专利名称：一种利用苹果废渣生产果胶酶生防诱导剂的方法
技术领域：
本发明属于微生物农药和环境保护技术领域。
背景技术：
我国苹果的种植面积、产量均居世界第一。随着苹果深加工规模的扩大，由此而产生了大量的苹果渣。而苹果渣极易腐败变臭，严重污染环境，苹果渣的处理一直是困扰苹果加工企业发展的重要问题之一。苹果渣主要由苹果皮、果芯和部分果肉组成，营养价值较高，是一种用途很广，使用价值和经济价值都很高的宝贵资源。然而，目前，果渣除少量被用于饲料及深加工外，绝大部分被遗弃，不仅造成资源的浪费，而且严重污染环境，如何合理利用苹果渣类饲料资源已成为迫切需要解决的问题。从另一个角度考虑，苹果渣的鲜渣含水80 %，粗蛋白质0. 9 %，粗纤维素5 %，钙0. 02 %，磷0. 02 %，钾0. 10 %。苹果渣里含有果胶、果糖和苹果酸，是微生物生长的良好营养底物，有利于微生物的生长。果胶酶是一类能够分解植物果胶成分的复合酶，在应用上主要用于果汁加工和果酒酿造。此外，果胶酶在茶和咖啡的发酵、桔子脱囊衣、麻料脱胶、废水处理、造纸、榨油等领域也有应用，而作为激发子在植物诱导抗病性方面的应用报道较好。一方面，果胶酶作为病原菌分泌的一种致病因子，它能够破坏寄主植物细胞壁结构，为病原菌提供营养，从而使致病菌能够在寄主组织中成功定殖、生长；另一方面，果胶酶能够激发植物多种防御反应。关于果胶酶诱导植物防御反应的研究最早见于二十世纪80年代，之后相继有相关报道。然而，上述果胶酶均来源于植物病原菌，对于植物非病原菌分泌的果胶酶诱导植物抗病性的研究还少有报道。目前生产果胶酶的培养基主要包括诱导物、碳源、氮源和微量元素。其中诱导物主要是果胶或富含果胶质的生物质，碳源以糖类和麦麸为主，氮源主要有蛋白胨、酵母膏、 玉米汁及无机氮盐。本发明以作者从环境中筛选的果胶酶高产菌株草酸青霉BZH-2002为生产菌，以废弃苹果渣和无机氮源为原料进行固态发酵生产果胶酶生物防治诱导剂。本发明涉及的菌株是可以分泌果胶酶的非致病微生物，获得的果胶酶可以诱导植物产物对植物病原菌的抗性。而且该能有效利用苹果渣中的果胶质。因此，用苹果废渣发酵生产果胶酶不仅可以降低生产成本，而且可以有效处理环境废弃物。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用苹果废渣为主要原料来生产果胶酶生物防治诱导剂的方法。本发明所述的果胶酶生防剂的生产方法如下1、菌种的活化及保存本发明所用草酸青霉BZH-2002菌株是从环境中分离、筛选获得，该菌株保存于PDA培养基上。2、种子制备培养基组成比例(W/W)如下苹果渣25%，硫酸铵2%，自来水73%， 少量磷酸盐。按上述比例配制的培养基分装于500mL三角瓶中，每瓶30g，于0. IMpa压力下蒸气灭菌20分钟，冷却后接种1所述方法制备的菌种，接种浓度IO6-IO7个孢子/g培养基，于温度^_30°C、环境湿度70%左右，接触空气条件下，静置培养48-72小时，制得草酸青霉种子。3、固态发酵按2所述的原料比配制培养基培养基分装于搪瓷盘中(长、宽、高分别为30cm、20cm、7cm)，每盘500g，不用灭菌，直接生料发酵。由步骤2培养获得的子种按物料比10%接种，接种后于30°C左右、环境湿度70%左右、接触空气条件下，静置培养72小时，用水浸提，即得果胶酶生防诱导剂。4、后处理每盘发酵产物加入IOOOmL去离子水浸提1小时，100目尼龙纱布挤压过滤，收集滤液；滤渣再用500mL去离子水浸提一次，再挤压过滤，收集滤液；两次滤液合并后定容至2000mL，于离心机上3000rpm下离心10分钟，上清液即为果胶酶提取液。5、果胶酶测定采用脱胶法，测定方法如下取5mL当天配制的果胶溶液(用 PH4. 8的0. 05M柠檬/柠檬酸三钠缓冲液和柑橘果胶配制)，置于25X250mm的试管中，加入 PH4. 8的0. 05M柠檬/柠檬酸三钠缓冲液10mL，试管于40°C恒温水浴预热平衡5分钟，加入5mL稀释一定倍数的酶液，并立即开始计时，反应3分钟后取样ImL放入试管，立即加入 2滴I2/KI溶液，摇勻，再加入2mL异丙醇，转动试管，观察沉淀是否消失，准确记录脱胶时间。酶活力单位定义在上述操作条件下，30分钟使1毫克果胶完全胶胶所需的酶量为一个酶活力单位。
具体实施例方式由本发明技术方案生产果胶酶生防诱导剂，具有生产成本低，环境友好的特点，产品能明显改善植物叶际微生物环境、诱导植物对多种植物病害的抗性。同时为高效处理苹果渣找到有效的处理方法。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。实施例1不同菌种利用苹果渣产果胶酶实验用上述的苹果渣培养基配方，分别实验了草酸青霉、黑曲霉、高大毛霉、灰霉等菌种，各菌利用苹果渣产果胶酶情况见表1。表 权利要求
1.利用苹果废渣生产果胶酶生防诱导剂的方法，其特征在于发酵培养基以苹果废渣为主要原料，生产步骤包括1、菌种的活化及保存本发明所用草酸青霉BZH-2002菌株是从环境中分离、筛选获得，该菌株保存于PDA培养基上。
2、种子制备培养基组成比例(W/W)如下苹果渣25%，硫酸铵2%，自来水73%，少量磷酸盐。按上述比例配制的培养基分装于500mL三角瓶中，每瓶30g，于0. IMpa压力下蒸气灭菌20分钟，冷却后接种1所述方法制备的菌种，接种浓度IO6-IO7个孢子/g培养基，于温度^-30°C、环境湿度70%左右，接触空气条件下，静置培养48-72小时，制得草酸青霉种子。
3、固态发酵按2所述的原料比配制培养基培养基分装于搪瓷盘中(长、宽、高分别为30cm、20cm、7cm)，每盘500g，不用灭菌，直接生料发酵。由步骤2培养获得的子种按物料比10%接种，接种后于30°C左右、环境湿度70%左右、接触空气条件下，静置培养72小时， 用水浸提，即得果胶酶生防诱导剂。
4、后处理每盘发酵产物加入IOOOmL去离子水浸提1小时，100目尼龙纱布挤压过滤， 收集滤液；滤渣再用500mL去离子水浸提一次，再挤压过滤，收集滤液；两次滤液合并后定容至2000mL，于离心机上3000rpm下离心10分钟，上清液即为果胶酶提取液。
5、果胶酶测定采用脱胶法，测定方法如下取5mL当天配制的果胶溶液(用pH4.8 的0. 05M柠檬/柠檬酸三钠缓冲液和柑橘果胶配制)，置于25X250mm的试管中，加入pH4. 8 的0. 05M柠檬/柠檬酸三钠缓冲液10mL，试管于40°C恒温水浴预热平衡5分钟，加入5mL 稀释一定倍数的酶液，并立即开始计时，反应3分钟后取样ImL放入试管，立即加入2滴1 % I2/KI溶液，摇勻，再加入2mL异丙醇，转动试管，观察沉淀是否消失，准确记录脱胶时间。酶活力单位定义在上述操作条件下，30分钟使1毫克果胶完全胶胶所需的酶量为一个酶活力单位。
全文摘要
本发明涉及一种利用苹果废渣为主要原料来生产果胶酶生物防治诱导剂的方法，本发明属于微生物农药和环境保护技术领域。发酵果胶酶选用的菌株为高产果胶酶且制剂诱导抗病效果明显的草酸青霉BZH-2002，果胶酶生防诱导剂的生产方法包括5个步骤菌种活化及保存、种子制备、固态发酵、后处理技术、果胶酶活力的测定，以苹果渣作为发酵培养基的主要碳源，无机硫酸铵为氮源。本发明技术方案不仅为苹果废渣的资源化利用提供了一条新途径，而且生产的果胶酶生防诱导剂可用于田间施用，对多种植物病害起到较好的防治作用。
文档编号A01P1/00GK102559639SQ20101061206
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者周巍, 宿燕明, 彭霞薇, 白志辉, 高莎 申请人:北京林业大学