专利名称：改进胚从人造种子萌发的方法
改进胚从人造种子萌发的方法
背景技术：
现代造 林经常需要种植大量所选择的具有有利性质的遗传上一致的植株。通过有 性繁殖产生植物种子来生产新植株，通常是不可行的。对于某些物种来说，通过培养体细 胞胚或合子胚的无性繁殖，已被显示产生大量遗传一致的胚，每个胚都具有发育成正常植 株的能力。但是，通过体外培养产生的植物胚缺少天然植物种子的天然保护性和营养性部 件。已经进行了尝试，通过使用人造种子向实验室中培养的植物胚提供在天然植物种子中 发现的保护性和营养性结构。人造种子被描述在例如美国专利Nos. 5，564，224,5, 687，504、 5，701，699和6，119，395中。人造种子的问题仍然存在。从人造种子产生的成功萌发率和 萌发物质量二者都低于从天然植物种子获得的萌发率和质量。因此，对于改进从人造种子 获得的萌发率和萌发物质量，存在着需求。本发明致力于这些以及其他需求。发明简述一方面，本发明提供了人造种子，所述人造种子包含(a)种皮；(b)含有吸附性材 料的营养性培养基，其中吸附性材料以约30g/L到约100g/L的浓度存在于培养基中；以及 (c)苗限制器，其中苗限制器包含空腔。在一个实施方案中，人造种子还包含放置在苗限制 器空腔内的植物胚。在一个实施方案中，营养性培养基中的吸附性材料是炭。在一个实施 方案中，营养性培养基中的吸附性材料是营养物处理过的炭。在一个实施方案中，苗限制器还包含空腔内的吸附性材料。在一个实施方案中，空 腔中的吸附性材料是炭。在一个实施方案中，空腔内的吸附性材料是营养物处理过的炭。另一方面，本发明提供了用于改进植物胚从人造种子萌发的方法。在一个实施 方案中，方法包括下列步骤(a)组装包含种皮和苗限制器的人造种子，其中苗限制器包含 空腔；(b)向种皮加入包含吸附性材料的营养性培养基，其中吸附性材料以约30g/L到约 100g/L的浓度存在于培养基中；(c)将植物胚置于苗限制器的空腔内；以及(d)在适合于 植物胚萌发的条件下培养人造种子。在一个实施方案中，方法包括下列步骤(a)组装包含种皮和限制器的人造种子， 其中限制器包含空腔；(b)向种皮加入包含吸附性材料的营养性培养基，其中吸附性材料 以约30g/L到约100g/L的浓度存在于培养基中；(c)将植物胚置于限制器的空腔内；(d)向 空腔加入吸附性材料；以及(e)在适合于植物胚萌发的条件下培养人造种子。应该理解，可以改变方法中步骤的次序而不背离本发明的范围。例如，可以在将胚 置于限制器内之前，将吸附性材料置于限制器的空腔内。
通过参考下面的详细描述并结合随附的图，本发明的上述方面以及许多伴随的优 点将变得更容易理解，在这些图中图1是在本发明的方法中使用的含有胚的示例性人造种子的截面侧视图；图2是图，显示了置于在营养性培养基中具有增加量炭的人造种子中的胚的萌发 率。观察在播种后19天做出；
图3是图，显示了置于在营养性培养基中具有增加量炭的人造种子中的胚的萌发 率。观察在播种后26天做出；图4是图，显示了置于在营养性培养基中具有增加量炭的人造种子中的胚的器官 长度。观察在播种后35天做出；以及图5是图，显示了置于在营养性培养基中具有增加量炭的人造种子中的胚的发生 率。观察在播种后35天做出。详细描述 除非在本文中专门定义，否则所有本文中使用的术语都具有与本发明本领域技术 人员所理解的相同的意义。除非另有陈述，否则所有用百分率表示的浓度值都是单位体积的重量百分率。一方面，本发明提供了人造种子，所述人造种子包含(a)种皮；(b)含有吸附性材 料的营养性培养基，其中吸附性材料以约30g/L到约100g/L (例如从约50g/L到约100g/L、 从约60g/L到约100g/L或从约75g/L到约100g/L)的浓度存在于培养基中；以及(c)苗限 制器，其中苗限制器包含空腔。在一个实施方案中，人造种子还包含植物胚。图1是含有置于其中的植物胚42的示例性人造种子20的截面侧视图。如图1中 所示，胚42置于空腔34中，与营养性培养基26功能性接触，并通过活端封43适合地密封。 应该理解，图1提供了人造种子20的代表性实施方案；但是，本发明的方法不限于图1中 显示的人造种子的具体实施方案。在图1所示的示例性实施方案中，人造种子20包含种皮 24、营养性培养基26、死端封28和任选的苗限制器22。本文中使用的“种皮”是指与天然种皮类似的结构，其保护植物胚和人造种子的 其他内部结构抵抗机械损伤、干旱，免于被微生物、真菌、昆虫、线虫、鸟类和其他病原体、食 草动物和害虫攻击，以及其他功能。种皮24可以由各种不同材料制成，包括但不限于纤维 质材料、玻璃、塑料、可模制塑料、熟化的聚合树脂、石蜡、蜡、清漆及其组合例如用蜡浸渍的 纸。用于制造种皮的材料一般是无毒的，并提供一定程度的刚性。种皮可以是可生物降解 的，尽管典型情况下种皮保持完整和对植物病原体穿透的抗性直到萌发的胚出现之后。种 皮可以由一段管状材料形成。种皮可以是切成段的纤维材料管例如纸管。成段的管可以用 适合的涂层材料例如蜡预处理。或者，种皮可以由可生物降解的塑料材料的管状段形成。一 种这样的材料是聚乳酸(“PLA”)，并由加利福尼亚洛杉矶的NAT-UR公司销售。另一种适 合的材料是聚己酸内酯(“PCL”)混合物例如CAPA 6800 (PerstorpPolyols Inc. ,Toledo, Oklahoma 43612)，其中含有或不含 1 % TegomerH SI6440 增塑剂(Degussa Goldschmidt Chemical Corp,914EastRandolph Road, Hopewell, Virginia 23860)。这种可生物降解的 塑料管可以需要也可以不需要蜡质涂层，因为这种管已经对环境要素具有抗性。添加剂例 如抗生素和植物生长调节剂可以通过例如掺入到形成种皮的一个或多个层的材料中，或通 过使用常规手段用添加剂进行涂层或用其处理(一个或多个)层，添加到种皮中。在本发明的人造种子和方法中，营养性培养基26与置于人造种子20内的植物胚 功能性接触。本文中使用的“营养性培养基”是指营养物源，例如维生素、矿物质、碳源和能 源以及胚在萌发过程中所使用的其他有益化合物。因此，营养性培养基26类似于天然种子 的配子体。本发明的营养性培养基26可以包含使培养基在正常环境条件下成为半固体或 具有凝固稠度的物质。典型情况下，营养性培养基26为水合凝胶的形式。“凝胶”是被制备成胶体溶液并将或能够导致形成半固体材料的物质。这种液体凝胶溶液向半固体材料的转 变，在本文中被称为凝胶的“固化”或“凝固”。“水合凝胶”是指含水的凝胶。这种凝胶的 制备是通过首先在水中(其中水用作溶剂或“连续相”)溶解亲水性聚合物质(用作溶质或 “分散相”)，所述亲水性聚合物质在固化后，与连续相组合形成了半固体材料。因此，水变得 与溶质分子均勻缔合，连续相与分散性不发生任何实质性分离。但是，例如通过蒸发或经萌 发胚的渗吸，能够将水分子从固化的水合凝胶中自由移出。当固化时，这些凝胶具有顺应性 固体的特征，类似一团明胶，其中当凝胶中水的相对量减少时，顺应性变得越来越低，凝胶 触摸起来变得更“坚固”。除了为水溶性之外，适合的凝胶溶质既无细胞毒性也无显著植物毒性。在本文中 使用时，“无显著植物毒性”的物质是不显著干扰正常的植物发育、例如杀死显著量的植物 细胞、显著改变细胞分化或成熟、引起突变、破坏显著量的细胞膜或显著破坏细胞代谢、或 显著破坏其他过程的物质。候选的凝胶溶质包括但不限于下列藻酸钠，琼脂，琼脂糖，直链淀粉，果胶，葡聚 糖，明胶，淀粉，支链淀粉，改性纤维素例如甲基纤维素和羟乙基纤维素，以及聚丙烯酰胺。 其他亲水性凝胶溶质也可以使用，只要它们具有类似的水合和胶凝性质并缺乏毒性即可。凝胶典型地通过将通常为细小颗粒形式的凝胶溶质溶解在水中形成凝胶溶液来 制备。取决于具体的凝胶溶质，在凝胶溶质溶解之前通常需要加热，有时加热到沸腾。随后 的冷却将引起许多凝胶溶质可逆地“凝固”或“固化”(变得胶化)。实例包括明胶、琼脂和 琼脂糖。这样的凝胶溶质被称为“可逆的”，是因为重新加热固化的凝胶将重新形成凝胶溶 液。其他凝胶溶质的溶液需要“络合”剂，所述络合剂通过交联凝胶溶质分子将凝胶化学固 化。例如，藻酸钠通过向凝胶溶液加入硝酸钙(Ca(NO3)2)或其他二价离子包括但不限于钙、 钡、铅、铜、锶、镉、锌、镍、钴、镁和铁的盐，来进行固化。许多需要络合剂的凝胶溶质不可逆 固化，其中重新加热将不会重新建立起凝胶溶液。凝胶溶质的浓度根据具体的凝胶溶质而变。例如，可用的藻酸钠浓度在约0. 5% w/v到约2. 5 % w/v、优选为约0. 9 % w/v到1. 5 % w/v的范围内。可用的琼脂浓度在约0. 8 % w/v到约2. 5% w/v的范围内，优选为约1. 8% w/v。一般来说，通过络合固化的凝胶比“可 逆性”凝胶需要较少的凝胶溶质就能形成令人满意的凝胶。 营养性培养基26典型地包含一种或多种碳源、吸附性材料、维生素和矿物质。适 合的碳源包括但不限于单糖、二糖和/或淀粉。适合的吸附性材料包括但不限于炭、聚乙烯 聚吡咯烷酮和硅胶。营养性培养基26也可以包含氨基酸和烟悬物(smoke suspension) 0 适合的氨基酸可以包括通常发现的掺入到蛋白质中的氨基酸以及不常被发现掺入到蛋白 质中的氨基酸，例如精氨琥珀酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、鸟氨酸和D-立体异构体。适合的烟悬 物含有通过燃烧有机物质例如木材或其他纤维质材料的过程产生的一种或多种化合物。含 有这些燃烧有机物质的副产物的溶液可以通过燃烧有机物质，用水洗涤烧焦材料并收集水 来产生。溶液也可以通过加热有机物质并凝聚和稀释从这种加热释放的挥发性物质来获 得。某些类型的烟悬物可以从商业化供应商购买，例如Wright' s浓缩山胡桃陈化液体烟 (Wrightr s Concentrated HickorySeasoning Liquid Smoke)(B&G Foods,Inc. Roseland, NewJersey 07068)。烟悬物可以各种不同形式掺入到营养性培养基26中。例如，烟悬物可 以作为气溶胶、粉末或作为活性粘土掺入。示例性的Wright' s浓缩山胡桃陈化液体烟液体烟悬物的浓度，如果存在 的话，在每升培养基0. OOOlml到Iml烟悬物之间。营养性培养 基26也可以包含一种或多种参与氮代谢的化合物，例如尿素或多胺。营养性培养基26可以包含携带氧气的物质，以同时增加氧气的吸收和氧气被 营养性培养基26的持留，从而使培养基将氧气浓度维持在高于仅仅从大气吸收氧气 时培养基中存在的氧气浓度。示例性的携带氧气的物质包括全氟化碳例如FC-77(3M Corporation, St. Paul, Minnesota)，其用表面活性剂例如 Pluronic F-68 乳化，所述 Pluronic F-68可以从新泽西Parsippany的BASF Corp.公司获得。示例性携带氧气的物 质描述在美国专利No. 5，564，224中(例如第9栏第44行到第11栏第67行)，在此引为参 考。营养性培养基26也可以含有激素。适合的激素包括但不限于脱落酸、细胞分裂 素、植物生长素和赤霉素。脱落酸是倍半萜类植物激素，所述倍半萜类植物激素参与多 种植物生理过程(参见例如 MiIborrow，J. Exp. Botany 52:1145-1164(2001) ；Leung & Giraudat Ann. Rev. PlantPhysiol. Plant Mol. Biol. 49 199-123 (1998)) 植物生长素是 促进细胞分裂和生长的植物生长激素。在萌发培养基中使用的示例性植物生长素包括但不 限于2，4_ 二氯苯氧基乙酸、吲哚-3-乙酸、吲哚-3- 丁酸、萘乙酸和氯原酸。细胞分裂素 是影响分裂细胞的组织化的植物生长激素。在萌发培养基中使用的示例性细胞分裂素包 括但不限于例如6-苯甲基氨基嘌呤、6-糠基氨基嘌呤、二氢玉米素、玉米素、激动素和玉米 素核苷。赤霉素是一类二萜类植物激素(参见例如Krishnamoorthy，《赤霉素和植物生长》 (Gibberellins and Plant Growth), John ffiley&Sons, (1975))。可以在本发明的实施中 使用的赤霉素的代表性实例包括赤霉酸、赤霉素3、赤霉素4和赤霉素7。有用的赤霉素混 合物的实例是赤霉素4和赤霉素7的混合物(称为赤霉素4/7)，例如由伊利诺伊州芝加哥 的 Abbott Laboratories 销售的赤霉素 4/7。营养性培养基26也可以包括抗微生物剂。适合的抗微生物剂可以从密苏里州圣 路易斯的Sigma-Aldrich公司获得，以产品号#A5955销售。抗微生物剂可以例如lml/L的 浓度使用。当营养性培养基26中存在脱落酸时，它典型地以约lmg/L到约200mg/L的浓度范 围使用。当存在于营养性培养基26中时，赤霉素的浓度典型地在约0. lmg/L到约500mg/L 之间。植物生长素可以例如从0. lmg/L到200mg/L的浓度使用。细胞分裂素可以从0. Img/ L到100mg/L的浓度使用。示例性营养性培养基描述在美国专利No. 5，687，504(例如第8栏第63行到第9 栏第41行)和美国专利
发明者威廉·C·卡尔松, 杰弗里·E·哈特尔 申请人:韦尔豪泽Nr公司