专利名称：产生具有低总饱和脂肪酸含量的油的芸苔属植物的制作方法
技术领域：
本申请涉及芸苔属(Brassica)植物,更特别地涉及这样的芸苔属植物,其在脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶A2 (FATA2)基因座和/或脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶B (FATB)基因座具有修饰的等位基因并且产生具有低总饱和脂肪酸含量组合典型的、中等或高油酸含量的油。 背景近年来，高饱和脂肪饮食已与増加的胆固醇水平及増加的冠心病风险相关联。因此，目前饮食指导指出饱和脂肪摄入应该不超过总卡路里的10%。基于一天2000卡路里的饮食，这大约是一天20克饱和脂肪。尽管芥花油(canola oil)典型含有仅大约7%至8%的饱和脂肪酸，但是其饱和脂肪酸含量的降低会改善油的营养谱。概述本文基于突变的FATA2和FATB等位基因的发现，以及这些等位基因在芸苔属植物中控制总饱和脂肪酸含量的应用。如本文所述，含有这些等位基因的芸苔属植物可以生产具有低总饱和脂肪酸含量(即6%或更低总饱和物)的油或者具有非常低饱和物(即具有
3.6%或更低总饱和物)的油。这种芸苔属植物还可以包括突变的脂肪酸去饱和酶等位基因以调节油酸和α-亚麻酸含量至希望的终端应用的油。本文描述的芸苔属植物特别可用于生产芥花油以用于某些食品应用，因为所述植物不是基因修饰的。本文特征是芸苔属植物(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芥菜(Brassicajuncea)或芜青(Brassica rapa)植物)及其后代(例如种子)，其在两个或多个不同的脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶B (FATB)基因座(例如3个或4个不同的基因座)包括修饰的等位基因，其中每个修饰的等位基因导致产生相对于相应的野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽。植物可以是F1杂种。修饰的等位基因可以包括编码截短的FATB多肽的核酸。修饰的等位基因可以包括编码具有缺失螺旋/4-链折叠(4HBT)结构域或其部分的FATB多肽的核酸。修饰的等位基因可以包括编码具有影响底物特异性的残基的非保守取代的FATB多肽的核酸。修饰的等位基因可以包括编码具有影响催化活性的残基的非保守取代的FATB多肽的核酸。任何修饰的等位基因可以是突变的等位基因。在一些实施方案中，编码截短的FATB多肽的核酸包括选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO: I、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4。在一些实施方案中，植物含有核酸，所述核酸具有 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 3 ；SEQ IDNO :1 和 SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3 ；SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :2和 SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO USEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4;或者 SEQ ID NO :1、SEQID NO :2、SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
植物可以产生种子，种子产生具有大约2. 5%至5. 5%总饱和物含量的油。油的棕榈酸含量可以是大约I. 5%至3.5%。油的硬脂酸含量可以是大约O. 5%至2.5%。油可以具有大约78%至80%的油酸含量，大约8%至10%的亚油酸含量，不超过大约4%的α -亚麻酸含量(例如大约2%至4% )。本文还特征在于芸苔属植物(例如欧洲油菜、芥菜或芜青植物)及其后代(例如种子)，其在脂酰-ACP硫酯酶Α2 (FATA2)基因座包括修饰的等位基因，其中修饰的等位基因导致产生相对于相应的野生型FATA2多肽具有降低的硫酯酶活性的FATA2多肽(例如FATA2b多肽)。修饰的等位基因可以包括编码在相应于拟南芥属(Arabidopsis)FATA2多肽的氨基酸242-277的区域(SEQ ID NO 29)具有突变的FATA2多肽。所述FATA2多肽可以包括在第255位的脯氨酸由亮氨酸残基取代。植物可以是F1杂种。任何修饰的等位基因可以是突变的等位基因。
本文描述的任何植物进一步可以在FAD2基因座包括一或多个修饰的(例如突变的)等位基因。例如，在FAD2基因座的突变的等位基因可以包括编码HECGH基序中的谷氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸。在FAD2基因座的突变的等位基因可以包括编码DRDYGILNKV基序中的甘氨酸由谷氨酸取代或者KYLNNP基序中的亮氨酸由组氨酸取代的FAD2多肽的核酸。在一些实施方案中，植物在两个不同的FAD2基因座含有突变的等位基因，一个突变的等位基因包括编码HECGH基序中的谷氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸，一个突变的等位基因包括编码DRDYGILNKV基序中的甘氨酸由谷氨酸取代或者KYLNNP基序中的亮氨酸由组氨酸取代的FAD2多肽的核酸。本文所述的任何植物进一步可以在两个不同FAD3基因座包括修饰的等位基因(例如突变的等位基因)，其中一个修饰的等位基因包括编码第275位精氨酸由半胱氨酸取代的FAD3A多肽的核酸，以及其中一个修饰的等位基因包括在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的fad3B核酸序列。在另一方面，本文的特征是芸苔属植物(例如欧洲油菜、芥菜或者芜青植物)及其后代(例如种子)，其在两个或多个不同FATB基因座(例如3个或4个不同FATB基因座)包括修饰的等位基因，其中每个修饰的等位基因导致产生相对于相应的野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽，并且进一步在FAD2基因座包括修饰的等位基因，其中所述修饰的等位基因包括编码在HECGH基序中谷氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸。所述植物进一步可以包括在不同FAD2基因座的修饰的等位基因，所述修饰的等位基因包括编码在DRDYGILNKV基序中甘氨酸由谷氨酸取代或者在KYLNNP基序中亮氨酸由组氨酸取代的FAD2多肽的核酸。FATB修饰的等位基因可以包括编码截短的FATB多肽的核酸。编码截短的FATB多肽的核酸可以包括选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO :4。例如，植物可以含有具有 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQID NO :3和SEQ ID NO :4所示核苷酸序列的核酸。植物可以是F1杂种。任何修饰的等位基因可以是突变的等位基因。在另一方面，本文特征是生产油的方法。所述方法包括压榨产自本文所述至少一种芸苔属植物的种子；并且从压榨的种子中提取油，所述油在精炼、脱色和脱臭后具有大约2. 5-5. 5%的总饱和物含量。所述油进一步可以包括大约I. 6-2. 3%的二十碳烯酸含量。所述油进一步可以包括大约78-80%的油酸含量，大约8-10%的亚油酸含量和大约2-4%的α-亚麻酸含量。本文还特征在于生产芸苔属植物的方法。所述方法包括将在FATB基因座含有修饰的等位基因(例如突变的等位基因)的一或多种第一芸苔属亲本植物与在不同的FATB基因座含有修饰的等位基因(例如突变的等位基因)的一或多种第二芸苔属亲本植物杂交，其中每个修饰的等位基因导致产生相对于相应的野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽；以及选择一至五代在两个或多个不同FATB基因座具有修饰的等位基因的后代植物，由此获得所述芸苔属植物。在另一方面，本文特征是生产芸苔属植物的方法。所述方法包括获得在两个或多个不同FATB基因座(例如3个或4个不同FATB基因座)含有修饰的等位基因(例如突变的等位基因)的一或多种第一芸苔属亲本植物，其中每个修饰的等位基因导致产生相对于相应的野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽；获得在FATD2基因座含有修 饰的等位基因的一或多种第二芸苔属亲本植物，所述修饰的等位基因包括编码在HECGH基序中甘氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸；将所述一或多种第一芸苔属亲本植物与所述ー或多种第二芸苔属亲本植物杂交；以及选择一至五代在两个或多个不同FATB基因座具有修饰的等位基因以及在FAD2基因座具有修饰的等位基因的后代植物，由此获得所述芸苔属植物。任何修饰的等位基因可以是突变的等位基因。本文还特征在于生产芸苔属植物的方法。所述方法包括获得在两个或多个不同FATB基因座(例如3个或4个不同FATB基因座)含有修饰的等位基因(例如突变的等位基因)的一或多种第一芸苔属亲本植物，其中每个修饰的等位基因导致产生相对于相应的野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽；获得在FATA2基因座(例如FATA2b基因座)含有修饰的等位基因(例如突变的等位基因)的一或多种第二芸苔属亲本植物，所述修饰的等位基因包括编码在相应于拟南芥属FATA2多肽的氨基酸242-277的区域(SEQID NO 29)具有突变的FATA2多肽的核酸；将所述一或多种第一芸苔属亲本植物与所述ー或多种第二芸苔属亲本植物杂交；以及选择一至五代在两个或多个不同FATB基因座具有修饰的(例如突变的)等位基因以及在FADA2基因座具有修饰的(例如突变的)等位基因的后代植物，由此获得所述芸苔属植物。所述第一芸苔属亲本植物进ー步可以含有在FAD2基因座的突变的等位基因及在两个不同的FAD3基因座的突变的等位基因，所述FAD2突变的等位基因包括编码在HECGH基序中谷氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸，其中ー个FAD3突变的等位基因含有编码第275位精氨酸由半胱氨酸取代的FAD3A多肽的核酸，以及其中ー个FAD3突变的等位基因含有在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的fad3B核酸序列。在另一方面，本文特征是芥花油，其具有大约78-80%的油酸含量，大约8-10%的亚油酸含量，不超过大约4%的α -亚麻酸含量和大约I. 6-2. 3%的二十碳烯酸含量。棕榈酸含量可以是大约I. 5-3. 5%。硬脂酸含量可以是大约O. 5%-2.5%。二十碳烯酸含量可以是大约1.9-2. 2 %。α-亚麻酸含量可以是大约2%到大约4 %。本文还特征在于在FATA2基因座包括修饰的等位基因(例如突变的等位基因)的芸苔属植物的种子，所述修饰的等位基因(例如突变的等位基因)含有编码在相应所述多肽的氨基酸242-277的区域(SEQ ID NO 29)具有突变的FATA2多肽的核酸，所述种子产生具有78-80%的油酸含量、大约8-10%的亚油酸含量、不超过大约4%的α -亚麻酸含量以及I. 6-2. 3%的二十碳烯酸含量的油。种子可以是F2种子。所述芸苔属植物进一步可以包括在4个不同FATB基因座的修饰的(例如突变的)等位基因和/或在FAD2基因座的修饰的(例如突变的)等位基因和在两个不同的FAD3基因座的修饰的(例如突变的)等位基因，所述FAD2修饰的(例如突变的)等位基因可以包括编码在HECGH基序中谷氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸，一个FAD3修饰的(例如突变的)等位基因可以包括编码第275位精氨酸由半胱氨酸取代的FAD3A多肽的核酸，一个FAD3修饰的(例如突变的)等位基因可以包括在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的fad3B核酸序列。 本文还特征在于具有不超过大约3. 7%的总饱和脂肪酸含量和大约72-75%的油酸含量的芥花油。所述油可以具有大约2. 2-2. 4%的棕榈酸含量。所述油可以具有大约O. 5-0. 8%的硬脂酸含量。所述油可以具有大约I. 6-1. 9%的二十碳烯酸含量。总饱和脂肪酸含量可以是大约3. 4-3. 7 %。在另一方面，本文特征是本文描述的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包括一或多个修饰的(例如突变的)等位基因。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的相同意义。尽管可以使用类似于或等价于本文描述的方法和材料实施本发明，但是合适的方法和材料在以下描述。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献全文援引加入。在有冲突时，本说明书包括定义将起决定作用。另外，所述材料、方法和实施例是示例性的，不是限制性的。本发明的其它特征和优点在下述详细描述和权利要求中显而易见。附图描述图I 是完青 FatAl (Genbank 登录号 U17098)、拟南芥(Arapidopsis thaliana)FatAl (At3g25110 ；Genbank 登录号 NM_113415)、来自 15. 24 的欧洲油菜 FatAl、来自 15. 24的欧洲油菜FatA2、拟南芥FatA2 (At4gl3050 ；Genbank登录号NM_117374)和欧洲油菜pNL2 (Genbank登录号X73849)的核苷酸序列的对比。黑色框表示与对比产生的与共有序列相比的序列差异；标为“I”的位置示出独特于在欧洲油菜15. 24FatA2b同种型中的SNP，并且示出15. 24的C至T突变(Pix)变为Leu)。标为“2”的位置示出区分欧洲油菜FatA2a和欧洲油菜FatA2b同种型的SNP (见图4)。图2是来自拟南芥属、15. 24和010B240亲本的FatA2核苷酸序列的对比。在标为“ I ”的位置，“C，，变为“T” SNP独特于在15. 24种质中的BnFatA2b序列(标为15. 24FatA2 (1))0在标为“ 2 ”的位置，欧洲油菜Fat A2a和欧洲油菜Fat A2b之间的同种型差异是明显的(15. 24FatA2 (2)和0B240FatA2 (I)是欧洲油菜FatA2a同种型，而15. 24FatA2 (I)和0B240FatA2⑵是欧洲油菜FatA2b同种型)。序列差异以黑色标出。图3 是拟南芥 FatA2 (GenBank 登录号 ΝΡ_193041· I)与来自 15. 24 和 010Β240 的欧洲油菜FatA2的残基242-277的氨基酸序列的对比。15. 24中位置“I”的FatA2SNP(C变为T的突变)导致Pro变为Leu，而在位置“2”的同种型差异不产生同种型BnFatA2a和BnFatA2b中的氨基酸变化。图4是来自010B240和15. 24种质的BnFatA2和BnFatA2b序列的对比。位置“ I ”是指在BnFatA2b序列中独特于15. 24的“C”变为“T” SNP，其与低饱和物表型相关。也参见
图1-3。位置“2”是指
图1、2和3中的“2”位置，示出BnFatA2a和BnFatA2b同种型之间的序列差异。黑色框代表与010B240BnFatA2b相比的错配。不同图中的相似符号表不相似兀件。详细描述一般而言，本文提供子芸苔属植物，包括芸苔属的欧洲油菜、芥菜和芜青物种，它们产生种子，种子产生具有低总饱和脂肪酸含量(即6%或更低)或者具有非常低的饱和物(即具有3. 6%或更低)的油。如本文所用，总饱和脂肪酸含量是指豆蘧酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、花生酸(C20:0)、山嵛酸(C22:0)和木蜡酸(C24:0)的总和。例如，本文描述的芸苔属植物可以产生具有大约2. 5-5. 5%,3-5%,3-4. 5%,3. 25-3. 75%,
3.0-3. 5%,3. 6-5%,4-5. 5%或4_5%的总饱和脂肪酸含量的油。具有低或无总饱和脂肪酸 含量的油具有改良的营养品质并且可以帮助消费者降低他们对饱和脂肪酸的摄入。如本文所述，可以生产芸苔属植物，所述芸苔属植物产生具有低总饱和脂肪酸含量组合典型(60% -70% )、中等(71% -80% )或高(> 80% )油酸含量的种子油。这种芸苔属植物可以产生具有调节至希望的終端使用的油(例如油炸或者食品应用)的脂肪酸含量的种子油。例如，可以生产芸苔属植物，所述芸苔属植物产生具有低总饱和脂肪酸含量、60%-70%油酸含量和2%-5%的α-亚麻酸含量的种子。这种种子中的总多不饱和物(即亚油酸和α-亚麻酸总和)典型是<35%。具有这种脂肪酸含量的芥花油由于多不饱和含量而特别可用于油炸应用，其多不饱和含量低至足够可以具有改良的氧化稳定性用于油炸，并且高至足够赋予被油炸食品以希望的油炸风味，并且是日用型芥花油的改良。日用型芥花油的脂肪酸含量典型是大约6-8%总饱和脂肪酸、55-65%油酸、大约22-30%亚油酸和大约7-10%的α-亚麻酸。也可以生产芸苔属植物，所述芸苔属植物产生具有低总饱和脂肪酸含量、中等油酸含量(例如71%-80%油酸)和低α-亚麻酸含量(例如2%-5.0%)的种子。具有这种脂肪酸含量的芥花油具有高于具有更低油酸含量的油或者日用型芥花油的氧化稳定性，可用于包被(coating applications)(例如喷雾包覆(spray-coatings)),配制食品或者其它希望货架期稳定性的应用。另外，可以生产芸苔属植物，所述芸苔属植物产生具有低总饱和脂肪酸含量、高油酸含量(例如81%-90%油酸)和2-5%的α-亚麻酸含量的种子。具有低总饱和脂肪酸含量、高油酸和低α -亚麻酸含量的芥花油可特别用于需要高氧化稳定性和降低的饱和脂肪酸含量的食品应用。芸苔属植物作为降低的脂酰-ACP硫酷酶Α2 (FATA2)活性和/或降低的脂酰-ACP硫酷酶B(FATB)活性的结果，本文描述的芸苔属植物在种子油中具有低水平的总饱和脂肪酸。应理解在整个公开中，“植物”包括后代即特定植物或植物品系的后代，以及来自该植物的细胞或者组织。植物的后代包括在Fi、F2、F3、F4和后续代植物上形成的种子，或者在BCpBCpBQ和后续代植物上形成的种子。由植物产生的种子可以生长，然后自交(或者远交和自交，或者通过双单倍体双交(doubled))以获得突变等位基因纯和的种子。术语“等位基因”是指在特定基因座的基因的一或多个替代形式。如本文所用，“品系(line)”是指在个体之间对于至少ー个性状展示很小或无遗传变异的ー组植物。这种品系可以通过几代的自花授粉和选择或者使用组织或细胞培养技术从单个亲本无性繁殖而创建。如本文所用，术语“品种(variety)”是指用于商业生产的品系，包括杂种品种和开放传粉的品种。
脂酰-ACP硫酯酶水解叶绿体中的酰基-ACP，从ACP释放新合成的脂肪酸，有效地将其从质体中的进ー步链延长中移除。游离的脂肪酸然后可以离开质体，与辅酶A(CoA)结合并进入内质网(ER)中的Kennedy途径用于三酰甘油(TAG)生物合成。FATA家族成员相比于18:0和16:0-ACP更喜欢具有较小活性的油酰(C18:1) ACP底物，而FATB家族成员主要水解长度 8-18 个碳的饱和酰基-ACP。參见 Jones et al. ,Plant Cell 7:359-371 (1995)；Ginalski and Rhchlewski, Nucleic Acids Res 31:3291-3292(2003);和 Voelker T inGenetic Engineering(Setlow, JK, ed)Vol 18,111-133, Plenum Publishing Corp. , NewYork(2003)。降低的FATA2或FATB活性(包括不存在可检测活性)可以通过修饰内源性fatA2或fatB等位基因实现。内源性fatA2或fat3B等位基因可以通过例如诱变修饰或者通过使用同源重组用含有一或多个突变的变体(例如用定点诱变产生的)置換内源性植物基因而修饰。參见例如 Townsend et al. , Nature 459:442-445(2009) ；Tovkach et al. , Plant T. , 57 :747-757(2009);和 Lloyd et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 2232-2237(2005)。类似地，对于本文描述的其它基因，内源性等位基因可以通过诱变修饰或者通过使用同源重组用变体置換内源性基因而修饰。通过诱变获得的修饰的等位基因在本文称为突变的等位基因。降低的活性(包括不存在可检测活性)可以从与相应对照植物种子油相比，所述种子油中的饱和脂肪酸水平降低而推断。降低的活性也可以用脂酰-ACP水解測定在植物提取物中评估。參见例如 Bonaventure et al. , PlantCell 15:1020-1033(2003);和Eccleston and Ohlrogge, Plant Cell 10:613-622(1998)。可以使用一或多种诱变剂在种子或可再生植物组织群体中引入基因突变。合适的诱变剂包括例如甲基磺酸こ酯(EMS)、甲基N-亚硝基胍(MNNG)、溴化こ锭、双环氧丁烷、电离辐射、X-射线、UV射线及本领域已知的其它诱变剂。在一些实施方案中，可以使用诱变剂的组合如EMS和MNNG诱导诱变。可以筛选处理的群体或者该群体的后代的由突变导致的降低的硫酯酶活性，所述筛选例如通过确定群体的脂肪酸谱并将其与相应未诱变群体相比较而进行。突变可以在基因的任何部分，包括编码序列、内含子序列和调节元件，其使得产生的基因产物无功能或者具有降低的活性。合适的突变类型包括例如核苷酸的插入或缺失，及在野生型编码序列中的转换或颠换。这种突变可以导致氨基酸缺失或插入，及相应基因产物中的保守或非保守氨基酸取代。在一些实施方案中，突变是无义突变，其引入终止密码子(TGA、TAA或TAG)并产生截短的多肽。在一些实施方案中，突变是剪接位点突变，其改变或废除前mRNA序列的正确剪接，产生与野生型不同的氨基酸序列的蛋白质。例如，在RNA剪接过程中一或多个外显子可被跳过，产生缺少由所述被跳过的外显子编码的氨基酸的蛋白质。或者，阅读框可由不正确剪接而改变，一或多个内含子可被保留，可变剪接供体或受体可被产生，或者剪接可在可变位置起始，或者可变聚腺苷酸化信号可被产生。在一些实施方案中，引入ー个以上突变或者ー个以上突变类型。编码序列中的氨基酸插入、缺失或者取代可以例如破坏所得基因产物的关键α-螺旋或者折叠区域的构象。氨基酸插入、缺失或者取代也可以破坏结合，改变底物特异性，或者破坏对于基因产物活性重要的催化位点。本领域已知与较少数目的插入或缺失的氨基酸相比，较大数目连续氨基酸的插入或缺失更容易使基因产物无功能。非保守氨基酸取代可以将一个类别的氨基酸用不同类别的氨基酸置换。非保守取代可以在基因产物的电荷或疏水性方面产生大的变化。非保守氨基酸取代也可以在大残基侧链中产生大的变化，例如用丙氨酸残基取代异亮氨酸残基。非保守取代的例子包括用碱性氨基酸取代非极性氨基酸，或者用极性氨基酸取代酸性氨基酸。因为基因中仅有20种编码氨基酸，因此导致降低的活性的取代可以通过常规实验将不同类别的氨基酸掺入被靶向突变的基因产物的区域中而确定。在一些实施方案中，芸苔属植物在FATA2基因座含有突变的等位基因，其中突变的等位基因导致产生相对于相应野生型FATA2多肽具有降低的硫酯酶活性的FATA2多肽。例如，突变的等位基因可以包括编码在螺旋/4-链折叠(4HBT)结构域(也称为hot-dog结构域)内具有非保守取代或者影响催化活性或底物特异性的残基的非保守取代的FATA2 多肽的核酸。例如，芸苔属植物可以含有突变的等位基因，其包括编码在相应于FATA2多肽的残基242-277(编号基于与GenBank登录号NP_193041. 1，蛋白质(SEQ ID NO 30)；GenBank 登录号 NM_117374, mRNA 所不的拟南芥(Arabidopsis thaliana)FATA2 多妝的对比)的多肽区域(SEQ ID NO 29)具有取代的FATA2b多肽的核酸。FATA2的这个区域在拟南芥属和芸苔属中高度保守。另外，这个区域的许多残基在FATA和FATB中是保守的，包括259位的天冬氨酸，263位的天冬酰胺，265位的组氨酸，266位的缬氨酸，268位的天冬酰胺和271位的酪氨酸(编号基于与SEQ ID N0:30的对比)。也参见图3。263位的天冬酰胺和265位的组氨酸是催化三联体的一部分，256位的精氨酸参与决定底物特异性。也参见 Mayer and Shanklin, BMC Plant Biology 7:1-11 (2007)。SEQ ID NO :31 示出由外显子2-6编码的芸苔属FATA2b多肽的预测氨基酸序列，相应于SEQ ID NO :30所示的拟南芥序列的残基121-343。例如，FATA2多肽可以具有在相应于拟南芥属FATA2多肽的255位的位置(即SEQ ID NO 29的14位或者SEQ ID NO 31的135位)的脯氨酸被亮氨酸残基取代。相应于拟南芥属255位的欧洲油菜序列中的脯氨酸在欧洲油菜、芜青、芥菜、玉蜀黍(Zea mays)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、稻(Oryza sativa Indica)(稻米)、普通小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、麻疯树属(Jatropha)(树物种)、红花(Carthamus tinctorius)、萼距花(Cuphea hookeriana)、鳶尾(Iristectorum)、紫苏(Perilla frutescens)、向日葵(Helianthus annuus)、倒抢子(Garciniamangostana)、北美云杉(Picea sitchensis)、Physcomitrella patens subsp. Patens、油掠(Elaeis guineensis)、葡萄(Vitis vinifera)、美洲油掠(Elaeis oleifera)、油茶(Camellia oleifera)、落花生(Arachis hypogaea)、辣椒(Capsicum annuum)、萼距花、毛果杨(Populus trichocarpa)和藏揽(Diploknema butyracea)中是保守的。如实施例 2所述，在255位的突变与低总饱和脂肪酸表型、低硬脂酸表型、低花生酸表型和增加的二十碳烯酸表型相关。硬脂酸含量表型与二十碳烯酸表型负相关。在一些实施方案中，在FATA2基因座的突变的等位基因包括与SEQ IDN0:28或SEQID NO :32所示核苷酸序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97^^98%或99%)序列相同性的核苷酸序列。SEQ ID NO :28和32所示的核苷酸序列是来自欧洲油菜品系15. 24的fatA2b基因的代表性核苷酸序列。如本文所用，术语“序列相同性”是指任何给定核酸序列与靶核酸序列之间的相似性程度。相似性程度以序列相同性百分比表示。序列相同性百分比通过确定对比的核酸序列中匹配的位置数，将所述匹配的位置数除以对比的核苷酸总数并乘以100而计算。匹配的位置是指在对比的核酸序列中相同位置出现相同核苷酸的位置。序列相同性百分比还可以针对任何氨基酸序列确定。为确定序列相同性百分比，使用来自含有BLASTN版本2. O. 14和BLASTP版本2. O. 14的BLASTZ单机版本的BLAST 2Sequences(B12seq)程序将靶核酸或者氨基酸序列与鉴别的核酸或氨基酸序列进行比较。这个BLASTZ单机版本可以得自Fish&Richardson的网站(www. fr. com/blast)或者美国政府的国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。解释如何使用B12seq程序的指南可以在BLASTZ所附的readme文件中找到。B12seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为比较两个核酸序列，选项设置如下_i被设 为含有第一个待比较核酸序列的文件(例如C:\seql. txt) ;_j被设为含有第二个待比较核酸序列的文件(例如C:\seq2. txt) ;_p被设为blastn ;_o被设为任何希望的文件名(例如C:\output. txt) ;_q被设为-I ;_r被设为2 ;所有其它选项是它们的默认设置。下列命令将产生输出文件，含有两个序列之间的比较C:\B12seq_i c:\seql.txt_j c:\seq2.txt_pblastn-o c:\output.txt-q-l_r 2。如果祀序列与鉴别的序列的任何部分具有同源性，贝丨J指定输出文件将呈现那些同源性区域为对比的序列。如果靶序列与鉴别的序列的任何部分都不具有同源性，则指定输出文件不呈现对比的序列。一旦对比，通过计数从任何匹配位置起始并以任何其它匹配位置结束的与鉴别序列的序列对比的靶序列的连续核苷酸数目确定长度。匹配的位置是其中相同的核酸存在于靶和鉴别序列中的任何位置。靶序列中存在的缺ロ不计数，因为缺ロ不是核苷酸。类似地，鉴别序列中存在的缺ロ也不计数，因为靶序列核苷酸被计数，而不是计数来自鉴别序列的核苷酸。在特定长度上的相同性百分比通过计数该长度上的匹配位置数并将该数除以长度然后将所得值乘以100而确定。例如，如果(i)500个碱基的核酸靶序列与对象核酸序列进行比较，(ii)B12seq程序呈现来自靶序列的200碱基与对象序列的该区域对比(aligned),其中该200个碱基区域的第一个和最后一个碱基是匹配的，以及(iii)该200个对比的碱基中的匹配数是180，则该500个碱基核酸靶序列含有的长度为200，该长度上的序列相同性是90% (即180,200x100 = 90)。应理解与鉴别序列对比的单个核酸靶序列内的不同区域可以有它们各自的相同性百分比。应注意相同性百分比值近似为最接近的十分之一。例如78. 11,78. 12,78. 13和78. 14近似为78. 1，而78. 15,78. 16,78. 17,78. 18和78. 19近似为78. 2。还应注意长度值
总是整数。在一些实施方案中，芸苔属植物在FATB基因座含有突变的等位基因，其中突变的等位基因导致产生相对于相应野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽。在一些实施方案中，芸苔属植物在两个或多个不同的FATB基因座含有突变的等位基因。在ー些实施方案中，芸苔属植物在3个不同的FATB基因座含有突变的等位基因或者在4个不同的FATB基因座含有突变的等位基因。欧洲油菜含有6个不同的FATB同种型(即在不同基因座的不同形式的FATB多肽)，它们在本文被称为同种型1-6。SEQ ID NO :18-21和26-27分别示出编码欧洲油菜的FATB同种型1-6的核苷酸序列。SEQ ID NO :18-21和26-27所示核苷酸序列由ClustalW算法测得具有82% -95%序列相同性。
例如,芸苔属植物可以在编码FATB同种型I、同种型2、同种型3、同种型4、同种型5或同种型6的核苷酸序列中具有突变。在一些实施方案中，植物可以在编码同种型I和2 ;同种型I和3 ;同种型I和4 ;同种型I和5 ;同种型I和6 ;同种型2和3 ;同种型2和4 ;同种型2和5 ;同种型2和6 ;同种型3和4 ;同种型3和5 ;同种型3和6 ;同种型4和5 ;同种型4和6 ;同种型5和6 ;同种型1、2和3 ;同种型1、2和4 ;同种型1、2和5 ;同种型I、2和6 ;同种型2、3和4 ;同种型2、3和5 ;同种型2、3和6 ;同种型3、4和5 ;同种型3、5和6 ;同种型4、5和6 ;同种型1、2、3和4 ;同种型1、2、3和5 ;同种型1、2、3和6 ;同种型1、2、4和6 ;同种型1、3、4和5 ;同种型1、3、4和6 ;同种型1、4、5和6 ;同种型2、3、4和5 ;同种型2、3、4和6 ;或者同种型3、4、5和6的核苷酸序列中具有突变。在一些实施方案中，芸苔属植物可以在编码FATB同种型1、2和3 ;同种型 1、2、和4 ;同种型2、3和4 ;或者同种型I、
2、3和4的核苷酸序列中具有突变。在一些实施方案中，突变导致FATB多肽的4HBT结构域或其部分缺失。FATB多肽典型含有4HBT结构域的串联重复，其中N-末端4HBT结构域含有影响底物特异性的残基(例如两个保守的甲硫氨酸，保守的赖氨酸，保守的缬氨酸和保守的丝氨酸)并且C末端4HBT结构域含有影响催化活性的残基(例如保守的天冬酰胺、保守的组氨酸和保守的半胱氨酸的催化三联体)和影响底物特异性的残基(例如保守的色氨酸)。参见 Mayer and Shanklin, T. Biol. Chem. 280 :3621-3627 (2005)。在一些实施方案中，突变导致4HBT结构域中的残基或者影响底物特异性的残基的非保守取代。在一些实施方案中，突变是剪接位点突变。在一些实施方案中，突变是无义突变，其中引入过早终止密码子(TGA、TAA或TAG)，导致产生截短的多肽。SEQ ID NO :1-4分别示出编码同种型1-4的核苷酸序列，并且含有导致截短的FATB多肽的举例性无义突变。SEQ ID NO :1是同种型I的核苷酸序列，在第154位具有突变，其使密码子从CAG变为TAG。SEQ ID NO 2是同种型2的核苷酸序列，在第695位具有突变，其使密码子从CAG变为TAG。SEQ ID NO 3是同种型3的核苷酸序列，在第276位具有突变，其使密码子从TGG变为TGA。SEQ ID NO 4是同种型4的核苷酸序列，在第336位具有突变，其使密码子从TGG变为TGA。通过在突变品系中进行遗传杂交可以将两个或多个不同突变FATB等位基因组合在一个植物中。例如，在编码同种型I的FATB基因座具有突变的等位基因的植物可以与在编码同种型2的FATB基因座具有突变的等位基因的第二植物杂交或交配。来自杂交的种子被种植，使所产生的植物自交以获得后代种子。这些后代种子可以被筛选以鉴别携带两个突变的等位基因的那些种子。在一些实施方案中，经过多代(例如2-5代)选择后代以获得在两个不同的FATB基因座具有突变的等位基因的植物。类似地，在两个或多个不同FATB同种型具有突变的等位基因的植物可以与在两个或多个不同FATB等位基因具有突变的等位基因的第二植物杂交，并且可以筛选后代种子以鉴别在4个或更多个不同FATB基因座携带突变的等位基因的那些种子。同样，可以经过多代选择后代以获得希望的植物。在一些实施方案中，在FATA2基因座的突变的等位基因和在两个或多个(例如3个或4个)不同FATB基因座的突变的等位基因可以组合在植物中。例如，在FATA2基因座具有突变的等位基因的植物可以与在两个或多个不同的FATB基因座具有突变的等位基因的第二植物杂交或交配。产生自杂交的种子被种植，使所产生的植物自交以获得后代种子。可以筛选这些后代种子以鉴别携带突变的FATA2和FATB等位基因的那些种子。可以经过多代(例如2-5代)选择后代以获得在FATA2基因座具有突变的等位基因和在两个或多个不同FATB基因座具有突变的等位基因的植物。如本文所述，在FATA2b基因座具有突变的等位基因和在三个或四个不同FATB基因座具有突变的等位基因的植物具有低总饱和脂肪酸含量，其在不同生长条件是稳定的，即在生长季节更不易于由于更暖或更冷温度导致变异。由于FatB和FatA酶分别对于16:0和18:0的不同的底物谱，在FatA2和FatB基因座具有突变的植物展现种子油中16:0和18:0的量均实质降低。在FATA2和/或FATB基因座具有突变的等位基因的芸苔属植物可以包括在控制脂肪酸去饱和酶活性的基因座的突变的等位基因，由此可以调节油酸和亚麻酸水平至油的終端用途。例如，这种芸苔属植物也可以展示降低的Λ-15去饱和酶(也已知为FAD3)活性，其參与亚油酸向α-亚麻酸的酶促转化。编码△-15脂肪酸去饱和酶的基因在芸苔属和拟南芥属中称为fad3。高等植物fad3基因的序列披露于Yadav et al. ,Plant Physiol.,103 :467-476(1993), WO 93/11245 和 Arondel et al.，Science, 258 1353-1355 (1992)。Δ-15去饱和酶的降低的活性(包括不存在可检测活性)可以通过诱变实现。降低的活性(包括不存在可检测活性)可以从植物中与相应对照植物相比亚麻酸(产物)的降低的水平及在一些情况中亚油酸(底物)的增加的水平推断。例如，亲本植物可以含有来自APOLLO或STELLAR欧洲油菜品种的赋予低亚麻酸的突变。STELLAR和APOLLO品种在Universityof Manitoba (Manitoba, Canada)开发。在一些实施方案中，亲本含有来自IMC02的赋予低亚麻酸表型的fad3A和/或fad3B突变。MC02含有在fad3A和fad3B基因中的突变。fad3A基因含有在从基因组DNA的ATG开始编号的第2565位的C到T突变，导致在编码的FAD3A多肽的第275位的精氨酸被半胱氨酸取代。fad3B基因含有在从基因组DNA的ATG开始编号的第3053位的G到A突变，位于外显子-内含子剪接位点识别序列中。MC02得自杂交IMCOIxWestar。參见美国专利号5，750，827的实施例3。IMC01保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号40579。IMC02保藏在ATCC，保藏号PTA-6221。在一些实施方案中，芸苔属植物含有在FATA2基因座的突变的等位基因和在FAD3基因座的突变的等位基因。例如，芸苔属植物可以含有在FATA2基因座的突变的等位基因和在FAD3基因座的突变的等位基因，其含有编码在第275位的精氨酸由半胱氨酸取代的FAD3多肽的核酸和/或在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的核酸。芸苔属植物也可以含有在两个或多个不同FATB基因座(3个或4个不同基因座)和FAD3基因座的突变的等位基因，其含有编码在第275位的精氨酸由半胱氨酸取代的FAD3多肽的核酸和/或在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的核酸。芸苔属植物也含有在FATA2基因座的突变的等位基因、在两个或多个不同FATB基因座(3个或4个不同基因座)和FAD3基因座的突变的等位基因，其含有编码在第275位的精氨酸由半胱氨酸取代的FAD3多肽的核酸和/或在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的核酸。芸苔属植物也可以具有降低的Λ-12去饱和酶活性，该酶參与油酸向亚油酸的酶促转化，赋予种子油中的中等或高油酸含量。芸苔属植物可以展示降低的Λ-12去饱和酶(也已知为FAD2)活性组合降低的FATA2和/或FATB活性。来自欧洲油菜的野生型fad2基因的序列(称为D形式和F形式)披露于WO 98/56239。Λ-12去饱和酶活性的降低(包括不存在可检测活性)可以通过诱变实现。降低的△-12去饱和酶活性可以从植物中与相应对照植物相比亚油酸(产物)的降低的水平及油酸(底物)的增加的水平推断。合适的fad2突变的非限制性例子包括在fad2-D基因内的核苷酸316的G到A突变，其导致赖氨酸残基取代HECGH(SEQ ID NO :5)基序中的谷氨酸。这种突变在品种MC129内发现，该品种已被保藏在ATCC，保藏号40811。另一种合适的fad2突变可以是在fad2_F基因的核苷酸515的T到A突变，其导致组氨酸残基取代KYLNNP (SEQ ID NO 6)基序中的亮氨酸(Fad2F多肽的氨基酸172)。这种突变在品种Q508内发现。参见美国专利号6，342，658。fad2突变的另一个例子是fad2-F基因的核苷酸908的G到A突变，其导致谷氨酸取代DRDYGILNKV (SEQID NO 7)基序中的甘氨酸(Fad2F多肽的氨基酸303)。这种突变在品种Q4275内发现，该品种已被保藏在ATCC，保藏号97569。参见美国专利号6，342，658。合适的fad2突变的另一个例子是fad2-F基因的核苷酸1001 (从ATG开始编号)的C到T突变，其导致异亮氨酸取代苏氨酸(Fad2F多肽的氨基酸334)。这种突变在高油酸品种Q7415中发现。典型地，存在fad2_D或fad2_F突变之一赋予种子油中等油酸表型(例如70_80%油酸)，而fad2-D和fad2-F突变均存在赋予更高油酸表型(例如> 80%油酸)。例如，Q4275 含有来自MC129的fad2-D突变和在氨基酸303的fad2_F突变。Q508含有来自MC129的fad2-D突变和在氨基酸172的fad2_F突变。Q7415含有来自MC129的fad2_D突变和在氨基酸334的fad2-F突变。在Q4275、Q508和Q7415中存在两个fad2突变赋予大于80%油酸的高油酸表型。因此，在一些实施方案中，芸苔属植物含有在FATA2基因座(例如FATA2b基因座)的突变的等位基因和在FAD2基因座的突变的等位基因。例如，芸苔属植物可以含有上述的在FATA2基因座的突变的等位基因和在FAD2基因座的突变的等位基因。芸苔属植物还可以含有上述在两个或多个不同FATB基因座(3个或4个不同基因座)和FAD2基因座的突变的等位基因。芸苔属植物还可以含有上述在FATA2基因座的突变的等位基因、在两个或多个不同FATB基因座(3个或4个不同基因座)的突变的等位基因和在FAD2基因座的突变的等位基因。在一些实施方案中，芸苔属植物含有上述在FATA2基因座的突变的等位基因、在FAD2基因座的突变的等位基因和在FAD3基因座的突变的等位基。芸苔属植物还可以含有上述在两个或多个不同FATB基因座(3个或4个不同基因座)的突变的等位基因、在FAD2基因座的突变的等位基因和在FAD3基因座的突变的等位基因。芸苔属植物还含有上述在FATA2基因座的突变的等位基因、在两个或多个不同FATB基因座(3个或4个不同基因座)的突变的等位基因、在FAD2基因座的突变的等位基因和在FAD3基因座的突变的等位基因。杂种芸苔属品种的产生杂种芸苔属品种可以通过防止雌性亲本植物(即种子亲本)的自花授粉、允许雄性亲本植物的花粉对这种雌性亲本植物的授粉以及使F1杂种种子在雌性植物上形成而产生。雌性植物的自花授粉可以通过在花发育早期使花去雄而防止。或者，可以用雄性不育形式在雌性亲本植物上阻止花粉形成。例如，雄性不育可以是细胞质雄性不育(CMS)、细胞核雄性不育、分子雄性不育，其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成，或者可以通过自交不亲和性而产生。含有CMS的雌性亲本植物是特别有用的。CMS可以是例如ogu(Ogura)、nap、pol、tour或mur型。对于Ogura型CMS的描述，参见例如Pellan-Delourme and Renard,1987, Proc.7边 Int. Rapeseed Conf. , Poznan, Poland,ρ· 199-203和Pellan-Delourme and Renard, 1988,Genome30 :234-238.对于nap、pol、tour和 mur 型 CMS 的描述，见 Riungu and McVettv, 2003, Can. T. Plant Sci. ,83 :261-269。在其中雌性亲本植物是CMS的实施方案中，雄性亲本植物典型含有育性恢复基因以保证F1杂种是可育的。例如，当雌性亲本含有Ogura型CMS时,使用含有可以克服Ogura型CMS的育性恢复基因的雄性亲本。这种育性恢复基因的非限制性例子包括Kosena型育性恢复基因(美国专利号5，644，066)和Ogura育性恢复基因(美国专利号6，229，072和6，392，127)。在其中雌性亲本是CMS的其它实施方案中，可以使用不含育性恢复基因的雄性亲本。从这种亲本产生的F1杂种是雄性不育的。雄性不育杂种种子可以雄性可育种子套种以提供花粉用于在所得雄性不育植物上结种。本文描述的方法可以用于形成单交芸苔属F1杂种。在这种实施方案中，可以生长亲本植物为基本上均勻邻接(substantially homogeneous adjoining)群体以促进雄性亲本植物与雌性亲本植物的天然异花传粉。在雌性亲本植物上形成的F1种子经传统方式选择性收获。人们可以大量生长两种亲本植物并收获雌性亲本上形成的Fl杂交种子和作为自花授粉结果而在雄性亲本上形成的种子的混合物。或者，可以进行三交，其中单交F1杂种 用作雌性亲本并与满足第一次杂交的雌性亲本的脂肪酸参数的不同雄性亲本杂交。在此，假设是大量种植，植物油的总体油酸含量可以相对于单交杂种而降低；但是，由于当进行第二次杂交时两个亲本的良好的农学表现可以进一步增强种子收率。作为另一种替代方式，可以产生双交杂种，其中两个不同单交的F1后代自身杂交。可以利用自交不亲和性特别有利地防止当形成双交杂种时雌性亲本的自花授粉。本文描述的杂种具有良好农学性质并展示杂种优势，其导致种子收率超过形成F1杂种所用的每个亲本的种子收率。例如，收率可以高于一或两个亲本的收率至少10%(例如10% -20%,10% -15%,15% -20%或者25% -35% )。在一些实施方案中，当在类似生长条件下生长时，所述收率超过开放传粉的春季canola品种如46A65 (Pioneer)或Q2 (University of Alberta)的收率。例如，收率可以高于开放传粉品种的收率至少10%(例如 10% -15%或者 15% -20% )。本文描述的杂种典型产生具有非常低水平芥子油苷(< 30 μ mol/g去脂肪膳食，在8. 5%水分含量)的种子。特别地，杂种可以产生具有<20 μ mol芥子油苷/g去脂肪膳食的种子。由此，杂种可以掺入赋予低芥子油苷水平的突变。例如参见美国专利号5，866，762。芥子油苷水平可以根据已知技术确定，包括高效液相色谱(HPLC)Jn ISO 9167-1 1992 (E)所述，用于定量总的完整芥子油苷，以及气-液色谱，用于定量提取的和纯化的脱硫芥子油苷的三甲基甲硅烷基(TMS)衍生物。用于确定芥子油苷水平的HPLC和TMS方法分析去脂肪或不含油的膳食。芥花油本文描述的芸苔属植物可用于产生具有低总饱和脂肪酸或不含总饱和脂肪酸的芥花油。例如，得自本文所述芸苔属植物种子的油可以具有大约2. 5-5. 5%、3-5%、3-4. 5%,3. 25-3. 75 %,3. 0-3. 5 %,3. 4-3. 7%,3. 6-5 %A~5. 5 %、4_5 %、或 4. 25-5. 25 %的总饱和脂肪酸含量。在一些实施方案中，油具有大约4%至大约5. 5%的总饱和脂肪酸含量，大约60-70% (例如62-68%、63-67%、或65-66%)的油酸含量和大约2. 5-5 %的α-亚麻酸含量。在一些实施方案中，油具有大约2.5-5.5% (例如4-5%)的总饱和脂肪酸含量，大约71-80% (例如72-78%、73-75%、74-78%或75-80% )的油酸含量和大约 2-5. O % (例如 2. 0-2. 8%,2. 25-3%,2. 5-3 % ,3-3. 5 % ,3. 25% -3. 75%,3. 5-4%,3. 75-4. 25 % ,4-4. 5% A. 25-4. 75% A. 5-5 % )的α -亚麻酸含量。在一些实施方案中，芥花油可以具有2. 5-5. 5 %的总饱和脂肪酸含量，78-80 %的油酸含量和不超过4% (例如
2-4%)的α-亚麻酸含量。在一些实施方案中，油具有大约3. 5-5.5% (例如4_5%)的总饱和脂肪酸含量，大约81-90% (例如82-88%或83-87%油酸)的油酸含量和2_5% (例如2-3%或3-5%)的α-亚麻酸含量。在一些实施方案中，油具有不超过3. 7% (例如大约3. 4-3. 7%或3. 4-3. 6% )的总饱和脂肪酸含量和大约72-75%的油酸含量。本文描述的低饱和物油可以具有大约I. 5-3. 5% (例如2-3%或2. 2-2.4% )的棕榈酸含量。这种油的硬脂酸含量可以是大约0.5-2.5% (例如O. 5-0. 8%、1-2%或I. 5-2. 5% )。本文描述的油除子低总饱和物含量之外还可以具有大于I. 6%例如I. 6-1. 9%,
I.7-2. 3%U. 8-2. 3%或 I. 9-2. 3%的二十碳烯酸含量。 本文描述的油除子低总饱和物含量之外还可以具有大约3-20%、例如3. 4-5%,
3.75-5%,8-10%,10-12%,11-13%,13-16%^； 14-18%的亚油酸含量。本文描述的油除子低总饱和物含量之外还可以具有小于2% (例如小于1%、O. 5%、0· 2%或O. 1% )的芥子酸含量。种子的脂肪酸组成可以通过首先从种子样品(例如10或更多个种子的大量种子样品)压榨和提取油而确定。种子中的TAG被水解产生游离脂肪酸，其然后可以转化为脂肪酸甲酯并用本领域技术人员已知技术分析，例如根据AOCS Procedure Ce le_91的气-液色谱(GLC)。可以根据AOCSProcedure Am-192 (revised 1999)在完整种子上进行近红外(NIR)分析。从本文描述的植物收获的种子可以用于生产粗芥花油或精制、脱色和脱臭的(RBD)芥花油，具有低总饱和脂肪酸含量或不含总饱和脂肪酸含量。收获的canola种子可以经本领域已知技术压榨。种子可以通过用水喷雾种子而调节(temper)，增加水分至例如8.5%。调节的种子可以用间隙为O. 23-0. 27_光面辊压片。可以加热压片以失活酶，促进进一步的细胞破裂，凝聚(coalesce)油滴，或者聚集蛋白质颗粒以利于提取过程。典型地，从加热的canola压片中取出油，通过螺杆压榨机从压片中压榨出大部分油。所得压榨的饼含有一些残余油。从压榨操作中产生的粗制油典型地穿过具有开槽线引流顶部(slotted wiredrainage top)的沉降罐，以除去在螺杆压榨操作中与油一起挤出的固体。澄清的油可以穿过板框式压滤机以除去剩余的小固体颗粒。从螺杆压榨操作产生的Canola压榨饼可以用商业正己烷提取。从提取过程回收的芥花油与来自螺杆压榨操作的澄清油合并，产生混合的粗制油。游离脂肪酸和胶质典型地通过在分批式精炼罐中加热而从粗制油中去除，精炼罐中加入食品级磷酸。酸将不能水合的磷脂转化为可水合形式，并且螯合粗制油中存在的少量金属。磷脂和金属盐与阜料(soapstock) —起从油中除去。用氢氧化钠溶液处理油-酸混合物以中和酸-油混合物中的游离脂肪酸和磷酸。中和的游离脂肪酸、磷脂等(皂料)从中和的油中吸取掉。可以进行水洗以进一步降低油的皂含量。如果希望，可以用本领域已知技术在使用前将油脱色和脱臭。
得自本文描述的植物的油可以具有增加的氧化稳定性，其可以通过使用例如Oxidative Stability Index Instrument (例如来自 Omnion, Inc. , Rockland,MA)根据AOCSOfficial Method Cd 12b_92 (revised 1993)进行测量。氧化稳定性经常表示为“AOM”小时数。食品组合物本文还特征在于含有上述油的食品组合物。例如，具有低或更低)或不含(3. 5%或更低)总饱和脂肪酸含量组合典型(60-70%)、中等(71-80%)或者高(>80%)油酸含量的油可以用于替代或者降低各种食品中的饱和脂肪酸和氢化油(例如部分氢化油)的量，从而饱和脂肪酸和反式脂肪酸的水平在食品中被降低。特别地，具有低总饱和脂肪酸含量和中等或高油酸含量组合低亚麻酸含量的芥花油可以用于替代或者降低加工或包装食品中的饱和脂肪和部分氢化油的量，这些食品包括焙烤食品如饼干(cookies)、松饼、面包圈、糕饼(例如toaster pastries)、馅饼填充料、馅饼面皮、披萨面皮、糖霜(frostings)、面包、饼干(biscuits)和蛋糕、早餐谷类食物、breakfast bars、布丁和饼干(crackers)。 例如，本文描述的油可以用于生产夹心饼干，所述夹心饼干在饼干和/或奶油填充料(cMme filling)中含有降低的饱和脂肪酸并且不含或者含降低水平的部分氢化油。这种饼干组成可以例如除子芥花油之外还包括面粉、甜味剂(例如糖、糖蜜、蜂蜜、高果糖玉米糖衆、人工甜味剂如sucralose、糖精、阿斯巴特(aspartame)或乙酰磺胺酸钾(acesulfame potassium),及其组合)、蛋、盐、食用香料(例如巧克力、香草或朽1檬)、发酵剂(例如碳酸氢钠或其它焙烤酸(baking acid)如一水合磷酸一钙、硫酸钠铝、酸式焦磷酸钠、磷酸钠招、磷酸二韩、glucano-deltalactone或酒石酸氢钾，或其组合)，以及任选地，包括乳化剂(例如脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、脂肪酸乙二醇一酯和二酯、脂肪酸甘油-乳糖酯、乙氧基化或琥珀酰化甘油一酯和甘油二酯、卵磷脂、二乙酰酒石酸酯或者甘油一酯和甘油二酯、甘油蔗糖酯，及其组合)。奶油填充料组成可以除芥花油之外还包括甜味剂(例如糖粉、砂糖、蜂蜜、高果糖玉米糖浆、人工甜味剂，或其组合)、食用香料(例如香草、巧克力或柠檬)、盐和任选地包括乳化剂。芥花油(例如具有低总饱和脂肪酸含量、低油酸和低亚麻酸含量)也可以由于多不饱和含量而用于油炸应用，其多不饱和含量低至足够可以具有改良的氧化稳定性用于油炸，并且高至足够赋予被油炸食品以希望的油炸风味。例如，芥花油可以用于生产油炸食品如薄片小吃(例如玉米片或薯片)、薯条或者其它速食食品。本文描述的油还可以用于配制用于食品(例如谷类食品或小吃如饼干)的喷雾包覆。在一些实施方案中，喷雾包覆可以包括其它植物油如葵花油、棉籽油、玉米油或大豆油。喷雾包覆也可以包括抗氧化剂和/或调味料。本文描述的油还可以用于生产敷料(dressings)、蛋黄酱(mayonnaises)和沙司(sauces)以提供产品的总饱和脂肪含量降低。低饱和油可以用作基础油，以产生结构脂肪溶液(structured fat solutions)如微波炉爆米花固体脂肪或者芥花油脂配制品。本发明将在下述实施例中进一步描述，它们不限制权利要求中描述的本发明的范围。实施例在本文描述的表中，脂肪酸由碳链长度及链内双键的数目指代。例如，C140是指C14:0或肉豆蘧酸；C160是指C16:0或棕榈酸；C180是指C18:0或硬脂酸;C181是指C18:l或油酸；C182是指C18:2或亚油酸；C183是指C18:3或α -亚麻酸；C200是指C20:0或二十酸；C201是指C20:1或二十碳烯酸；C220是指C22:0或二十二酸；C221是指C22:1或芥子酸；C240是指C24:0或二十四酸；及C241是指C24:1或二十四碳烯酸。“总饱和物(TotalSats) ”是指全部C140、C160、C180、C200、C220和C240。针对每个特定样品提供子代表性脂肪酸谱。 除非特别指出，所有百分比均是指基于油中脂肪酸总Wt %的Wt %。实施例I 芸苔属棺物品系15. 24产生具有高油酸及低总饱和脂肪酸含量的油的植物得自称作90A24的植物与称作90122的植物的杂交。90A24植物得自选自MC 129品系(ATCC保藏号40811 ;美国专利号5，863，589)的高油酸的HIO 11_5与选自MC 144品系(ATCC保藏号40813 ;美国专利号5，668，299)的低饱和脂肪酸的LS 6_5之间的杂交。90122植物得自选自MC 144品系(ATCC保藏号40813)的低饱和脂肪酸的LS 4_3与选自IMC 01品系(ATCC保藏号40579 ;美国专利号5，750，827)的低α -亚麻酸的D336之间的杂交。表I含有LS6-5、LS4-3和HIO 11-5亲本品系以及IMC 01的脂肪酸谱。
权利要求
1.在脂酰-酰基-ACP硫酯酶A2(FATA2)基因座包含突变的等位基因的芸苔属植物，其中所述突变的等位基因导致产生相对于相应野生型FATA2多肽具有降低的硫酯酶活性的FATA2多肽。
2.权利要求I的植物，其中所述突变的等位基因包含编码在相应于FATA2多肽的第·242-277位氨基酸的区域(SEQ ID NO:29)具有突变的FATA2多肽的核酸。
3.权利要求2的植物，其中所述FATA2多肽包含在第255位脯氨酸由亮氨酸残基的取代。
4.权利要求I的植物，所述植物进ー步在FAD2基因座包含突变的等位基因，所述突变的等位基因包含编码在HECGH基序中谷氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸。
5.权利要求I的植物，所述植物进ー步在FAD2基因座包含突变的等位基因，所述突变的等位基因包含编码在DRDYGILNKV基序中甘氨酸由谷氨酸取代或者在KYLNNP基序中亮氨酸由组氨酸取代的FAD2多肽的核酸。
6.权利要求4的植物，所述植物进ー步在不同FAD2基因座包含突变的等位基因，所述突变的等位基因包含编码在DRDYGILNKV基序中甘氨酸由谷氨酸取代或在KYLNNP基序中亮氨酸由组氨酸取代的FAD2多肽的核酸。
7.权利要求I或6的植物，所述植物进ー步在两个不同FAD3基因座包含突变的等位基因，其中一个所述突变的等位基因包含编码在第275位的精氨酸由半胱氨酸取代的FAD3A多肽的核酸，另ー个所述突变的等位基因包含在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的fad3B核酸序列。
8.权利要求I的植物，所述植物进ー步在四个不同FATB基因座包含突变的等位基因。
9.权利要求8的植物，其中至少ー个所述FATB突变的等位基因包含编码截短的FATB多肽的核酸。
10.权利要求9的植物，其中所述编码所述截短的FATB多肽的核酸包含选自SEQIDNO: I、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 的核苷酸序列。
11.权利要求10的植物，所述植物包含具有SEQID NO: I、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的核酸。
12.权利要求I的植物，其中所述植物是欧洲油菜、芥菜、或者芜青植物。
13.权利要求I的植物，其中所述植物是Fl杂种。
14.权利要求I的植物的后代，所述后代包含所述突变的等位基因。
15.权利要求I的植物的种子。
16.在两或多个不同的脂酰酰基载体蛋白硫酯酶B(FATB)基因座包含突变的等位基因的芸苔属植物，其中所述植物产生这样的种子，所述种子产生总饱和物含量为大约2.5%-5. 5% 的油。
17.权利要求16的植物，所述油的棕榈酸含量为大约I.5%-3. 5%。
18.权利要求16的植物，所述油的硬脂酸含量为大约O.5%-2. 5%。
19.在两或多个不同的脂酰酰基载体蛋白硫酯酶B(FATB)基因座包含突变的等位基因的芸苔属植物，其中每个所述突变的等位基因导致产生相对于相应野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽。
20.权利要求19的植物，其中至少ー个所述突变的等位基因包含编码截短的FATB多肽的核酸。
21.权利要求19的植物，其中至少一种所述突变的等位基因包含编码缺失螺旋/4-链折叠(4HBT)结构域或者其一部分的FATB多肽的核酸。
22.权利要求19的植物，其中至少一种所述突变的等位基因包含编码具有影响底物特异性的残基的非保守取代的FATB多肽的核酸。
23.权利要求19的植物，其中至少一个所述突变的等位基因包含编码具有影响催化活性的残基的非保守取代的FATB多肽的核酸。
24.权利要求20的植物，其中编码所述截短的FATB多肽的所述核酸包含选自SEQIDNO: I、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 的核苷酸序列。
25.权利要求19的植物，其在三个不同FATB基因座包含突变的等位基因。
26.权利要求19的植物，其在四个不同FATB基因座包含突变的等位基因。
27.权利要求24的植物，其包含具有SEQID NO: I和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的核酸。
28.权利要求24的植物，其包含具有选自SEQID NO: I和SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列的核酸。
29.权利要求24的植物，其包含具有SEQID NO: I和SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的核酸。
30.权利要求24的植物，其包含具有SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸。
31.权利要求24的植物，其包含具有SEQID NOiUSEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的核酸。
32.权利要求24的植物，其包含具有SEQID NO: 1、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的核酸。
33.权利要求19的植物，其包含具有SEQID N0:USEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQID N0:4所示核苷酸序列的核酸。
34.权利要求19的植物，所述植物产生这样的种子，所述种子产生总饱和物含量为大约 2. 5%-5. 5% 的油。
35.权利要求19的植物，所述植物产生这样的种子，所述种子产生棕榈酸含量为大约I.5%-3. 5% 的油。
36.权利要求19的植物，所述植物产生这样的种子，所述种子产生硬脂酸含量为大约O. 5%-2. 5% 的油。
37.权利要求34的植物，所述油进一步具有油酸含量为大约78%-80%，亚油酸含量为大约8%_10%，以及α -亚麻酸含量为大约2%_4%。
38.权利要求19的植物，所述植物进一步在Λ-12脂肪酸去饱和酶(FAD2)基因座包含突变的等位基因，所述突变的等位基因包含编码在His-Glu-Cys-Gly-His基序中谷氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸。
39.权利要求19的植物，所述植物进一步在FAD2基因座包含突变的等位基因，所述突变的等位基因包含编码在DRDYGILNKV基序中甘氨酸由谷氨酸取代或者在KYLNNP基序中亮氨酸由组氨酸取代的FAD2多肽的核酸。
40.权利要求38的植物，所述植物进一步在不同FAD2基因座包含突变的等位基因，所述突变的等位基因包含编码在DRDYGILNKV基序中甘氨酸由谷氨酸取代或者在KYLNNP基序中亮氨酸由组氨酸取代的FAD2多肽的核酸。
41.权利要求19的植物，所述植物进一步在两个不同FAD3基因座包含突变的等位基因，其中一个所述突变的等位基因包含编码在第275位的精氨酸由半胱氨酸取代的FAD3A多肽的核酸，另一个所述突变的等位基因包含在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的fad3B核酸序列。
42.权利要求19的植物，所述植物进一步在脂酰-酰基-ACP硫酯酶A2(FATA2)基因座包含突变的等位基因，其中所述突变的等位基因导致产生相对于相应野生型FATA2多肽具有降低的硫酯酶活性的FATA2多肽。
43.权利要求19的植物，其中所述植物是欧洲油菜、芥菜或者芜青植物。
44.权利要求19的植物，其中所述植物是Fl杂种。
45.权利要求19的植物的后代，所述后代包含所述突变的等位基因。
46.权利要求19的植物的种子。
47.芸苔属植物，其在两或多个不同FATB基因座包含突变的等位基因的，其中每个所述突变的等位基因导致产生相对于野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽，及进一步在FAD2基因座包含突变的等位基因，所述突变的等位基因包含编码在His-Glu-Cys-Gly-His基序中谷氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸。
48.权利要求47的芸苔属植物，进一步在不同FAD2基因座包含突变的等位基因，所述突变的等位基因包含编码在DRDYGILNKV基序中甘氨酸由谷氨酸取代或者在KYLNNP基序中亮氨酸由组氨酸取代的FAD2多肽的核酸。
49.产生油的方法，所述方法包括 a)压碎产生自权利要求1、16或19的至少一种芸苔属植物的种子'及 b)从所述压碎的种子中提取所述油，所述油在精炼、脱色和脱臭后具有的总饱和物含量为大约2. 5%-5. 5%。
50.权利要求49的方法，其中所述油进一步包含二十碳烯酸含量为大约I.6%-2. 3%。
51.权利要求49或50的方法，其中所述油进一步包含油酸含量为大约78%-80%，亚油酸含量为大约8%-10%，以及α -亚麻酸含量为大约2%-4%。
52.权利要求49-51任一项的方法，所述植物进一步在FAD2基因座包含突变的等位基因，所述突变的等位基因包含编码在His-Glu-Cys-Gly-His基序中谷氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸。
53.权利要求52的方法，所述植物进一步在不同FAD2基因座包含突变的等位基因，所述突变的等位基因包含编码在DRDYGILNKV基序中甘氨酸由谷氨酸取代或者在KYLNNP基序中亮氨酸由组氨酸取代的FAD2多肽的核酸。
54.权利要求53的方法，所述植物进一步在两个不同FAD3基因座包含突变的等位基因，其中一个所述FAD3突变的等位基因包含编码在第275位精氨酸由半胱氨酸取代的FAD3A多肽的核酸，另一个所述FAD3突变的等位基因包含在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的fad3B核酸序列。
55.产生芸苔属植物的方法，所述方法包括a)使一或多个在FATB基因座包含突变的等位基因的第一芸苔属亲本植物与一或多个在不同FATB基因座包含突变的等位基因的第二芸苔属亲本植物杂交，其中每个所述突变的等位基因导致产生相对于相应野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽；及 b)在1-5代中选择在两或多个不同FATB基因座具有突变的等位基因的后代植物，从而获得所述芸苔属植物。
56.产生芸苔属植物的方法，所述方法包括 a)获得ー或多个在两或多个不同FATB基因座包含突变的等位基因的第一芸苔属亲本植物，其中每个所述突变的等位基因导致产生相对于相应野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽； b)获得ー或多个在FAD2基因座包含突变的等位基因的第二芸苔属亲本植物，所述突变的等位基因包含编码在His-Glu-Cys-Gly-His基序中甘氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸； c)使所述ー或多个第一芸苔属亲本植物与所述ー或多个第二芸苔属亲本植物杂交；及 d)在1-5代中选择在两或多个不同FATB基因座具有突变的等位基因及在所述FAD2基因座具有突变的等位基因的后代植物，从而获得所述芸苔属植物。
57.权利要求56的方法，其中所述第一芸苔属亲本植物在三个不同FATB基因座包含突变的等位基因。
58.权利要求56的方法，其中所述第一芸苔属亲本植物在四个不同FATB基因座包含突变的等位基因。
59.产生芸苔属植物的方法，所述方法包括 a)获得ー或多个在两或多个不同FATB基因座包含突变的等位基因的第一芸苔属亲本植物，其中每个所述突变的等位基因导致产生相对于相应野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽； b)获得ー或多个在FAD2基因座包含突变的等位基因的第二芸苔属亲本植物，所述突变的等位基因包含编码在相应于所述多肽第242-277位氨基酸的区域(SEQ ID NO:29)中具有突变的FAD2多肽的核酸； c)使所述ー或多个第一芸苔属亲本植物与所述ー或多个第二芸苔属亲本植物杂交；及 d)在1-5中代选择在两或多个不同FATB基因座具有突变的等位基因及在所述FATA2基因座具有突变的等位基因的后代植物，从而获得所述芸苔属植物。
60.变的等位基因。
61.权利要求60的方法，其中所述第一芸苔属亲本植物进ー步在FAD2基因座包含突变的等位基因及在两个不同FAD3基因座的突变的等位基因，所述FAD2突变的等位基因包含编码在His-Glu-Cys-Gly-His基序中谷氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸，其中ー个所述FAD3突变的等位基因包含编码在第275位的精氨酸由半胱氨酸取代的FAD3A多肽的核酸，及其中一个所述FAD3突变的等位基因包含在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的fad3B核酸序列。
62.一种芥花油，其油酸含量为大约78%-80%，亚油酸含量为大约8%-10%，α-亚麻酸含量不超过大约4%,以及二十碳烯酸含量为大约16-23%。
63.权利要求62的油，所述油进一步具有棕榈酸含量为大约1.5%-3. 5%。
64.权利要求62或63的油，所述油进一步具有硬脂酸含量为O.5%-2. 5%。
65.权利要求62-64任一项的油，其中所述二十碳烯酸含量为大约1.9-2. 2%。
66.权利要求62-65任一项的油，其中所述α-亚麻酸含量为大约2%至大约4%。
67.在FADA2基因座包含突变的等位基因的芸苔属植物的种子，所述突变的等位基因包含编码在相应于所述多肽第242-277位氨基酸的区域(SEQ ID NO: 29)具有突变的FATA2多肽的核酸，所述种子产生这样的油，所述油具有的油酸含量为78%-80%、亚油酸含量为大约8%_10%、α -亚麻酸含量不超过大约4%及二十碳烯酸含量为1.6-2.3%。
68.权利要求67的种子，其中所述种子是F2种子。
69.权利要求67的种子，其中所述芸苔属植物进一步在四个不同FATB基因座包含突变的等位基因。
70.权利要求67-69任一项的种子，其中所述芸苔属植物进一步在FAD2基因座包含突变的等位基因及在两个不同FAD3基因座包含突变的等位基因，所述FAD2突变的等位基因包含编码在His-Glu-Cys-Gly-His基序中谷氨酸由赖氨酸取代的FAD2多肽的核酸，其中一个所述FAD3突变的等位基因包含编码在第275位的精氨酸由半胱氨酸取代的FAD3A多肽的核酸，及其中一个所述FAD3突变的等位基因包含在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的fad3B核酸序列。
71.一种芥花油，其总饱和脂肪酸含量不超过大约3. 7%，优选油酸含量为大约72-75%。
72.权利要求71的油，其中所述油的棕榈酸含量为大约2.2-2. 4%。
73.权利要求71或72的油，其中所述油的硬脂酸含量为大约O.5-0. 8%。
74.权利要求71-73任一项的油，其中所述油的二十碳烯酸含量为大约1.6-1. 9%。
75.权利要求71-74任一项的油，其中所述总饱和脂肪酸含量为大约3.4-3. 7%。
76.权利要求1-13、16-44及47-48任一项的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含一或多个所述突变的等位基因。
全文摘要
本发明描述了产生具有低总饱和脂肪酸含量的油的芸苔属植物及生产这种植物的方法。所述油具有低总饱和脂肪酸组合低、中等或高油酸含量。
文档编号A01H1/00GK102984935SQ201080057564
公开日2013年3月20日 申请日期2010年12月20日 优先权日2009年12月18日
发明者H·张, K·勃兰特, R·弗莱彻, D·孔罗德 申请人:嘉吉公司