专利名称：一种利用有色稻米发酵废糟培养豹斑毒鹅膏的方法
技术领域：
一种利用富含微量元素的有色稻米发酵废糟培养豹斑毒鹅膏的方法。涉及发酵法培养豹斑毒鹅膏菌丝体，是将豹斑毒鹅膏子实体接种至新鲜的固体斜面上进行培养，待斜 面长好后接种至含较低浓度的富含微量元素的有色稻米发酵废糟的液体培养基中进行种 子的培养，即对菌种加以驯化；再接入添加了足量富含微量元素的有色稻米发酵废糟的液 体培养基中进行深层液体发酵培养。豹斑毒鹅膏菌又名豹斑毒伞，属鹅膏菌属鹅膏菌科伞 菌目。含有与毒蝇鹅膏菌相似的毒素及豹斑毒伞素等毒素。豹斑毒鹅膏的毒素，尤其是毒 蝇碱，对蝇虫具有明显的致死力，是一种很好的生物杀虫剂。但豹斑毒鹅膏人工培养生长速 度较慢，且发酵菌丝体得率较低。富含微量元素的有色稻米通过微生物发酵加工成功能酒 酿后会产生发酵废糟，发酵废糟中仍含有较高含量的未被微生物转化的微量元素、蛋白质 以及丰富的C、N源，所以利用该发酵废糟培养豹斑毒鹅膏菌丝体可得到较多的菌丝体混合 液。这样既可提高该菌人工培养菌丝体产率，又充分消化和利用了有色稻米加工副产物。发 酵结束后，可将里面的杀病虫活性粗提物提出，以用于防治林木病虫。
背景技术：
鹅膏菌是世界性分布的大属，隶属于真菌界、担子菌门、担子菌纲、蘑菇目、鹅膏 科，由Persoon在1797年确立。由于鹅膏菌属真菌于人类的生活息息相关，因而历来受到 真菌学家的重视，其中关于鹅膏毒素的研究也十分丰富。由于鹅膏菌绝大多数为外生菌根 菌，与高等植物形成共生关系，很难进行人工培养。因此人工培养鹅膏菌，进而从中提取稀 有的同时又是生物学研究中有着重要价值的鹅膏毒素，是众多真菌学家长期以来的一个愿 望。目前，已获得人工纯培养的鹅膏菌约有13种。在所有已经获得纯培养的种类中，有几种 如毒蝇鹅膏，赭盖鹅膏是比较容易培养的，而有的种类尤其是一些剧毒种类虽然有可以培 养的报道，但其生长及其缓慢，发酵所得菌丝体中有效成分含量很低。豹斑毒鹅膏菌又名豹 斑毒伞，属鹅膏菌属鹅膏菌科伞菌目，含有与毒蝇鹅膏菌相似的毒素及豹斑毒伞素等毒素。 豹斑毒鹅膏的毒素，尤其是毒蝇碱，对蝇虫具有明显的致死力，是一种很好的生物杀虫剂。有色稻米，是在水稻生长发育过程中通过以微量元素富积技术为核心而培育出的 具有高含量的微量元素营养功能稻米，这些有色稻米以其果皮具有色素沉淀和微量元素而 得名。例如，高产富硒杂交红米611A/R319是四川农业大学水稻研究所与四川大学共同研 究的高产杂交红米，该杂交红米同普通红米一样，含有众多对人体健康有益的活性功能单 元，如花青素、黄酮、生物碱、留醇、强心甙等，在抗炎、抗过敏、改变体内酶活性、改善微循 环、增加冠状动脉血流量、提高机体免疫功能、抗氧化和延缓衰老等方面意义重大。此外，还 含有较高的蛋白质和硒、铁、锌等微量元素。经检测，有色稻米通过微生物发酵加工成功能 酒酿后产生的发酵废糟含有较高含量的未被微生物转化的微量元素以及丰富的C、N源。本方法利用富含微量元素的有色稻米发酵废糟培养豹斑毒鹅膏，不仅发酵生成的 菌丝体产量较多，而且其有效成分的含量高，同时利用了有色稻米加工产生的副产物，是一 种经济有效的培养鹅膏菌的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用有色稻米发酵废糟培养豹斑毒鹅膏的方法。本发明的技术方案将豹斑毒鹅膏子实体接种至新鲜的固体斜面上进行培养，待 斜面长好后接种至含较低浓度的富含微量元素的有色稻米发酵废糟的液体培养基中进行 种子的培养，即对菌种加以驯化；再接入添加了足量富含微量元素的有色稻米发酵废糟的 液体培养基中进行深层液体发酵培养。由于有色稻米发酵废糟中含有丰富的硒 、铁和锌等 微量元素以及丰富的C、N源，所以该混合发酵液中营养物质丰富。这样既可提高该菌人工 培养菌丝体产率，又充分消化和利用了有色稻米加工副产物。发酵结束后，将菌丝体中杀病 虫活性成分进行粗提，以用于林木病虫防治。步骤为1)待用菌种的培养出发菌株为豹斑毒鹅膏菌；①斜面培养培养基配方以g/L计马铃薯200、琼脂20、葡萄糖20、硫酸镁2. 0、磷酸二氢钾 3. 0，富含微量元素的有色稻米发酵废糟2. 5，pH为6 ；培养方法取豹斑毒鹅膏菌子实体中心部分接种于新鲜的斜面上，在28°C下培养 30天左右；②500mL —级摇瓶种子培养，装液量150mL 培养基配方以g/L计马铃薯200、葡萄糖20、硫酸镁2.0、磷酸二氢钾3.0、维生素 B10. 01，蛋白胨5，富含微量元素的有色稻米发酵废糟2. 5，pH为6 ；培养方法将培养好的斜面接种至事先灭菌的摇瓶中，在28士 1°C下，转速IlOrpm 下培养30天；③IOOOmL 二级摇瓶种子培养，装液量400mL 培养基配方与一级摇瓶种子培养基配方相同；培养方法将培养好的一级种子以10%的接种量接种至事先灭菌的摇瓶中，在 28 士 1°C下，转速IlOrpm下培养30天，即成待用菌种；2) 50L 一级液体种子培养，装液量25-30L ①一级液体种子培养基配方以g/L计葡萄糖10、麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸 皮汁、酵母膏3. 0、维生素B1O. 01、硫酸镁2. 0、磷酸二氢钾3. 0、富含微量元素的有色稻米发 酵废糟5，pH为6;②控制工艺在0. IMpa下灭菌30分钟，冷却后按接种量5%-10%接入待用菌种， 温度28 士 1°C，罐压0. 05Mpa，通气量1 0. 3，V/V，搅拌转速IOOrpm ；③转罐标准发酵时间30-40天，菌丝球上浮三分之一，镜检有锁状联合，无杂菌；3) 500L 二级液体种子培养，装液量250-300L ①培养基配方与一级液体种子配方相同；②控制工艺在0. IMpa下灭菌30分钟，冷却后按接种量10% -15%接入一级种 子，温度28 士 1°C，罐压0. 05Mpa，通气量1 0. 3，V/V，搅拌转速IOOrpm ；③转罐标准发酵时间30-40天，菌丝球上浮三分之一，镜检有锁状联合，无杂菌；
4) 3000L深层液体发酵培养，装液量1800L ①发酵培养基配方以g/L计葡萄糖5、麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁、酵母 膏3. 0、维生素B1O. 01、硫酸镁2. 0、磷酸二氢钾3. 0、富含微量元素的有色稻米发酵废糟10， PH 为 6 ；②控制工艺在0. IMpa下灭菌30分钟，冷却后按接种量10% -15%接入二级种 子，温度28 士 1°C，罐压0. 05Mpa，通气量1 0. 3，V/V，搅拌转速IOOrpm ；
③放罐标准发酵时间30-40天，菌丝球上浮二分之一，镜检有锁状联合，菌丝球 不能自溶；5)杀病虫活性粗提物提取将上述培养液超声破碎2_3h，过滤浓缩后，用0. 22 μ m 滤膜过滤除菌即得。6)杀病虫活性粗提物成分鉴定将所提出的粗提物用GC-MS分析其所含毒素成 分。本发明的有益效果本发明利用富含微量元素的有色稻米发酵废糟进行纯种液体 深层发酵培养豹斑毒鹅膏菌体，大大提高了产量。本发明主要采用富含微量元素有色稻米 发酵废糟，污染小、成本低、工艺简便、科技含量高、有效成分含量高、附加值高，适宜工业化 生产。
具体实施例方式1、待用菌种的培养将豹斑毒鹅膏菌子实体接种至事先灭好菌的用上述斜面配 方配制的一只空白斜面上，在28°C培养30天后将斜面上的菌体刮入事先灭好菌的装有适 量无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡10分钟，制成菌悬液。吸4ml该菌悬液于事先灭好 菌的含有较低浓度高产富硒杂交有色稻米发酵废糟的一级摇瓶种子液体培养基中(装液 量150mL/500mL)，在28°C，转速IlOrpm下培养30天得一级摇瓶种子；无菌条件下，将培养 好的一级摇瓶种子一瓶倒入事先灭好菌的用上述二级摇瓶种子配方配制的含有较低浓度 高产富硒杂交有色稻米发酵废糟的液体培养基中(装液量400mL/1000mL)，在28°C，转速 IlOrpm下培养7_14天，长好后将两瓶种子液合并即成待用菌种。2、一级液体种子培养按上述一级液体种子培养基配方，配制比一级摇瓶种子液 体培养基中高产富硒杂交有色稻米发酵废糟浓度高一倍的一级液体种子培养基，在0. IMpa 下灭菌30分钟冷却后接入摇瓶种子。按上述一级液体种子培养参数培养。采用50L全自 动发酵罐，装液量为25-30L。3、二级液体种子培养按上述二级液体种子培养基配方，配制比二级摇瓶种子液 体培养基中高产富硒杂交有色稻米发酵废糟浓度高一倍的二级液体种子培养基，在0. IMpa 下灭菌30分钟冷却后接入一级种子。按上述二级液体种子培养参数培养。采用500L全自 动发酵罐，装液量为250-300L。4、深层液体发酵培养采用3000L发酵罐，装液量为1800L。按上述发酵培养基配 方，配制比二级液体种子培养基中高产富硒杂交有色稻米发酵废糟浓度高一倍的深层液体 发酵培养基，相同条件灭菌后接入二级液体种子。按上述发酵罐的培养参数培养。所得菌 丝体干重为30. 6kg。5、杀病虫活性粗提物提取将上述培养液超声破碎2_3h，过滤浓缩后，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌即得。 6、杀病虫活性粗提物成分鉴定经GC-MS分析后， 杀病虫活性粗提物成分主要包 括α -amanitin、毒蝇碱、鹅膏蕈氨酸和异鹅膏胺四种主要成分。
权利要求
一种利用富含微量元素的有色稻米发酵废糟培养豹斑毒鹅膏的方法，其特征是将豹斑毒鹅膏子实体接种至新鲜的固体斜面上进行培养，待斜面长好后接种至含较低浓度的富含微量元素的有色稻米发酵废糟的液体培养基中进行种子的培养，即对菌种加以驯化；再接入添加了足量富含微量元素的有色稻米发酵废糟的液体培养基中进行深层液体发酵培养；由于富含微量元素的有色稻米发酵废糟中含有丰富的硒、铁和锌等微量元素以及丰富的C、N源，所以该混合发酵液中营养物质丰富，这样既可提高该菌人工培养菌丝体产率，又充分消化和利用有色稻米加工副产物；发酵结束后，将菌丝体中杀病虫活性成分进行粗提，以用于林木病虫防治；步骤为1)待用菌种的培养出发菌株为豹斑毒鹅膏菌；①斜面培养培养基配方以g/L计马铃薯200、琼脂20、葡萄糖20、硫酸镁2.0、磷酸二氢钾3.0，富含微量元素有色稻米发酵废糟2.5，pH为6；培养方法取豹斑毒鹅膏菌子实体中心部分接种于新鲜的斜面上，在28℃下培养30天左右；②500mL一级摇瓶种子培养，装液量150mL培养基配方以g/L计马铃薯200、葡萄糖20、硫酸镁2.0、磷酸二氢钾3.0、维生素B10.01，蛋白胨5，富含微量元素有色稻米发酵废糟2.5，pH为6；培养方法将培养好的斜面接种至事先灭菌的摇瓶中，在28±1℃下，转速110rpm下培养30天；③1000mL二级摇瓶种子培养，装液量400mL培养基配方与一级摇瓶种子培养基配方相同；培养方法将培养好的一级种子以10％的接种量接种至事先灭菌的摇瓶中，在28±1℃下，转速110rpm下培养30天，即成待用菌种；2)50L一级液体种子培养，装液量25-30L①一级液体种子培养基配方以g/L计葡萄糖10、麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁、酵母膏3.0、维生素B10.01、硫酸镁2.0、磷酸二氢钾3.0、富含微量元素的有色稻米发酵废糟5，pH为6；②控制工艺在0.1Mpa下灭菌30分钟，冷却后按接种量5％-10％接入待用菌种，温度28±1℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3，V/V，搅拌转速100rpm；③转罐标准发酵时间30-40天，菌丝球上浮三分之一，镜检有锁状联合，无杂菌；3)500L二级液体种子培养，装液量250-300L①培养基配方与一级液体种子配方相同；②控制工艺在0.1Mpa下灭菌30分钟，冷却后按接种量10％-15％接入一级种子，温度28±1℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3，V/V，搅拌转速100rpm；③转罐标准发酵时间30-40天，菌丝球上浮三分之一，镜检有锁状联合，无杂菌；4)3000L深层液体发酵培养，装液量1800L①发酵培养基配方以g/L计葡萄糖5、麸皮50，麸皮水煮后取水溶性麸皮汁、酵母膏3.0、维生素B10.01、硫酸镁2.0、磷酸二氢钾3.0、富含微量元素的有色稻米发酵废糟10，pH为6；②控制工艺在0.1Mpa下灭菌30分钟，冷却后按接种量10％-15％接入二级种子，温度28±1℃，罐压0.05Mpa，通气量1∶0.3，V/V，搅拌转速100rpm；③放罐标准发酵时间30-40天，菌丝球上浮二分之一，镜检有锁状联合，菌丝球不能自溶；5)杀病虫活性粗提物提取将上述培养液超声破碎2-3h，过滤浓缩后，用0.22μm滤膜过滤除菌即得；6)杀病虫活性粗提物成分鉴定将所提出的粗提物用GC-MS分析其所含毒素成分。
全文摘要
本发明涉及富含微量元素有色稻米发酵后的废糟培养豹斑毒鹅膏的方法。豹斑毒鹅膏含有较多毒素，尤以毒蝇碱对蝇虫具有显著致死力，是一种很好的生物杀虫剂，但豹斑毒鹅膏人工培养生长速度较慢，发酵菌丝体得率低。富含微量元素有色稻米通过微生物发酵加工成功能酒酿后会产生发酵废糟，发酵废糟中仍有较高含量的未被微生物转化的微量元素以及丰富的C、N源，因此利用该发酵废糟培养豹斑毒鹅膏既可提高菌丝体产率，又充分利用了有色稻米加工副产物。用该新型方法培养豹斑毒鹅膏菌后，粗提活性杀病虫物质，以用于防治林木病虫。本发明主要包括菌种的培养、液体种子培养、深层液体发酵培养、有色稻米加工副产物利用、杀病虫活性粗提物提取等。
文档编号A01G1/04GK101861796SQ20101017603
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者曹玫, 朱建清, 杨志荣, 罗强, 聂远洋, 赵建 申请人:四川大学