一种麻疯树的叶盘直接再生方法

专利名称：：一种麻疯树的叶盘直接再生方法
技术领域：
：本发明涉及植物组织培养的
技术领域：
，具体涉及一种麻疯树的叶盘直接再生方法。
背景技术：
：麻疯树(Jatrophacurcas.L.)是生长在热带和亚热带的落叶灌木或小乔木。麻疯树种子含油量高，可达40%-60%，超过油菜和大豆等常见的油料作物，并且麻疯树油作为生物柴油可用于各种柴油发动机，是一种重要的能源植物。但是目前麻疯树种植区域狭窄，仅分布在亚洲，非洲和美洲的热带和亚热带地区，我国自然分布约有l.l万hm2，主要集中在四川，云南，贵州。并且麻疯树产量较低，目前人工种植的麻疯树林每亩仅可产100-300kg果实，约可加工30-100kg生物柴油。窄分布和产量低限制了其作为能源植物进行大规模栽培和产业化。通过基因工程的方法可以改良麻疯树的抗性、产量，油质等性状，从而扩大麻疯树分布范围，增加结实产量以及改变麻疯树种子含油量和油质。而麻疯树的遗传改良和优良品种的快繁需要建立高效的叶盘再生体系。
发明内容本发明旨在为麻疯树的基因改良与组织培养提供麻疯树叶盘高效再生方法。为实现麻疯树的基因转化，快速繁殖奠定基础，推进麻疯树的产业开发。为了达到上述目的，本发明麻疯树叶盘直接再生方法包括A、选取温室中一年生的麻疯树第2、3、4、5片展开叶片作为外植体，进行表面消毒处理后切成5-10mi/大小；B、将外植体叶盘近轴端朝上接种于培养基中直接诱导不定芽；培养基为MS基本培养基添加30gL—工蔗糖、4-8gL—工琼月旨、0.2-2.OmgL—工TDZ、0.1-1.5mgL—工IBA、0.05-3mgL—4a、0.5-8mg.L—V肖普钠；培养方式先暗培养10-14d，然后转换至光照条件下培养，温度为25士2。C，光照强度为45-55ymo1m—2s—、光照16hd—、培养14-16d;c、将不定芽进行延长培养，再进行生根培养后移栽。A步中优选第4片展开叶片作为外植体；B步中MS基本培养基优选添加30gL—工蔗糖、5g.L—4京脂、lmg'L—工TDZ、0.5mg!^IBA、1.5mg!^BA、2mgL—^肖普钠;培养方式先暗培养10-14d，然后转换至光照条件下培养，温度为25。C，光照强度为50ymo1*m—2s—、光照16hd—、培养2周。所述A步中所述的消毒处理是采用15-25。/。的NaC10消毒外植体5-30min。所述C步中所述延长培养所用的培养基为MS基本培养基添加30g'L—i蔗糖、4-8gL—4京脂、0.05-0.8mgL—4a和0.01-0.02mgL—^ba;培养方式光照培养18-22天，温度为23士2°C，光照强度为45-55ymolm—2s—、光照16hd一1。所述C步中所述的生根培养所用的培养基是在MS基本培养基中添加30g'L—工蔗糖、4-8gL—丄琼脂和0.08-0.5mgL—^BA。本发明具有以下突出的优点其一，不定芽再生速度快，叶盘经过4星期时间的诱导，即可再生出大量的不定芽；其二，再生频率高，经过4星期时间的诱导，有88%的叶盘诱导出不定芽，显著高于对照，远高于国际上所报道的最高水平，如表l所示；其三，能促进麻疯树基因转化的发展，高效的再生频率是麻疯树基因转化的基础；其四，麻疯树作为生物质能源开发，有益于缓解我国乃至能源能源危机；其五，本发明方法易于实施，便于推广。本发明对培养基激素种类和激素浓度进行了调整，特别是增加了TDZ的浓度，还增加了新的植物激素硝普钠。TDZ是一种高活性类细胞激动素，与其他激素的配合使用能获得更加理想的效果。硝普钠是一氧化氮供体(no)，一氧化氮作为一种信使分子能够调节植物的生长发育，no还与激素相互作用影响植物的生长。首先，细胞分裂素能快速刺激no的产生，再次，生长素存在的情况下no又能促进叶片原生质体细胞分裂与体细胞胚的形成，并且no与生长素相互作用共同调控植物细胞的脱分化与再分化过程，所以no在细胞分裂素和生长素之间起到"桥梁"作用，故能促进不定芽的分化。另外改变了外植体的选取方式，通过直接采取温室中培育的麻疯树的不同发育时期的幼嫩叶片，增加了外植体的来源和得到了最适合诱导不定芽的叶片的成熟度，使用叶片作为外植体比上下胚轴和子叶有稳定的外植体来源并且能够保持优良无性系的性状，并且操作更加简便，易于实施。表l目前报道的麻疯树叶片植株再生技术目前报道的技术诱导时间(周)诱导频率(y。)2003年，陆伟达[l]72007年,Johnson[2G653.3■7年,MUkheijeep]1456[l]陆伟达，魏琴，唐琳，等.麻疯树愈伤组织的诱导及快速繁殖[J].应用与环境生物学报，2003，9(2):127-130.DeoreAC,JohnsonTS.High-frequencyplantregenerationfromleaf-discculturesofJatrophacurcasL:animportantbiodieselplant[J].PlantBiotechiiolR印，2008，2(1):7-11.TimirBJ，MukherjeeP，Datta丽，SomaticembryogenesisinJatrophacurcasLinn.，animportantbiofuelplant[J].PlantBiotechiiolRep，2007，1(3):135-140.具体实施例方式以下实施例和对比例中外植体的选取，培养基的配制以及培养方式等按照表2进行。1，麻疯树外植体选取和表面消毒等处理选取温室中一年生的麻疯树展开叶片作为外植体，采用20。/。的NaC10消毒20min，用灭过菌刀片将其切成大小约为9mm2。2，将外植体置于培养基中直接诱导出不定芽，步骤包括A、培养基的配制培养基为MS基本培养基按照表2添加成分，121°C，灭菌15min，待培养基冷却至5(TC时添加硝普钠；B、培养方式将叶盘近轴端朝上接种于培养基中，先暗培养，然后转换至光照条件下培养，温度为25。C，光照强度为50ymolm—2s—\光照16hd—4咅养。3，将诱导出的不定芽进行延长培养A、培养基的配制培养基为基本培养基添加30gL—工蔗糖和5gL—4京脂0.1-0.5mgL—工BA，0.OlmgL—工IBA;B、培养方式光照培养20天，温度为25。C，光照强度为50ymo1'm—2s—\光照16h'd-、4，不定芽的生根培养培养基为MS基本培养基添加30gL—工蔗糖和5gL—4京脂和0.1-0.5mgL—^BA。5，生根的不定芽的移栽生根的不定芽直接移栽至温室中，成活率达到93%。5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>以上实施例和对比例体现了不同浓度的植物生长调节剂、不同的外植体、不同培养方式等对诱导率有影响，说明按照本发明方法明显提高了不定芽诱导率，尤其实施例2达到了88%，且诱导出的不定芽生长状态好，能够进行延长和生根，从外表上看没有变异产生。本发明不局限于具体的实施方式，只要是采用了本发明提供的组培方式，培养基成分，培养条件以及操作方式，在不脱离本发明构思的前提下，无论采用何种组织培养方式，进行何种等同变换和修饰，都将落入本发明的保护范围之内。权利要求1.一种麻疯树叶盘的直接再生方法，其特征在于，包括A、选取温室中一年生的麻疯树第2、3、4、5片展开叶片作为外植体，进行表面消毒处理后切成5-10mm2大小；B、将外植体叶盘近轴端朝上接种于培养基中直接诱导不定芽；培养基为MS基本培养基添加30g·L-1蔗糖、4-8g·L-1琼脂、0.2-2.0mg·L-1TDZ、0.1-1.5mg·L-1IBA、0.05-3mg·L-1BA、0.5-8mg·L-1硝普钠；培养方式先暗培养10-14d，然后转换至光照条件下培养，温度为25±2℃，光照强度为45-55μmol·m-2s-1，光照16h·d-1，培养14-16d；C、将不定芽进行延长培养，再进行生根培养后移栽。2.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，所述A步中选取第4片展开叶片作为外植体；B步中MS基本培养基添加30gL-l蔗糖、5gL-l琼脂、lmgL-1TDZ、0.5mgL-IIBA、1.5mgL-1BA、2mgL-l硝普钠；培养方式先暗培养10-14d，然后转换至光照条件下培养，温度为25。C，光照强度为50ymo1'm-2s-l，光照16hchl，培养2周。3.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，A步中所述的消毒处理是采用15-25。/。的NaC10消毒外植体5-30min。4.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，C步中所述延长培养所用的培养基为MS基本培养基添加30gL-l蔗糖、4-8gL-l琼脂、0.05-0.8mgL-1BA和0.01-0.02mgL-1IBA;培养方式光照培养18-22天，温度为23士2。C，光照强度为45-55ymolm-2s-l，光照16hd-l。5.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，C步中所述的生根培养所用的培养基是在MS基本培养基中添加30gL-l蔗糖、4-8gL-l琼脂和O.08-0.5mgL—IIBA。全文摘要本发明公开了一种麻疯树的叶盘直接再生方法。其选取温室中一年生的麻疯树叶片作为外植体，接种于培养基中直接诱导不定芽；培养基为MS基本培养基添加30g·L^-1蔗糖、4-8g·L^-1琼脂、0.2-2.0mg·L^-1TDZ、0.1-1.5mg·L^-1IBA、0.05-3mg·L^-1BA、0.5-8mg·L^-1硝普钠；培养方式先暗培养10-14d，然后转换至光照条件下培养14-16d；最后将诱导出的不定芽进行延长培养，再进行生根培养后移栽。不定芽诱导率高达88％。本发明旨在为麻疯树的基因改良与组织培养提供麻疯树叶盘高效再生方法。为实现麻疯树的基因转化，快速繁殖奠定基础，推进了麻疯树的产业开发。文档编号A01H4/00GK101658139SQ20091030781公开日2010年3月3日申请日期2009年9月27日优先权日2009年9月27日发明者刘伯斌,卢孟柱,玲李,陈介南申请人:中南林业科技大学