专利名称：一种热性惊厥模型鼠的筛选方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于药物筛选及疾病机制研究的动物模型的建立的技术领域，具体涉及一种热性惊厥模型鼠的筛选方法，是一种通过热性惊厥模型以人工定向选择和交配繁育的方式筛选得到模型鼠的方法。
背景技术：
热性惊厥是小儿时期最常见的中枢神经系统功能异常的紧急症状，在婴幼儿中尤为多见，其总发病率约为2% 4%，欧美为2 0Z0 5%，日本为6% 9%，某些地区甚至高达14%。热性惊厥可导致神经系统的后遗症，回顾性研究表明，40%有复杂型热性惊厥发病史的病人会产生海马硬化和颞叶癫痫，同时流行病学调查结果显示患儿发生癫痫的相对危险性是一般儿童的10倍。因此，对热性惊厥疾病的预防和治疗就显得极为重要。但是目前仍缺少一种特异的用于热性惊厥机制研究和治疗药物评价及筛选的模型鼠。热性惊厥的疾病模型的建立由来已久，主要分为以下几类体表直接加热诱导模型、微波加热诱导模型、脂多糖诱导发热模型、热循环气流加热诱导模型和热水浴加热诱导模型。其中，体表直接加热法会造成实验鼠的体表烫伤并且死亡率高(Holtzman，D.， Obana, K. , and Olson, J. Hyperthermia-induced seizures in therat pup A model for febrile convulsions. Science. 1981,213(4511) : 1034-1036.)。脂多糖诱导惊厥法成功率低，仅为50%，且无法排除该外源物质对模型构建的影响，因此不能成为一种合适的动物模型(Heida JG, Boisse L, LipopoIysaccharide-induced febrile convulsions in the rat short-term sequelae. Epilepsia. 2004,45(11) : 1317-1329.)。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的一个目的在于提供了一种获得热性惊厥敏感模型鼠和热性惊厥耐受模型鼠的筛选方法。通过此方法得到的热性惊厥敏感模型鼠的发作温度低、发病率高且接近临床表现；得到的热性惊厥耐受模型鼠的发作温度高，发病率低。这两种模型鼠不仅适用于热性惊厥模型的构建，而且有利于热性惊厥的发病机制的研究。本发明的另一个目的在于提供了一种前述的热性惊厥敏感模型鼠在防治热性惊厥疾病的药物评价、筛选中的应用及用于发病机制的研究。本发明的再一个目的在于提供了一种前述的热性惊厥耐受模型鼠对于热性惊厥发病机制的研究。为了实现第一个目的，本发明采取的技术措施如下一种热性惊厥敏感模型鼠和耐受模型鼠的筛选方法，步骤如下I)初次筛选用100只(雌雄各半)21日龄SPF级大鼠进行热性惊厥水浴实验，温度设定在 43. (TC -45. (TC。I. I)敏感组大鼠的筛选按照热性惊厥的发作等级的5级评分标准来筛选，3级以上为敏感，等级越高越敏感；发作等级相同的情况下再比较潜伏期长短，潜伏期越短越敏感；发作等级和潜伏期都相同的情况下再比较惊厥持续时间的长短，时间越长越敏感。以此标准最终筛选出热性惊厥最敏感大鼠4只，其中雌雄各半，组成敏感组大鼠；耐受组大鼠的筛选按照热性惊厥的发作等级5级评分标准来筛选，0级或I级为耐受，等级越低越耐受；发作等级相同的情况下再比较潜伏期长短，潜伏期越长越耐受；发作等级和潜伏期都相同的情况下再比较惊厥持续时间的长短，时间越短越耐受。以此标准最终筛选出热性惊厥最耐受大鼠4只，其中雌雄各半，组成耐受组大鼠。I. 2)将筛选出的敏感组大鼠和耐受组大鼠分别进行组内交配繁育获得第二代大鼠，将所获得的第二代大鼠全部用于下一步实验。2)待第二代敏感组和耐受组大鼠生长至21日龄，进行热性惊厥水浴实验。2. I)热性惊厥敏感组大鼠的水浴温度设定在43. (TC -45. (TC。根据上述敏感组大鼠同样的筛选标准，从中选出热性惊厥最敏感大鼠4只(雌雄各半)，进行组内交配繁育获得第三代大鼠，将所获得的第三代大鼠全部用于下一步实验。2. 2)热性惊厥耐受组大鼠的水浴温度设定在44. (TC -46. (TC。根据上述耐受组大鼠同样的筛选标准，从中选出热性惊厥最耐受大鼠4只(雌雄各半)，进行组内交配繁育获得第三代大鼠，将所获得的第三代大鼠全部用于下一步实验。3)待第三代敏感组和耐受组大鼠生长至21日龄时，继续改变水浴温度进行筛选实验。3. I)热性惊厥敏感组大鼠的水浴温度设定在40. (TC -42. (TC。根据上述敏感组大鼠同样的筛选标准，筛选出更加敏感的大鼠。3. 2)热性惊厥耐受组大鼠的水浴温度设定在45. (TC -46. (TC。根据上述耐受组大鼠同样的筛选标准，筛选出更加耐受的大鼠。(惊厥程度分级0级为未发生惊厥；1级为大鼠面部急速抽动；2级为大鼠点头或甩尾；3级为大鼠一侧前肢抬起阵挛；4级为大鼠全身强直或双侧前肢抬起痉挛；5级为大鼠全身强直阵挛或跌倒。)(惊厥潜伏期从大鼠放入水中至刚开始发生惊厥的时间。)(惊厥持续时间大鼠由刚开始发生惊厥至惊厥停止的时间。)本发明利用经典的水浴加热诱导模型，以人工定向选择和交配繁殖的方式筛选得到的敏感大鼠，其温度敏感程度和发病率随代数的增加而增加，且趋势能继续保持下去；本发明方法筛选得到的耐受大鼠，温度敏感程度低且发病率随代数的增加而降低，且趋势能继续保持下去。为了实现本发明的第二个目的，验证所筛选出的敏感模型鼠在研究热性惊厥发病机制中的作用和在药物筛选方面的优点，我们选用了临床常用的抗惊厥药物苯巴比妥进行药理学实验。实验方法如下(I)待第三代热性惊厥敏感大鼠生长至21日龄，随机分为2组用于药理实验(苯巴比妥组和热性惊厥组)，另取正常SPF级21日龄大鼠作为正常对照组。给以连续8天相应处理，记录其发作的潜伏期、持续时间和发作等级。①苯巴比妥组每天腹腔注射苯巴比妥25mg/kg，43°C水浴4min ；
②热性惊厥组每天腹腔注射生理盐水50ml/kg，43°C水浴4min ；③正常对照组每天腹腔注射生理盐水50ml/kg，33°C水浴4min ；(2)待大鼠30日龄时进行Morris水迷宫实验，主要用于验证大鼠的学习记忆能力。实验包括两部分定位航行实验和空间定位实验。通过比较，在热性惊厥等级和潜伏期上苯巴比妥组都显著优于热性惊厥组，同时在学习记忆能力方面，苯巴比妥组明显优于热性惊厥组。(3)最后我们利用TUNEL法凋亡实验、尼氏染色实验及电镜实验等实验方法证明 热性惊厥组的受损程度最高，苯巴比妥组受损程度相对于热性惊厥组有所减轻。为了实现本发明的第三个目的，更进一步地研究热性惊厥的发病机制，我们利用基因表达谱芯片分析了热性惊厥敏感鼠和耐受鼠的mRNA表达差异情况。实验方法如下(I)动物筛选从上述第一代100只(雌雄各半)21日龄的SPF级大鼠中，采用上述的方法逐代筛选，最终从第三代大鼠中选出热性惊厥最敏感鼠和最耐受鼠各3只。(2)动物取材提取筛选出的大鼠的脑组织海马，将其放入无RNA酶的冻存管中， 置于液氮中保存。(3)基因芯片分析将6个保存样本样送至上海伯豪生物技术有限公司进行基因芯片分析。与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下本发明的筛选方法主要是利用最经典的热性惊厥热水浴加热诱导模型，并结合人工定向选择和动物交配繁育的方法得到热性惊厥敏感模型鼠和耐受模型鼠，该模型诱导时间短，观察直接，且模型诱导成功率高，从第一代到第三代，温度敏感组与耐受组的温度敏感性差异呈随代数扩大，且继续培育，这种趋势能保持下去。这两种方法的结合应用于热性惊厥模型鼠的筛选在国内外尚未见报道。通过本筛选方法能够更好地保持遗传倾向性，并且对生长发育的影响越来越小。本发明方法涉及的人工定向选择和交配繁育的筛选方法可以筛选得到温度敏感度高，发病率更高的热性惊厥敏感大鼠，且接近人类热性惊厥的临床表现；以及温度敏感度低，发病率更低的热性惊厥耐受大鼠。从实验应用方面可以看出不管是在惊厥等级还是在学习记忆方面苯巴比妥组都显著优于热性惊厥组，同时利用筛选得到的敏感鼠和耐受鼠进行基因表达谱的分析，得到热性惊厥相关表达差异基因。从而证明了本发明得到的热性惊厥模型鼠更有利于研究热性惊厥发病机制及防治药物的评价和筛选。
图I :敏感组大鼠热性惊厥发作平均温度。第1-3 代发作平均温度分别为 44. 3±0. 79°C>43. 5±0. 53°C和 41. 9±1. 1°C。I代与2代比较，P <0. 05 ;2代和3代比较，P<0. 01 ;3代与I代比较，P < 0. 001。图2 43. (TC水浴条件下(其他条件同实施例I和2)，敏感组大鼠热性惊厥发病率 (2级以上为发病)。第1-3代发病率分别为25%、35. 2%和72. 7%。3 代与 1、2 代比较，P <0.05。
图3 :热性惊厥耐受组大鼠惊厥平均温度。第1-3 代发作平均温度分别为 43. 9±0. 72。。、44. 7±0.61。。和 45. 4±0. 50°C。2代与I代、3代比较，P < 0. 05 ；1代与3代相比比较，P < 0. 001。图4 45. (TC水浴条件下(其他条件同实施例I和2)，耐受组大鼠热性惊厥发病率 (2级以上为发病)。第1-3代发病率分别为62. 5%、29. 5%和20. 8%。I代与2、3代相比，P < 0. 05。图5 :海马组织电镜超微结构观察实验结果示意图。图中A为正常对照组、B为苯巴比妥组、C为热性惊厥组。
具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的保护范围。实施例I :一种热性惊厥敏感模型鼠的筛选方法，步骤如下(I)初次筛选实验中选用100只(雌雄各半)21日龄SPF级正常大鼠。将大鼠放入一个透明的玻璃筒中(直径6cm，高20cm)，此玻璃筒下部有多个小孔与外部相通。将筒竖立于恒温水浴箱中，通过向玻璃筒底垫放塑料垫片以调节筒中水的深度，以大鼠沿筒壁站立时仅能露出头部为准。第一次筛选温度为43. (TC，第二次筛选温度为44. (TC，第三次筛选温度为45. (TC。每次水浴4分钟后取出大鼠进行观察。按照热性惊厥的发作等级的5级评分标准来筛选，3级以上为敏感，等级越高越敏感；发作等级相同的情况下再比较潜伏期长短，潜伏期越短越敏感；发作等级和潜伏期都相同的情况下再比较惊厥持续时间的长短， 时间越长越敏感，最终筛选出热性惊厥最敏感大鼠4只(雌雄各半)，然后继续培育至体重达到250g以上，且至少达到90日龄，组内进行随机交配繁殖，所获得的第二代大鼠全部用于下一步实验。(2)待第二代大鼠生长至21日龄，以相同的方法进行实验，仅改变水浴温度，筛选温度逐渐降低。第一次筛选温度是45. (TC，第二次筛选温度是44. (TC，第三次筛选温度是 43. (TC。根据上述同样的标准，最终筛选出4只最敏感大鼠(雌雄各2只)，然后继续培育至体重在250g以上，且至少达到90日龄，组内进行随机交配繁殖，所获得的第三代大鼠全部用于下一步实验。(3)待第三代大鼠生长至21日龄，仍以相同的方法筛选，筛选温度进一步降低。第一次筛选温度是42. (TC，第二次筛选温度是41. (TC，第三次筛选温度是40. (TC。根据上述同样的标准，最终筛选出4只最敏感的大鼠(雌雄各2只)。统计学分析结果显示(见图I和2)，通过人工定向选择和交配繁殖的方式得到的敏感大鼠的惊厥发作平均温度逐代降低，发病率逐代上升，且均有显著性差异。表明通过本筛选方法，成功得到了一种热性惊厥敏感模型鼠，其发作温度低、发病率高且接近临床表现，更有利于研究热性惊厥的发病机制及药物筛选。实施例2 一种热性惊厥耐受模型鼠的筛选方法，步骤如下(I)初次筛选实验中选用100只(雌雄各半)21日龄SPF级正常大鼠。将大鼠放入一个透明的玻璃筒中(直径6cm，高20cm)，此玻璃筒下部有多个小孔与外部相通。将筒竖立于恒温水浴箱中，通过向玻璃筒底垫放塑料垫片以调节筒中水的深度，以大鼠沿筒壁站立时仅能露出头部为准。第一次筛选温度为43. (TC，第二次筛选温度为44. (TC，第三次筛选温度为45. (TC。每次水浴4分钟后取出大鼠进行观察，按照热性惊厥的发作等级5级评分标准来筛选，0级或I级为耐受，等级越低越耐受；发作等级相同的情况下再比较潜伏期长短，潜伏期越长越耐受；发作等级和潜伏期都相同的情况下再比较惊厥持续时间的长短， 时间越短越耐受，最终筛选出热性惊厥最耐受的大鼠4只(雌雄各半)，然后继续培育至体重达到250g以上，且至少达到90日龄，组内进行随机交配繁殖，所获得的第二代大鼠全部用于下一步实验。(2)待第二代大鼠生长至21日龄，以相同的方法进行实验，仅升高水浴温度。第一次筛选温度为44. (TC，第二次筛选温度为45. (TC，第三次筛选温度为46. (TC。根据上述同样的耐受鼠筛选标准最终选出最耐受大鼠4只(雌雄各半)，然后继续培育至体重达到 250g以上，且至少达到90日龄，组内进行随机交配繁殖，所获得的第三代大鼠全部用于下
一步实验。(3)待第三代大鼠生长至21日龄，仍以相同的方法筛选。第一次筛选温度为 45. (TC，第二次筛选温度为45. 5°C，第三次筛选的温度为46. (TC。根据上述同样的耐受鼠筛选标准最终选出最耐受大鼠4只(雌雄各半)。统计学分析结果显示(见图3和4)，通过人工定向选择和交配繁殖的方式获得的耐受模型鼠的惊厥发作平均温度逐代上升，发病率逐代下降，且均有显著性差异。表明通过筛选成功得到了一种热性惊厥耐受模型鼠，更有利于研究热性惊厥的发病机制及药物筛选。实施例3 :热性惊厥敏感和耐受模型鼠的基因芯片表达谱分析利用基因表达谱芯片提供的信息进行高通量的信息分析，获得热性惊厥相关差异表达基因参与的基因功能、信号通路、代谢通路等方面，从而对热性惊厥发病机制进行更深入的了解。聚类热图是对样本和基因分别进行分级聚类之后与热图画在一起。通过热图可以观察同一基因在不同样本中的表达情况，还可以根据基因表达情况验证样本的分组情况。实验步骤如下I.动物筛选从上述第一代100只(雌雄各半)21日龄的SPF级大鼠中，采用上述的方法逐代筛选，最终从第三代大鼠中选出热性惊厥最敏感鼠和最耐受鼠各3只。2.动物取材根据基因芯片公司的取材标准，提取大鼠脑组织海马，将其放入无 RNA酶的冻存管中，置于液氮中保存。3.基因芯片分析将6个保存样本样送至基因芯片公司(上海伯豪生物技术有限公司)进行基因表达谱分析。所得基因芯片聚类热图结果表明热性惊厥敏感模型鼠和耐受模型鼠的基因表达差异显著。所有基因中P < 0. 05的有1582个，其中P < 0.01的基因有312个，满足P值且差异倍数(FC)大于2的基因有89个。这些差异基因中，有些基因已经证实是热性惊厥相关基因，如GPR98。同时我们可以通过基因的功能相关性，通过对其他待选基因进一步的筛选、分析研究，这对于探索新的热性惊厥发病机制提供了有力的支持和帮助。
实施例4 :利用热性惊厥敏感模型鼠进行药理学实验在实施例I所得的第三代热性惊厥敏感大鼠21日龄时随机分组，苯巴比妥组12 只，热性惊厥组11只，另选用未经任何处理的21日龄SPF级大鼠6只作为正常对照组(后续实施例也按此分组进行)。在大鼠21日龄时开始进行连续8天以下处理，并记录其发作的潜伏期、持续时间和发作等级。①苯巴比妥组每天腹腔注射苯巴比妥25mg/kg，43. 0°C水浴4min ；②热性惊厥组每天腹腔注射生理盐水50ml/kg，43. (TC水浴4min ；③正常对照组每天腹腔注射生理盐水50ml/kg，33. (TC水浴4min ；统计学分析结果显示，热性惊厥组与苯巴比妥组相比，潜伏期短，发作等级高，且均存在显著性差异。表明本发明方法筛选出的热性惊厥敏感模型鼠具有与人类相似的药理学特征，更适合热性惊厥模型的构建。由于正常组惊厥发作等级为0，因此附表I中不涉及其潜伏期和持续时间。表I
权利要求
1.一种热性惊厥敏感模型鼠的筛选方法，其步骤如下A、初次筛选时用100只雌雄各半的21日龄大鼠进行热性惊厥水浴实验，温度设定在 43. O0C-45. (TC，第一次筛选温度为43. (TC，第二次筛选温度为44. (TC，第三次筛选温度为45. (TC，每次水浴4分钟后取出大鼠进行观察筛选，最终得到热性惊厥最敏感大鼠4只， 其中雌雄各半，组成敏感组大鼠，然后将敏感组大鼠继续培育至体重达到250g以上，且至少达到90日龄，组内进行随机交配繁殖，所获得的第二代大鼠全部用于下一步实验；B、待第二代大鼠生长至21日龄，以相同的方法进行实验，仅改变水浴温度，第一次筛选温度是45. (TC，第二次筛选温度是44. (TC，第三次筛选温度是43. (TC，最终筛选出4只最敏感大鼠，其中雌雄各2只，然后继续培育至体重在250g以上，且至少达到90日龄，组内进行随机交配繁殖，所获得的第三代大鼠全部用于下一步实验；C、待第三代大鼠生长至21日龄，仍以相同的方法筛选，筛选温度进一步降低，第一次筛选温度是42. (TC，第二次筛选温度是41. (TC，第三次筛选温度是40. (TC，最终筛选出4只最敏感的大鼠，其中雌雄各2只。
2.一种热性惊厥耐受模型鼠的筛选方法，其步骤如下A、初次筛选时用100只雌雄各半的21日龄大鼠进行热性惊厥水浴实验，温度设定在 43. O0C-45. (TC，第一次筛选温度为43. (TC，第二次筛选温度为44. (TC，第三次筛选温度为45. (TC，每次水浴4分钟后取出大鼠进行观察筛选，最终得到热性惊厥最耐受大鼠4只， 其中雌雄各半，组成耐受组大鼠，然后将耐受组大鼠继续培育至体重达到250g以上，且至少达到90日龄，组内进行随机交配繁殖，所获得的第二代大鼠全部用于下一步实验；B、待第二代大鼠生长至21日龄，以相同的方法进行实验，仅升高水浴温度，第一次筛选温度是44. (TC，第二次筛选温度是45. (TC，第三次筛选温度是46. (TC，最终筛选出4只最耐受大鼠，其中雌雄各2只，然后继续培育至体重在250g以上，且至少达到90日龄，组内进行随机交配繁殖，所获得的第三代大鼠全部用于下一步实验；C、待第三代大鼠生长至21日龄，仍以相同的方法筛选，筛选温度进一步升高，第一次筛选温度是45. (TC，第二次筛选温度是45. 5°C，第三次筛选温度是46. (TC，最终筛选出4只最耐受的大鼠，其中雌雄各2只。
3.根据权利要求I或2所述的方法筛选出的模型鼠在筛选热性惊厥药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于药物筛选及疾病机制研究的动物模型的建立的技术领域，具体涉及一种热性惊厥模型鼠的筛选方法，是一种将经典的水浴加热诱导模型结合人工定向选择和交配繁育的方式筛选得到模型鼠的方法。本发明的方法独特，能成功获得良好的热性惊厥敏感模型鼠和耐受模型鼠。
文档编号A01K67/027GK102524178SQ201110025170
公开日2012年7月4日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者何小华, 余方, 刘万红, 尹君, 彭碧文, 徐健, 李亮, 范元腾 申请人:武汉大学