAAAAAATATATTTACAAAGTAAAATCTAAATACATCGCATCTCAAATTATCTTAGAATTAAACTAATATATTTTAATTTATAATTTGAATATTCATTTTTAATTGTTTTCTTAAATATATTTAAATATATAAATATGGTTAATATTACTATATTTTTTAATCGTATTTTAACTATAGATAAAAAATTATTAATATGTACATAAAAAATGTTTTAGATTTTATTAAATTATTTATTTTCAGATGTTTGTAGTAAATTAATTAAAATTATATAACAGCAAATAAAAAATATATATAAATGTCAACTTATTAGTTTTCAGACAATTTTAAATTTAAAAAACAAACAAGTTTACAATATAATCAGAGGTAAAGAAAAAAAAATATTATTCGGATTTCAAATTTCAGTCATCATTCAGTCTTCAGTAGCACTGTTCAGTCTTCAGACAAAAAAAATAAACAACCTCTTGGACTATCAATATTTAGGGTGCAAATAATCCACACTATATTGTTATAAACAATGTGAGATGGTTTGTCACACAGTTTATTCAAACAAAATAATAAATGAATTGTCTACACTCAAAACAAATTAATATTACATTAAGACTTTAAACATATATAAATACCTTAAAAGGACAACAATTCTTCTAATACCATGCAAATCTCTCCCTCTCTTTTTTCTTTAAAATGTACCACAAATTTGAAATATCAAGTTACTCTTGTTATGGTATATATACATAATTTTCTTATTTTTAGTCCCGGTTATCAATGGGTAAAGAAAATTCTGGAAAATTTCAAGTTGAATATGTGCATATACTATAAAGAAATAGAATTATAGAACTGATTTAAGCTTTGATTGAACAGTATTATTTAGTATGCTTACTATTATTATAGGCGGTTGCTCTTTGCTCTGAATTTTTCTAATGGCAATGACAACGCTAATGTCGTACAGATCTCAGCGATCAAGGACGAATATGCTGAATTGAGATGGACGTTGCCAATTATATCATAAGCACTCTAGATAATATCATATTTGTTGGGCATCATCTACATAGTATCACTTCAACACATTATTTTAGTCACATTTTTCTTGTCTATAGACTATTTAGCTTGATATTGCAAGTTACCATCAAGGGTAGTCTGGGAATCAAAGAAAACATCCTCTTTGGAACATTTTATTCCCTTCCTGTACTGATTCCATCTGGAAACAAATTAGATATGAAATCCCAATCCCACCACCATAATAAAAAAATTCTTGTTATAAATAGACCTCCATGGTTGTTCAAGTCTCCTCACAGCAAAACTTCATCAACTCTCTCAATAACAAGCTTAGTAACATTCAAGACTCCCATTTTTATTTGATTTGCGGCCATGGACACAATAGCAAGGTTGGTGAAAGA

<210> 2

<211> 671bp

<212> DNA

<213> 荔枝类甜蛋白LcTLP基因

<400> 2

TCATGAAGCTCTTCAAAATCCTCCTTTCCTTTTTTGCCATTGCACTCTCCACCACCTTGGTTTATGCAGCCAAATTTGACATCACCAACAACTGTCCTGAGACTATTTGGGCAGCTGCCGTGCCTGGTGGTGGCAAGAAACTAGACAAAGGCGAAACATGGACCATAACTGCCGCCCCAGGTACCAAAGAAGCCAGAATTTGGGGACGTACCAAGTGCAATTTCGATGCCAGCGGGAAAGGCAAGTGTGAGACAGGTGACTGCAACGGCGTCCTCGAGTGCCAAGGCTATGGATCCCCTCCCAATACCTTGGCTGAGTACGCGTTGCAGCAGTTCAACAACATGGACTTCATTGACATGTCCAACATTGATGGTTTTAATGTCCCAATGGAGTTCAGCTCCACCTCTCCTGGATGCAACCGTGTGATCAAATGCACGGGTGACTTGGTAGGGCAGTGCCCTAATGAGCTCAAAGTACCAGGAGGATGTCAAGGGCCATGCTGGGTGTTCAAGACCAACGAGCACTGTTGCAATTCTGGTAGTTGTGGACCTACAGATTTCTCCAGGTTTTTCAAAGATAGGTGCCCGGATGTTTATAGTTATCCAAAAGATGATGCAACAAGTGTTTTTACTTGCCCTAGTGGAACAGACTATAAGGTTGTCTTTTGC