专利名称：一种生物人工肝用肝细胞的保存液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及人体或动物的器官、组织或细胞的体外保存液生物技术领域，尤其是 涉及一种生物人工肝用肝细胞的保存液及其制备方法。
背景技术：
我国是肝病的高发区，每年发生急性病毒性肝炎约120万例，重型肝炎约占其中 的0. 2% 0. 4%，病死率可高达70%。乙肝患者中约有1 %可发展为急性或亚急性肝衰竭。 约有20%急性乙肝患者可转化为慢性，约3%患者可发展为肝炎后肝硬化。丙肝患者中约 60% 80%转化为慢性，20%可发展为肝硬化，12%发展为终末期肝病。每年死于肝病者约 30万例，其中50%为原发性肝细胞癌，大多与乙、丙型肝炎有关。因此重型肝炎、肝衰竭以 及肝炎终末期肝病肝硬化和肝癌等是我国肝病患者死亡的主要原因。肝移植是治疗此类疾 病的最彻底与有效的方法。我国的肝移植数每年在700例以上，1年生存率超过50%，最长 存活时间超过6年。但是我国重型肝炎患者多供器官缺乏，许多患者得不到及时的肝移植 手术而丧失存活机会，同时有效的供体资源也未能充分利用。因此生物人工肝与肝细胞移 植等细胞水平的新治疗方法得到了研究与发展。肝细胞移植和生物人工肝支持在大量动物 实验和一些临床实验中获得良好效果，成为有前途的肝病治疗途径。实际上，如果肝细胞移 植及生物人工肝在临床的大量运用，肝细胞的需求量必将增加，同器官移植一样面对的供 者不足的情况也将要出现。若有一实用可靠的低温储存技术，建立一个肝细胞库，危重患者 随时都能得到大量高活率、有功能的肝细胞；肝细胞移植和生物人工肝技术就能普遍推广。生物人工肝支持系统中最重要的部件就是生物反应器。然而生物反应器的合成需 要一个有丰富经验的团队在无菌条件下用特殊设备进行细胞的扩增及功能的标准化检测， 这就需要一个中心一 “细胞工厂”去提供生物反应器装载细胞的扩增及运送到有需要的医 院。猪肝细胞作为生物反应器装载细胞经深低温冻存_复苏后细胞存活率及肝细胞特有功 能均明显下降，大大限制了人工肝的治疗效果。因此，肝细胞扩增完成后，在短时间保存及 长距离运输过程中需要有一种方便、有效、实用的保护装载细胞活力及功能的方法。4°C是 器官及大规模细胞群的标准保存温度，在此温度下运输无须特殊设备即可达到要求。在4°C 保存过程中肝细胞损伤主要是低温损伤及复温再损伤，类似于器官移植过程中的缺血再灌 注损伤。Belzer等根据低温下器官的各种病理生理特点，提出了一种有效的器官低温保护 液的成分，必须具备以下五个方面的特点①减少因低温导致的细胞水肿②防止细胞的酸 化作用③防止灌洗过程中的细胞间隙的肿胀④防止氧自由基的损伤，尤其在再灌注过程中 ⑤提供再生高能磷酸化合物的底物⑥保持细胞内环境稳定。目前市场上主要的器官保护液主要有美国设计的UW液和欧洲设计的HTK液。UW 液是目前世界范围内应用最为广泛的一种多器官灌注保存液，能够有效地保存肾脏72h、胰 腺72h、肝脏30h、心脏24h，但是它仍然有许多不足，它的高渗性引起细胞皱缩、高粘滞性影 响原位灌注、高钾不符合生理、缺乏保护肝脏低温保存的药物、价格昂贵。HTK液与UW液一 样是较理想的的器官保存液，HTK液最大的优点在于它的低粘滞性，可改善保存器官的微循环，提高组织氧化等，它仍有明显的不足主要体现在器官保存时间的限制上，随着时间的延 长移植物无功能的发生率会大幅度提升。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述缺陷，提供了一种生物人工肝用肝细胞的保 存液及其制备方法，此保存液可以在低温状态下很好保护生物人工肝用肝细胞的细胞活力 及肝细胞特有功能，以满足生物人工肝用大规模肝细胞库的短期低温保存及或远距离运输 过程中肝细胞的保护。本发明提供了一种生物人工肝用肝细胞的保存液，为超纯水配制的溶液，该溶液 中包含如下浓度范围的组分
十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4 · 12H20) 二水磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H20) 一7jC枸橼酸钾(C6H5K3O7 · H2O) 氯化钠(NaCl) 六水氯化镁(MgCl2 · 6H20) 三磷酸腺苷二钠(CltlH14N5Na2O13P3) 还原性谷胱甘肽(CltlH18O6N3S) α -硫辛酸(C8H14O2S2) 海藻糖(C6H12O5) 羟乙基淀粉200/0. 5 苦参碱
该溶液的PH为7. 2-7. 4，渗透压为305士 10mmol/L。 优选地，所述溶液中包含如下浓度的组分 十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4 · 12H20) 二水磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H20) 一7jC枸橼酸钾(C6H5K3O7 · H2O) 氯化钠(NaCl) 六水氯化镁(MgCl2 · 6H20) 三磷酸腺苷二钠(CltlH14N5Na2O13P3) 还原性谷胱甘肽(CltlH18O6N3S) α -硫辛酸(C8H14O2S2)
15-25mmol/L
1-10mmol/L 4-6mmol/L
10-30mmol/L 5-1Ommo1/L 3-1Ommo1/L l-5mmol/L 0. l-o. 5mmol/L 100-150mmol/L 10-50g/L
2-10mg/L
7163mg/L 780mg/L 1622mg/L 1168mg/L 1827mg/L 2755mg/L 922mg/L 41mg/L
47287. 5mg/L 30g/L 6mg/L
海藻糖(C6H12O5) 羟乙基淀粉200/0. 5 苦参碱
本发明的生物人工肝用肝细胞的保存液配制方法为按照上述配方将药物用电子 天平精确称量，用适量超纯水完全溶解除α-硫辛酸外的其他成分，避光精确称量α-硫辛 酸后，在避光状态下充分溶解，加超纯水至足量，4°C条件下测定PH值、渗透压，真空过滤器 (0. 22 μ m)过滤，抽取样本做细菌培养，将液体装入棕色PVP袋，置4°C冰箱保存备用，所得 液体呈无色透明、无混浊、无沉淀及絮状物。上述操作过程均在无菌配制室完成，所用器具均经过无菌处理。本发明生物人工肝用肝细胞的保存液含有的基本组分是能够维持低温状态下肝 细胞的活力和电解质生理浓度，其所含的组分主要是能够减轻细胞内酸化，减轻氧自由基 损伤、稳定细胞膜结构、补充细胞能量丢失、减少低温导致的细胞水肿。在配方设计上，吸收 了 UW液、HTK液的优点同时具备了自己明显的特点1.具有强大的缓冲能力。选取两种缓冲对，ΗΡ04/Η2Ρ04及柠檬酸盐(枸橼酸盐) 两种缓冲对，防止细胞在低温状态的酸化作用。2.选用非渗透性保护剂海藻糖(trehalose)，起到稳定细胞膜和蛋白质结构的作 用，减轻低温状态下细胞水肿。3.添加了外源性三磷酸腺苷、氯化镁作为再生高能磷酸化合物的底物，通过 ATP-Mg2+为细胞提供能量。4.采用还原型谷胱甘肽及有万能抗氧化剂之称的α-硫辛酸作为抗氧化系统及 抗凋亡系统，防止或减轻细胞再灌注损伤，自由基对细胞的损伤。5.引入中药的活性成分苦参碱，利用其抗氧化性，增强保护作用。6.用羟乙基淀粉，提高胶体渗透压的方法，减轻细胞水肿。
图1为本发明的保存液、UW液、乳酸林格液分别4°C低温保存细胞后细胞存活率比 较示意图；图2a、2b、2c为本发明的保存液、Uff液、乳酸林格液分别4°C低温保存细胞24h后 细胞Α0/ΡΙ双染X400显微观察图；图3a、3b、3c为本发明的保存液、Uff液、乳酸林格液分别4°C低温保存细胞48h后 细胞Α0/ΡΙ双染X400显微观察图；图4a、4b、4c为本发明的保存液、Uff液、乳酸林格液分别4°C低温保存细胞72h后 细胞Α0/ΡΙ双染X400显微观察图；图5为本发明的保存液、UW液、乳酸林格液分别4°C低温保存细胞后细胞白蛋白含 量比较示意图。
具体实施例方式以下对本发明的优选实施例进行说明。实施例一配制本发明生物人工肝用肝细胞的保存液I (1000ml)1、向IOOOml容器内加入800ml超纯水；2、加入7163mg十二水磷酸氢二钠，搅拌使其充分溶解；3、加入780mg 二水磷酸二氢钠，搅拌使其充分溶解；4、加入1622mg —水枸橼酸钾，搅拌使其充分溶解；5、加入1168mg氯化钠，搅拌使其充分溶解；6、加入1827mg六水氯化镁，搅拌使其充分溶解；7、加入2755mg三磷酸腺苷二钠，搅拌使其充分溶解；
6
8、加入922mg还原性谷胱甘肽，搅拌使其充分溶解；9、加入47287. 5mg海藻糖，搅拌使其充分溶解；10、加入30g羟乙基淀粉200/0. 5，搅拌使其充分溶解；11、加入6mg苦参碱，搅拌使其充分溶解；12、在避光状态下加入41mg α -硫辛酸，并搅拌使其充分溶解；13、容量调整加入超纯水直至溶液总体积为1000ml，搅拌使溶液呈均勻、无色、 澄清的液体；14、活性碳过滤后，4°C条件下测定PH值为7. 3、渗透压为305mmol/L，真空过滤器 (0. 22 μ m)过滤除菌，抽取样本做细菌培养。实施例二配制本发明生物人工肝用肝细胞的保存液II (1000ml)，配制方法与实施例一相 同，组分的用量为5372mg十二水磷酸氢二钠，1560mg 二水磷酸二氢钠，1298mg 一水枸橼 酸钾，585mg氯化钠，2030mg六水氯化镁，5510mg三磷酸腺苷二钠，307mg还原性谷胱甘肽， 56745mg海藻糖，50g羟乙基淀粉200/0. 5，2mg苦参碱，103mg α -硫辛酸；活性碳过滤后， 4°C条件下测定PH值为7. 2、渗透压为315mmo 1/L，真空过滤器(0. 22 μ m)过滤除菌，抽取 样本做细菌培养。实施例三配制本发明生物人工肝用肝细胞的保存液III (1000ml)，配制方法与实施例一相 同，组分的用量为8950mg十二水磷酸氢二钠，156mg 二水磷酸二氢钠，1946mg 一水枸橼酸 钾，1755mg氯化钠，1015mg六水氯化镁，1653mg三磷酸腺苷二钠，1535mg还原性谷胱甘肽， 37830mg海藻糖，IOg羟乙基淀粉200/0. 5，IOmg苦参碱，20. 6mga -硫辛酸；活性碳过滤后， 4°C条件下测定PH值为7. 4、渗透压为295mmol/L，真空过滤器(0. 22 μ m)过滤除菌，抽取样 本做细菌培养。为研究本发明保存液在生物人工肝用肝细胞的保存效果，以上述实施例配制的保 存液Ι、Π、ΙΙΙ进行实验，生物人工肝用肝细胞C3A为实验细胞。以乳酸林格氏液，UW液为 对照，进行在4°C低温条件下保存24h、48h、72h后复温到37°C细胞存活率、细胞凋亡及其特 有功能的实验。一、低温保存后细胞存活率检测实验方法1、细胞培养消化收集人肝细胞(C3A)，调整细胞密度为3X 105/ml，接种在六孔培 养板中，每孔加液量达2ml，37°C，5% CO2，二氧化碳孵箱贴壁培养24小时后行4°C低温保存。2、低温冻存吸除原先各孔培养液，PBS 2ml冲洗。分别加入2ml如下各组保护剂， 分别为；保存液I、UW保护液及乳酸林格液，置于4°C冰箱中保存24、48、72小时。3、将细胞从4°C冰箱取出后快速置入37°C水浴锅中水浴复苏2mim后，小心吸尽各 组保存液后用0. 4%胎盘蓝拒染试验测定。在光学显微镜下随机五个视野计数200个肝细 胞中活细胞百分比测定其存活率。实验结果实施例一保存液I组与UW液组人肝细胞(C3A)存活率24h、48h均无明显差异，而72h后实施例一保存液I组人肝细胞C3A)存活率略低于UW液组。阴性对照组乳酸林格氏 液组人肝细胞(C3A)存活率在保存24h后即见明显下降，参见图1。以保存液II、III进行同样实验，结果相同。二、低温保存后细胞凋亡实验实验方法1、细胞培养消化收集人肝细胞(C3A)，调整细胞密度为3X 105/ml，接种在六孔培 养板中，每孔加液量达2ml，37°C，5% C02，二氧化碳孵箱贴壁培养24小时后行4°C低温保存。2、低温冻存吸除原先各孔培养液，PBS 2ml冲洗。分别加入2ml如下各组保护剂， 分别为；保存液I、UW保护液及乳酸林格液，置于4°C冰箱中保存24、48、72小时。3、吖啶橙(AO) /碘化丙锭(PI)双染荧光显微镜检测细胞凋亡情况。实验结果由上不同保存液组人肝细胞(C3A)吖啶橙/碘化丙啶双染结果可见，保存液I与 UW液组相比，在保存24h、48h后双染未见明显凋亡细胞，两组无明显差异，而72h后见较多 凋亡，胞核固缩状、呈增强的、明亮的绿色荧光，效果稍差(见图2a、图2b，图3a、图3b，图 4a、图 4b)。而阴性对照组乳酸林格氏液组在保存24h后即明显见肝细胞在低温状态下出现 凋亡，胞核呈固缩状、团块状结构，呈增强的、明亮的绿色荧光，甚至呈现出“黄”色。48h、72h 可见坏死或晚期凋亡，核为较大的圆形结构着橘红色，或橘红色并呈固缩状或圆珠状(见 图 2c、图 3c、图 4c)。以保存液II、III进行同样实验，结果相同。三、低温保存后肝细胞白蛋白合成功能实验方法1、细胞培养消化收集人肝细胞(C3A)，调整细胞密度为2X 106/ml，接种在六孔培 养板中，每孔加液量达2ml，37°C，5% C02，二氧化碳孵箱贴壁培养24小时后行4°C低温保存。2、低温冻存吸除原先各孔培养液，PBS 2ml冲洗。分别加入2ml如下各组保护剂， 分别为；保存液I、UW保护液及乳酸林格液，置于4°C冰箱中保存24、48、72小时。3、将细胞从4°C冰箱取出后快速置入37°C水浴锅中水浴复苏2mim后，小心吸尽各 组保存液后，各组中加入含10%胎牛血清DMEM细胞培养基常规培养24、48、72小时。定期 收集培养液上清，用人白蛋白放免试剂盒(北方原子能研究所提供)检测培养上清中人白 蛋白含量，采用放射免疫抗原竞争法，与牛血清白蛋白无交叉反应。实验结果保存液I组与UW液组在低温保存24h、48h后复苏再培养中白蛋白合成 功能无显著性差异，阴性对照组乳酸林格氏液组与其他两实验组在细胞复苏后白蛋白合成 功能有显著性差异。(见图5)以保存液II、III进行同样实验，结果相同。通过以上实验的证明，本发明在4°C低温保存生物人工肝用人肝细胞是明显有效 地，特别是在低温保存48小时内，在细胞存活率及其细胞特有功能上同UW液比较无明显差 异。同时本发明保存液所含组分来源丰富，成本低，不同于既往细胞保存液，本发明各组分
8有确定的成分及浓度，其主要由双糖、多聚糖、多肽、金属离子、磷酸根离子等组成，因不需 要添加血清等其他异种抗原及有细胞毒性的二甲基亚砜，避免了被未知病毒污染的危险及 引入异种抗原后的抗原抗体排斥反应。因而细胞在低温保存后不用经特殊处理即可以用 于生物人工肝生物反应器，很好满足了临床生物人工肝要求肝细胞材料的供应快速、应急 (ready-to-use)的要求。 以上所揭露的仅为本发明的优选实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利 范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
权利要求
一种生物人工肝用肝细胞的保存液，为超纯水配制的溶液，其特征在于，该溶液中包含如下浓度范围的组分十二水磷酸氢二钠15 25mmol/L二水磷酸二氢钠 1 10mmol/L一水枸橼酸钾4 6mmol/L氯化钠 10 30mmol/L六水氯化镁 5 10mmol/L三磷酸腺苷二钠 3 10mmol/L还原性谷胱甘肽 1 5mmol/Lα 硫辛酸 0.1 0.5mmol/L海藻糖 100 150mmol/L羟乙基淀粉200/0.5 10 50g/L苦参碱 2 10mg/L。
2.如权利要求1所述的生物人工肝用肝细胞的保存液，其特征在于，所述溶液的PH为 7. 2-7. 4。
3.如权利要求1所述的生物人工肝用肝细胞的保存液，其特征在于，所述溶液的渗透 压为 305士 10mmol/L。
4.如权利要求1所述的生物人工肝用肝细胞的保存液，其特征在于，所述溶液中包含 如下浓度的组分十二水磷酸氢二钠7163mg/L二水磷酸二氢钠780mg/L一水枸橼酸钾1622mg/L氯化钠1168mg/L六水氯化镁1827mg/L三磷酸腺苷二钠2755mg/L还原性谷胱甘肽922mg/Lα-硫辛酸41mg/L海藻糖47287. 5mg/L羟乙基淀粉200/0. 530g/L苦参碱6mg/L。
5.权利要求1所述的生物人工肝用肝细胞的保存液的制备方法，其特征在于，包括如 下步骤按照所述组分的浓度要求将所述各组分准确称量，其中的α-硫辛酸避光称量； 用适量超纯水完全溶解除α-硫辛酸外的其他组分； 在避光状态下充分溶解α-硫辛酸； 加超纯水至足量。
6.如权利要求5所述的生物人工肝用肝细胞的保存液的制备方法，其特征在于，在所 述加超纯水至足量步骤后还包括如下步骤过滤；将过滤后的溶液装入棕色PVP袋，置冰箱 保存备用。十二水磷酸氢二钠 15-25mmol/L 二水磷酸二氢钠 l-10mmol/L一水枸橼酸钾 4-6mmol/L 氯化钠 10-30mmol/L六水氯化镁 5-1Ommo1/L 三磷酸腺苷二钠 3-1Ommo1/L 还原性谷胱甘肽 l-5mmol/Lα -硫辛酸 0.1-0.5mmol海藻糖100-150mmol/L羟乙基淀粉200/0. 5 10-50g/L 苦参碱 2-10mg/L。
7.如权利要求6所述的生物人工肝用肝细胞的保存液的制备方法，其特征在于，所述 步骤均在无菌配制室完成，所用器具均经过无菌处理。
全文摘要
本发明提供了一种生物人工肝用肝细胞的保存液及其制备方法，该保存液为超纯水配制的溶液，该溶液中包含如下浓度范围的组分十二水磷酸氢二钠15-25mmol/L，二水磷酸二氢钠1-10mmol/L，一水枸橼酸钾4-6mmol/L，氯化钠10-30mmol/L，六水氯化镁5-10mmol/L，三磷酸腺苷二钠3-10mmol/L，还原性谷胱甘肽1-5mmol/L，α-硫辛酸0.1-0.5mmol/L，海藻糖(C6H12O5)100-150mmol/L，羟乙基淀粉200/0.510-50g/L，苦参碱2-10mg/L；其制备方法包括如下步骤按照所述组分的浓度要求将所述各组分准确称量，其中的α-硫辛酸避光称量；用适量超纯水完全溶解除α-硫辛酸外的其他组分；在避光状态下充分溶解α-硫辛酸；加超纯水至足量。本发明的保存液可以在低温状态下很好保护生物人工肝用肝细胞的细胞活力及肝细胞特有功能，以满足生物人工肝用大规模肝细胞库的短期低温保存及或远距离运输过程中肝细胞的保护。
文档编号A01N1/02GK101919381SQ20101027340
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月6日 优先权日2010年9月6日
发明者张志 , 徐小平, 潘明新, 秦佳升, 蒋泽生, 高毅 申请人:南方医科大学珠江医院