一种蛋白质自组装人工肝支架制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于蛋白质自组装特性的人工肝支架制备的方法。涉及细胞培养技术领域，蛋白质自组装特性技术领域，生物打印器官技术领域。
【背景技术】
[0002]蛋白质是一种有机大分子物质，是维持生命活动和生长所必需的物质，同时也是目前肝组织工程常用的材料之一。而蛋白质分子的自组装行为是指特定蛋白质结构单元之间自发形成有序结构的行为。蛋白质分子在形成过程中表现出高度有序的自组装特性。蛋白质的自组装行为是维持生命体系正常运转，促进生命体进化的重要保障和推动力。蛋白质的变性是指蛋白质的二、三、四级结构的构象不稳定，在某些物理或化学因素作用下，发生不同程度的改变。变性后的蛋白质疏水性基团暴露，在水中溶解性降低。通过改变一些物理、化学因素可以促使蛋白质变性。紫外线照射就是一种使蛋白质变性的物理因素。
[0003]蚕丝蛋白，又名丝素蛋白，是一种从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，其具有良好的生物相容性和可降解性，能够促进细胞新陈代谢及维持皮肤正常生理状态；同时蚕丝蛋白质还具有吸收紫外线的作用，而且蚕丝蛋白拥有较好的力学及物理性能等。因此，目前蚕丝蛋白材料被广泛应用于生物医学材料领域，例如做细胞培养基质。基于蚕丝蛋白以上特性，本次发明选用蚕丝蛋白作为使用蛋白质。
[0004]3D打印也称为“增材制造”，是一门以数据设计文件为基础，将材料逐层沉积以构造成三维物体的新兴的快速成型技术。生物打印是将工业打印技术与生物医学技术相结合，以人体细胞和生物材料为打印原料，进行组织和器官的仿生重建。利用生物打印技术制备组织支架相比于其它组织工程支架快速成型技术具有不可比拟的优点，具体体现在五个方面:第一，构建复杂组织或器官的精度高，能够实现细胞层面的组装和构建。第二，可实现细胞与材料有机组合，打印能根据组织或器官中的不同细胞、基质等实际情况，进行仿真排列和组合，且一次成型。第三，可以根据缺损组织或器官的实际情况进行即时、快速、可控、真实的计算机三维模型再现。第四，个性化制造复杂组织器官，成本可控。第五，可实现便携、高效、能耗低、生物材料用量少的快速制造。
[0005]肝脏是人体的重要器官，是人体内物质代谢的中心，它具有代谢、排毒、循环调节等功能。然而，肝癌、急性肝衰竭等疾病导致了每年大量的死亡，严重危胁人类的健康，对于这些严重疾病的治疗，现在唯一可行的治疗方法是肝移植。由于肝脏是人体独一无二的器官无法进行自体移植;而异体移植，很大的阻碍就是组织免疫排斥反应，一旦抗排斥治疗失败，便意味着前功尽弃，并且由于严重的肝源短缺，大量患者在等待肝移植的过程中死去。因此，研究人工肝脏成为解决这一问题的一个重要方法。到目前为止，医学上关于人工肝脏的研制因其构成要素不同分为三大类:1.以人造材料制成的非生物性人工肝脏(非生物性AL)。2.以动物摘出肝、交叉灌流肝等动物脏器、细胞为材料制成的生物性人工肝脏(生物性AL)。3.人造材料和动物细胞两者结合制成的杂交人工肝脏(杂交AL)。对于非生物性AL而言，由于其选用材料的主要为人造材料，这导致制备的人工肝脏生物相容性较差，而且人体肝脏功能繁多，通过人工方法将全部功能补全是不可能的。而生物性AL，由于其采用的是动物的脏器、细胞为材料，这会导致异种免疫反应的超急性排斥反应，同时动物的某些传染疾病也有可能通过脏器传染给人体。因此，在近些年，医学界提出杂交AL的想法，即将人造材料和动物细胞两者相结合制成杂交人工肝脏。但到目前为止，医学生在制备杂交AL时主要还是运用传统的技术，这存在技术难度大、研制时间周期长、成本高等一系列问题。
[0006]因此，为克服传统技术存在的生物相容性差、引起排斥反应等不足，同时结合先进生物打印技术，本发明率先提出了采用蚕丝蛋白作为支架材料，利用蛋白质自组装特性同时结合先进生物打印技术制备肝脏支架的方法。
【发明内容】
[0007]当前随着3D打印技术的发展，将生物医学技术与3D打印技术结合起来，用以进行人体组织和器官的仿生重建，已经逐渐成为将来的发展趋势。本发明就是将传统生物医学技术与先进的3D打印技术相结合，提出了一种蛋白质自组装人工肝支架制备方法，以高效制备肝脏支架。
[0008]本发明的技术方案为:
[0009]所述一种蛋白质自组装人工肝支架制备方法，其特征在于:包括以下步骤:
[0010]步骤1:制备打印材料:
[0011]步骤1.1:将蚕丝置于CaCl2水溶液中进行溶解，制得溶解处理液;对溶解处理液过滤得到蚕丝蛋白/CaCl2混合水溶液;对蚕丝蛋白/CaCl2混合水溶液进行透析纯化，得到蚕丝蛋白溶液；
[0012]步骤1.2:对病患健康肝细胞进行传代培养；
[0013]步骤1.3:将步骤1.1得到的蚕丝蛋白溶液与经过步骤1.2传代培养后的病患健康肝细胞混合，得到打印材料；
[0014]步骤2:制备人工肝支架:
[0015]步骤2.1:将步骤I制备的打印材料装入给生物3D打印设备储液腔，所述生物3D打印设备的控制系统中存储有病患肝脏的3D模型数据；
[0016]步骤2.2:生物3D打印设备根据病患肝脏的3D模型数据，利用步骤I制备的打印材料分层进行生物3D打印；要求当已打印支架的结构定型后，再进行下一层的打印，直至病患肝脏支架打印完成;打印过程中采用紫外线照射已打印支架；
[0017]步骤3:对步骤2得到的病患肝脏支架进行培养，得到活性肝支架。
[0018]进一步的优选方案，所述一种蛋白质自组装人工肝支架制备方法，其特征在于:步骤1.1得到的蚕丝蛋白溶液浓度为40mg/ml?80mg/ml。
[0019]进一步的优选方案，所述一种蛋白质自组装人工肝支架制备方法，其特征在于:步骤I得到的打印材料中，病患健康肝细胞浓度不少于10 X 15个/ml。
[0020]进一步的优选方案，所述一种蛋白质自组装人工肝支架制备方法，其特征在于:步骤2.2中，紫外线强度为2级4指数。
[0021 ]进一步的优选方案，所述一种蛋白质自组装人工肝支架制备方法，其特征在于:步骤1.1中将蚕丝剪成最大尺寸小于2mm的碎片后，再置于CaCl2水溶液中进行溶解。
[0022]进一步的优选方案，所述一种蛋白质自组装人工肝支架制备方法，其特征在于:步骤1.2中，对病患健康肝细胞进行传代培养的细胞培养液为高糖DMEM培养液，并在其中添加有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺和ΙΟΟμπι/ml青霉素或链霉素。
[0023]有益效果
[0024]本发明的有益效果是:
[0025]I)本发明创新性的提出利