专利名称：胡杨PeCBL10基因的功能分析与利用的制作方法
技术领域：
本发明设计涉及来自胡杨(Populus euphratica Olive)的PeCBLlO基因功能分
析与应用。
背景技术：
胡杨(Populus euphratica Olive)是唯一能在干旱盐碱和温差剧烈变化的干旱沙漠地区生长的乔木建群树种。作为天然的抗逆性极强的典型植物，胡杨已引起国际学术界的重视。研究、开发和利用胡杨抗逆性基因资源，对于深入林木抗逆性机理以及定向培育抗逆林木新品种具有重要的价值。钙离子作为细胞内的第二信使在信号转导过程中起着重要作用。钙离子作为细胞内的第二信使在信号转导过程中起着重要作用。钙调素B蛋白家族，它是类似于酵母和动物体内的钙调磷酸酶B的一类蛋白，简称CBUCalcineurin B-Iike Proteins)，CBL虽然能结合Ca2+，但自身没有激酶域，必须和其靶蛋白作用才能发挥其功能。研究表明，CBL在植物逆境胁迫及信号传导过程中起到重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供胡杨中的一种与逆境相关的CBL基因，该基因在胡杨中克隆，在抗盐反应中具有重要作用。本发明所提供的CBL基因来源于胡杨，是CBL基因家族中的一个，命名为PeCBLlO。序列表中序列氨基酸残基序列是由258个氨基酸残基组成的蛋白质。逆境相关基因PeCBLlO是下列核苷酸序列之一序列表中序列1的DNA序列。与序列中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA序列。序列表中序列1的DNA序列由777个碱基组成，为该基因的开放读码框序列，其表达受到盐的诱导。本发明所提供的逆境相关基因PeCBLlO，使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体(包括双元农杆菌载体以及用于单子叶植物微弹轰击的载体)转化植株，可获得对高盐胁迫抗性增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以使用增强子，但是必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择性标记，通常使用的可选择性标记可以是编码对抗生素(包括庆大霉素、卡那霉素、潮霉素)抗性酶的基因和生物安全标记(甘露糖)，也可以是⑶S、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。携带有本发明的逆境相关基因PeCBLlO基因的表达载体可以通过多种方法转化植物宿主，以培育抗盐的植物品种，例如Ti质粒、Ri质粒、电穿孔、微注射、植物病毒载体、 直接DNA转化或植物病毒载体等，所转化的植物宿主可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图一是通过RT-PCR技术克隆得到的基因全长电泳图，图中M为markerIII，1为与逆境相关的基因PeCBLlO ；图二为PeCBLlO基因在高盐条件下RT-PCR检测结果。
具体实施例方式实施例1，胡杨总RNA的提取用CTAB (萨姆布鲁克，分子克隆实验指南，第三版)的方法从盐处理的胡杨中提取总 RNA。实施例2，胡杨PeCBLlO cDNA序列的克隆总RNA用逆转录酶反转录合成cDNA，然后用引物PCBL10-1 (GGATCCATGGATTTCAAC AACAACAACAG)和 PCBL10-2 (GGATCCAAATCCTCAACCTCAGTGTTGAA)对该 cDNA 进行 PCR。PCR 程序为(1) 940C，变性5分钟。(2) PCR扩增，33个循环-MV，变性45秒；59°C退火45秒； 72 0C，延伸45秒；(3) 72 0C，延伸10分钟。将PCR产物用琼脂糖进行电泳分离，然后用天根的琼脂糖DNA分离试剂盒回收目的片断并与TaKaRa公司的pMD18载体进行连接，连接的反应体系为目的片断4μ 1，1μ 1 pMD18vector,5y 1 Solution I，于160C过夜连接，再将连接产物转化进感受态的大肠杆菌ToplO，用PCR的方法检测阳性菌株，最后取转化成功的菌株在上海生工进行DNA序列测定。实施例3，胡杨PeCBLlO基因在逆境中的表达特性对于从新疆取得的两年生胡杨植株，分别进行盐处理，根据实验设计的时间取叶片，经液氮速冻，提取RNA作RT-PCR分析，RT-PCR反应以胡杨的Actin2为对照，以控制PCR 反应中模板cDNA的浓度一致，结果如图2所示。实施例4、胡杨PeCBLlO基因表达载体的构建用两头加有BamH I酶切位点接头的引物从含有其cDNA序列的克隆载体上进行PCR，得到的产物连接到克隆载体上，菌落鉴定后将得到的阳性克隆摇菌、提质粒，并用 BamH I酶切3小时，同时提取pBI121质粒，也用BamH I酶切3小时将得到的酶切产物用 T4连接酶16°C过夜连接，分别转化大肠杆菌ToplO，得到的正向和反向的阳性产物进一步转化农杆菌EH105A。序列表序列表1ATGCTTGCTACCTCCACGGATTTCAACAACAACAACATCAGCAGATCACCTAGATTGAGT序列表2 MLATSTDFNNNNISRSPRLS61TCTTTGACGATTGGGGAGCGGATCTGTGCCTCGTGTATACCATTTGCGGCCATCACTGAG21SLTIGERICASCIPFAAITE121ATTTTCATTCTGGCTGTTGGTAATTGCTTTGAGTGCCGGCCATGTGTTAAAAGAAATCGA
41IFILAVGNCFECRPCVKRNR181TGTGGTTTCCTAGATATAGCTCGCCTTGCCGATGGATCTCGATTTACTGTTAATGAAGTG61CGFLDIARLADGSRFTVNEV241GAGGCCTTGTACGAGCTGTATAAGAAGTTGAGTAACTCGATAATCAAAGATGGCTTGATT81EALYELYKKLSNSIIKDGLI301CATAAGGAAGAGCTTCAATTAGCACTATTCCGAGCTCCTCATGGCGAGAATCTTTTTCTA101HKEELQLALFRAPHGENLFL361GACAGGCTTTTTGATCTTTTTGATGAAAAGAGAAATGGTGTAATCGAATTTGAGGAATTT121DRLFDLFDEKRNGVIEFEEF421GTCCGTGCACTCAATGTGTTCCATCCCTACGCACCCATGGAAGAAAAAATTGATTTTGCA141VRALNVFHPYAPMEEKIDFA481TTCAGGCTGTACGACCTGAGACAAACTGGGTTCATTGAACGAGAGGAAGTTAAGCAAATG161FRLYDLRQTGFIEREEVKQM541GTGATTGCCATTTTATTGGAATCTGATGTGAAATTGCCAGAAGATCTTTTGGAGGCTATC181VIAILLESDVKLPEDLLEAI601ATAGACAAGACATTTGCTTATGCCGATGCCGACAAGGATGGTAAAATCAACAAAGAAGAA201IDKTFAYADADKDGKINKEE661TGGAAGGCTTTTGTGGTTCGACATCCAAATCTATTGAACAACATGACTCTTCCTTATCTG221WKAFVVRHPNLLNNMTLPYL721AAGGACATAAGCACTGTCTTTCCAAGCTTTATTTTCAACACTGGGGTTGAGGATTGA241KDISTVFPSFIFNTGVED*
权利要求
1.胡杨的逆境相关基因PeCBLlO，它具有与序列表中序列2的氨基酸残基序列获将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
3.胡杨抗逆境相关基因PeCBLlO，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列。2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述胡杨抗逆基因PeCBLlO的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.权利要求4所述的基因，其开放阅读框是自5’端第1到第777位碱基。
6.含有权利要求3所述的基因的表达载体。
7.含有权利要求3所述的基因的细胞系。
8.权利要求3所述的基因在培育抗盐植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个胡杨(Populus euphratica Olive)的逆境相关基因CBL基因，该基因在植物抗盐中有重要作用，本发明将提供的CBL基因命名为PeCBL10，具有与序列表2的氨基酸序列或将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。逆境相关基因PeCBL10，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的PeCBL10基因在培育抗盐植物品种中具有重要作用。
文档编号A01H5/00GK102382842SQ201010272659
公开日2012年3月21日 申请日期2010年9月6日 优先权日2010年9月6日
发明者夏新莉, 尹伟伦, 李旦旦 申请人:夏新莉, 尹伟伦, 李旦旦