专利名称：麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种植物种子蛋白质分离方法，更特别的涉及一种麻疯 树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法。
二背景技术：
麻疯树(/a"op/ a cwrcas L.)是大戟科麻疯树属多年生落叶亚乔 木植物，生长快，当年可开花结果，种子含油高，还具有抗干旱、耐贫 瘠、抗逆性强。随着能源危机和环境污染问题的日益加剧，可再生能源 的开发利用迫在眉睫。正A^疯树的这些优点使其成为生物质能研究中 一个被相当看好的树种。联合国已将麻疯树及其提取物用于贫穷的干热 河谷地区生态建设，并作为扶贫的重大项目加以扶持。在我国四川、云 南等省水土流失严重区域，麻疯树在保水固土，防沙化、增加有机土质、 建防护林等方面发挥了重要作用，并被国家列为发展再生能源生物柴油 的重要树种。麻疯树种子含有大量的油分，除主要做生物燃料外，还可 做肥皂、化妆品，同时含有多种活性成分可用于农药和医药领域。因此 广泛分布于热带亚热带地区的麻疯树是集环保、能源建设、生态建设、 医药产品、扶贫等为一体的多年生木本。
麻疯树种子含有很多有用蛋白质，对其研究较多的是一种麻疯树毒 蛋白质(Curcin),又称核糖体失活蛋白(RIPs)，它具有抑制真核细胞 无细胞系统蛋白质合成的作用，对肿瘤癌症、真菌病害有较强的抑制和 杀伤能力，在临床医学及农业应用上表现出诱人的前景。
麻疯树胚乳约占种子重量的55%以上，是储藏脂肪、蛋白等有用 成分的重要部位，其蛋白质含量约占种仁干重的25%以上。但对其蛋 白质组分和种类至今知之甚少，为了很好的研究麻疯树种子生物学问 题，开发和利用其经济价值，必须建立高效的麻疯树种子胚乳蛋白质高 分辨率的分离方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法。
本发明的这些以及其他目的将通过下列详细描述和说明来进一步体 现和阐述。
本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法，包括制备含 蛋白干粉的样品緩冲液、第一向等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳、电泳凝 胶条平衡、第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、电泳凝胶染色和凝胶扫描 及图像分析步骤。
在本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法中，所述的 制备含蛋白干粉的样品緩冲液是将0.5-1.5毫克蛋白干粉溶解在50-150jiL含有9 M尿素、4%乙基苯基聚乙二醇、2%Ampholine两性电解 质和5%巯基乙醇、余量去离子水的样品緩沖液中。
在本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法中，所述的 第一向等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤是配制含3. 6%聚丙烯酰胺凝 胶、脂尿素、2%乙基苯基聚乙二醇、各2. 5%Ampholine两性电解质、 余量去离子水、pH3. 5-10以及pH5-8的凝胶，注入到内径为3咖高 度为15cm的玻璃管里，凝胶高度为13cm，之上注入约0.5cm高的蒸馏
水，静放2小时以上待凝胶完全聚合之后，吸干凝胶柱顶部的蒸馏水， 将玻璃管安装在电泳漕上。取麻疯树种子胚乳蛋白质30-加于凝胶上 端，再用1/2的样品緩冲液覆盖样品。样品端(上端)加上0. 02N氢氧 化钠阴极电泳緩冲液，另一端(下端)加上0. 02N磷酸阳极电泳緩冲液， 连通电源在电压为200V条件下电泳30分钟后，升到400V电压电泳15 小时，最后升800V电泳1小时进行蛋白质的等电聚焦。
在本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法中，所述的 电泳凝胶条平衡步骤是在等电聚焦完成后，将凝胶从玻璃管内取出，置 于含有50mM Tris-HCl、 10%甘油、2.5%SDS、 5%巯基乙醇的平衡液 中，在60次/分钟的摇床上摇动15分钟，并重复1次。
在本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法中，所述的 第二向SDS聚丙蜂酰胺凝胶电泳步骤是先配制聚丙烯酰胺分别为15% 分离胶和4%浓缩胶的垂直板胶，然后将平衡好的胶条转移到的上端， 用1%的琼脂糖密封，置于电泳槽上，加满含0. 3%Tris、 1.44%甘氨 酸、0. 1%SDS、余量去离子水的电极緩沖液，在电流为30mA的条件下 电泳约3小时。
在本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法中，所述的 电泳凝胶染色步骤是在第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤完成后，取 下凝胶，置于染色盒中加入100ml含40%乙醇、10%水乙酸和余量去 离子水的固定液中，在60次/分钟的摇床上摇动1小时，换上100ml含 0.116%考马斯亮蓝R- 250、 25%乙醇、8 %冰乙酸和余量去离子水的 染色液，在60次/分钟的摇床上摇动1小时；倒出染色液，加入100ml 含25%乙醇、8%冰乙酸和余量去离子水的脱色液，在60次/分钟的摇床上摇动30分钟，重复3次，得到蛋白点鲜明凝胶电泳图谱(如图1 所示)。
在本发明的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法中，所述的 凝胶扫描及图像分析步骤是将考马斯亮蓝染色后的凝胶用UMAX扫描仪
在参数为256阶灰度、600dpi条件下透射扫描，所得图像用ImageMaster 2D Platinum软件(Amersham Bioscience)进行分析，结果表明，凝 胶上可检测到蛋白点至少有l，OOO多个，其蛋白质的分布主要集中在等 电点(p/)为4.5-6、分子量为35 - 65kDa区域，为一些微酸性、中 等分子量的蛋白质类群，在低分子量区域发现有20多个高丰度表达的 蛋白质(如图2所示)。
本发明采用双向电泳克服了常规HPLC分离法等不能将蛋白质混合 液按等电点、分子量分开和无法知道每个蛋白质丰度等缺点，创建了麻 疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离技术，可清楚、直观的呈现每个蛋 白质的等电点和分子量以及表达量，是其它分离方法所无法比拟的，是 蛋白质组学研究最重要、最有效的手段之一。并且由于第一向等电聚焦 为自制管胶，pH梯度可自行调制，同时价格便宜，在科学研究和生产 实践中具有^f艮大的应用前景。
在本申请中，可以使用市售的用于电泳的麻疯树种子胚乳蛋白质， 也可以使用与本申请同日申请的题目为 一种麻疯树种子胚乳蛋白质提 取方法所提取的麻疯树种子胚乳蛋白质，该专利申请的所有内容在此列 入使用、参考。 四
图m疯树种子蛋白质双向电泳蛋白质组表达谱。
图2是麻疯树种子蛋白质组表达镨图象数字分析结果。 五具体实施例方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但实施例仅用于说明， 并不能限制本发明范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、量均为以总重量为1^5出的重量 单位，所有的原料均可以从市场购得，在各组成液中，余量是去离子水。 实施例1
按以下方法进行
1、 配制含蛋白干粉的样品緩沖液
将1毫克蛋白千粉溶解在含有100微升9 M尿素、4%乙基苯基聚 乙二醇、2%Ampholine两性电解质、5 %巯基乙醇和余量去离子水的样 品緩沖液中。
2、 第一向等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳
配制含3. 6%聚丙烯酰胺凝胶、8M尿素、2%乙基苯基聚乙二醇、 各2. 5 % Ampholine两性电解质pH3. 5-10以及pH5 - 8的凝胶，注入到 内径为3mm高度为15cm的玻璃管里，凝胶高度为13cm，之上注入约0. 5cm 高的蒸馏水，静放2小时以上待凝胶完全聚合之后，吸干凝胶柱顶部的 蒸馏水，将玻璃管安装在电泳漕上。取麻疯树种子胚乳蛋白质加 于凝胶上端，再用1/2的样品緩冲液覆盖样品。样品端(上端)加上0. 02N 氬氧化钠阴极电泳緩冲液，另一端(下端)加上0. 02N磷酸阳极电泳緩 冲液，连通电源在电压为200V条件下电泳30分钟后，升到400V电压 电泳15小时，最后升800V电泳1小时进行蛋白质的等电聚焦。
3、 电泳凝胶条平衡
在等电聚焦完成后，将凝胶从玻璃管内取出，置于含有50mM Tris-HCl、 10%甘油、2. 5%SDS、 5%巯基乙醇的平衡液中，在60次/ 分钟的摇床上摇动15分钟，并重复1次。
4、 第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
先配制聚丙烯酰胺分别为15%分离胶和4%浓缩胶的垂直板胶，然 后将平衡好的胶条转移到的上端，用1%的琼脂糖密封，置于电泳槽上， 加满含O. 3%Tris、 1. 44%甘氨酸、0. 1 % SDS和余量去离子水的电极緩 沖液，在电流为30mA的条件下电泳约3小时。
5、 电泳凝胶染色步骤
在第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤完成后，取下凝胶，置于染 色盒中加入100ml含40%乙醇、10%冰乙酸和余量去离子水的固定液 中，在60次/分钟的摇床上摇动1小时，换上100ml含0. 116%考马斯 亮蓝R- 250、 25%乙醇、8%冰乙酸和余量去离子水的染色液，在60 次/分钟的摇床上摇动1小时；倒出染色液，加入100ml含25%乙醇、 8%水乙酸和余量去离子水的脱色液，在60次/分钟的摇床上摇动30分 钟，重复3次，得到蛋白点鲜明凝胶电泳图谱(如图1所示)。
6、 凝胶扫描及图像分析
将考马斯亮蓝染色后的凝胶用UMAX扫描仪在参数为256阶灰度、 600dpi条件下透射扫描，所得图像用ImageMaster 2D Platinum软件
(Amersham Bioscience)进行分析，结果表明，凝胶上可^r测到蛋白 点至少有l，OOO多个，其蛋白质的分布主要集中在等电点(p/)为4.5
-6、分子量为35 - 65kDa区域，为一些农(酸性、中等分子量的蛋白质 类群，在低分子量区域发现有20多个高丰度表达的蛋白质(如图2所 示)。
实施例2 按如下步骤进行提取
A、 取200毫克成熟风干麻疯树种子胚乳，用研钵研磨成精细的粉 末(粒径为0. lmm左右)，然后加入2毫升预冷匀浆緩沖液，该緩沖液 含有20 mM Tris-HCl、 250mM蔗糖、10mM乙二胺四乙酸、1. 0 mM 二硫 叔糖醇和1。/。辛基苯氧基聚乙氧乙醇X-100、余量为去离子水。在冰上 研磨至匀浆(研磨时间为IO分钟，转速为120转/分钟左右)；
B、 将匀浆转移到离心管中，4。C下于15000g离心15分钟，弃沉淀， 在上清液中加入10% (v/v)的三氯乙酸，然后在冰浴中沉淀40分钟；
C、 与B步骤相同条件下再次离心后，去掉上清液，沉淀用丙酮清 洗后离心，再取沉淀；
D、 重复用丙酮清洗2-3次，4。C下于15000g离心40分钟，去上 清液，将沉淀真空干燥得到蛋白干粉。
权利要求
1、一种麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法，其特征在于包括制备含蛋白干粉的样品缓冲液、第一向等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳、电泳凝胶条平衡、第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、电泳凝胶染色和凝胶扫描及图像分析步骤。
2、 根据权利要求1所述的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法， 其特征在于所述的制备含蛋白干粉的样品緩冲液是将0.5-1.5毫克蛋 白干粉溶解在50 - 150 yl含有9 M尿素、4%乙基苯基聚乙二醇、2% Ampholine两性电解质和5 %巯基乙醇的样品緩冲液中。
3、 根据权利要求1所述的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法， 其特征在于所述的第一向等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤是配制含 3.6%聚丙烯酰胺凝胶、8M尿素、2%乙基苯基聚乙二醇、各2.5% A即holine两性电解质，pH3. 5 - 10以及pH5 - 8的凝胶，注入到内径为 3mm高度为15cm的玻璃管里，凝胶高度为13cm,之上注入约0. 5cm高 的蒸馏水，静放2小时以上待凝胶完全聚合之后，吸干凝胶柱顶部的蒸 馏水，将玻璃管安装在电泳漕上。取麻疯树种子胚乳蛋白质3(^1加于 凝胶上端，再用1/2的样品緩冲液覆盖样品。样品端加上0. 02N氢氧化 钠阴极电泳緩冲液，另一端加上0. 02N磷酸阳极电泳緩沖液，连通电源 在电压为200V条件下电泳30分钟后，升到400V电压电泳l5小时，最 后升800V电泳1小时进行蛋白质的等电聚焦。
4、 根据权利要求1所述的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法， 其特征在于所述的电泳凝胶条平衡步骤是在等电聚焦完成后，将凝胶从玻璃管内取出，置于含有50mM Tris-HCl、 10%甘油、2.5%SDS、 5% 巯基乙醇的平衡液中，在60次/分钟的摇床上摇动15分钟，并重复1 次。
5、 根据权利要求1所述的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法， 其特征在于所述的第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤是先配制聚丙烯 酰胺分别为15%分离胶和4%浓缩胶的垂直板胶，然后将平衡好的胶条 转移到的上端，用1%的琼脂糖密封，置于电泳槽上，加满含O. 3%Tris、 1.44%甘氨酸、0.1%SDS的电极緩沖液，在电流为30mA的条件下电泳 约3小时。
6、 根据权利要求1所述的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法， 其特征在于所述的电泳凝胶染色步骤是在第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电 泳步骤完成后，取下凝胶，置于染色盒中加入100ml含40%乙醇、10 %冰乙酸的固定液中，在60次/分钟的摇床上摇动1小时，换上100ml 含0. 116%考马斯亮蓝R- 250、 25%乙醇、8%冰乙酸的染色液，在60 次/分钟的摇床上摇动1小时；倒出染色液，加入100ml含25%乙醇、 8%冰乙酸的脱色液，在60次/分钟的摇床上摇动30分钟，重复3次， 得到蛋白点鲜明凝胶电泳图谱。
7、 根据权利要求1所述的麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法， 其特征在于所述的凝胶扫描及图像分析步骤是将考马斯亮蓝染色后的凝 胶用UMAX扫描仪在参数为256阶灰度、600dpi条件下透射扫描，所得 图j象用ImageMaster 2D Platinum寿欠件进4亍分析。
全文摘要
本发明公开了一种麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离方法，包括制备含蛋白干粉的样品缓冲液、第一向等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳、电泳凝胶条平衡、第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、电泳凝胶染色和凝胶扫描及图像分析等步骤。本发明采用双向电泳克服了常规HPLC分离法等不能将蛋白质混合液按等电点、分子量分开和无法知道每个蛋白质丰度等缺点，创建了麻疯树种子胚乳蛋白质高分辨率的分离技术，可清楚、直观的呈现每个蛋白质的等电点和分子量以及表达量。
文档编号G01N21/84GK101173904SQ20071008703
公开日2008年5月7日 申请日期2007年3月15日 优先权日2007年3月15日
发明者刘玉君, 沈世华, 平 苟 申请人:云南神宇新能源有限公司