专利名称：苹果早期预选培育新品种技术的制作方法
技术领域：
当前国内外苹果育种一般采用杂交育种和芽变育种，特点是按形态标准选择，但苹果是个杂合体，遗传背景十分复杂，不易研究，而树体形态构成易受外界环境和病虫害的影响，另外苹果是多年生树种，生长周期长，成年树各类组织器官生长发育的习性，特性，在幼树很难断定大大增加了育种工作难度。因此，国内外的许多学者对苹果的早期预选尤其是矮生习性预选十分关注。早在二十世纪60年代K · 0 · Lapins等就开始对苹果的矮生习性及其遗传作了广泛研究，但由于形态标志的不稳定性，严重影响研究工作进展。本项发明于1979年起研究苹果生长习性的同工酶标志。据报道过氧化物酶同工酶与生长密切相关， 在本项研究中发现过氧化物酶同工酶E9带与苹果矮生习性相关密切，因此将E9带作为矮生型苹果的矮生习性标志。1984年，经专家鉴定确认“过氧化物酶同工酶作为1 2年生矮生型苹果实生苗的预选指标”，1988年获得农业部科学技术进步三等奖，。1990年在23 届国际园艺会上发表三篇论文后，受到同行专家好评，并应“Acta Horticaturae”杂志的约稿，连载了三篇论文。为了研究矮生型苹果同工酶标志在育种中的应用，于1992年、1993年间选用熟期不同的普通型和矮生型或短枝型等不同类的栽培品种，组配成不同类型的组合。对其实生苗用同工酶标志早期预选与常规选育相结合的方法，进行系统选育，至1996年获得的一批熟期早，以短枝结果为主的不同树形的优良株系，以后重点对果实的色泽、品质方面进一步选育。2010年8月20日，经专家鉴定通过8个品系，一致认为早熟优质的品系是难得的优良品系，宜在黄河故道等地扩大试种，发挥其早熟优势作用。(二)本项发明的目的1、本项发明的目的之一是矮生类型(包括矮生、半矮生、紧凑型、短枝型具有矮化特点的)品种，是当前国内外生产发展方向。建立矮生型苹果早期预选技术，提高效率， 加快育种进度，是本项发明目的。2、本项发明的目的之二是选择矮生(重点是半矮生、紧凑、短枝型)，早熟，优质的苹果新品种。3、本项发明的目的之三是建立苹果早期预选与常规选育相结合的选育程序，以提高选择效率，减少选择的随意性，加快育种进度。(三)本项发明的主要内容1、矮生型苹果的同工酶标志同工酶标志的可靠性、稳定性，适用广，是决定早期预选程序成功的关键，因此，①要求方法简易，取样不伤害整株，操作简便，重复性好，并规定严格的操作程序和取样标准；②要求本项同工酶标志适用于苹果属的22个种的不同类型品种，砧木，杂种实生苗；③要求本项指标遗传性稳定可靠。2、苹果早期预选与常规选育相结合的选育程序是本发明的核心。本项发明采用普通型的和矮生型的，早、中、晚熟期不同的栽培品种25个，组配成60个杂交组合。对由当年实生苗，进行早期预选、淘汰大批不具有同工酶标志的实生苗，对具有同工酶标志的实生苗进行常规选育。在3亩地上，不到十年内，选育获得一批早熟，高产，优质的新品系。
(四)本项发明的优点与效果1、方法快速简便。采用淀粉凝胶电泳技术，每天可分析大量样品；2、取样不伤害整株，取当年实生苗主茎伸长区皮层或叶片50 lOOmg，原有的实生苗能继续发枝生长，不影响下一步常规选育。3、同工酶标志的广泛性1985 1987年间，对苹果种质资源22个种的212个类型，不同砧木类型95个，栽培品种88个，共395个单株，同工酶标志与矮生习性相关分析结果，其准确率在86. 14%左右，具有一定的普遍性。4、同工酶标志，遗传性稳定性。根据由88个不同生长习性的栽培品种砧木组配成不同类型的杂交组合1 个，用同工酶分析了 7987株当年生实生苗，结果表明，同工酶标志——E9带是受二对互补基因控制，遗传性稳定，不受树龄、砧木、栽培地域的影响。5、早期预选与常规选育相结合的选育程序。育种周期短、效率高，仅根据60个杂交组合经本程序选择后，中选16个组合，组合中选率为27%，由1535株实生苗，中选19个优良品系，单株中选率为1. 4%。本项发明的苹果选育程序，能显著地提高选择效率，加快了育种进度，对苹果育种具有重大意义。(五)详述本项发明的实施例1、淀粉凝胶电泳不同的酶蛋白分子由于带电量、带电性质不同，在以淀粉凝胶为支持物的电场中移动的方向、速度不同。于是不同酶蛋白分子移动速度不同，出现不同的分离条带。用过氧化物酶底物染色，即能显示不同的过氧化物酶同工酶条带。苹果树体的不同器官、组织、细胞过氧化物酶同工酶种类不同，不同品种生长发育习性不同，过氧化物酶同工酶的种类也不一样。因此，能将不同生长习性的品种有效的分离开来，矮生型苹果持有特殊标志带，E9 酶带，即过氧化物酶的一种，它只存在于苹果茎伸长区的皮层或相应的叶片中。本发明以此为矮生型同工酶标志带。淀粉凝胶电泳方法①制胶称取12g水解马铃薯淀粉，倒入500ml三角瓶内，加入IOOml凝胶缓冲液， 边加热，边摇动，至淀粉完全溶解呈透明状，开始沸腾，立即用500 600mmHg的负压，抽气， 除去凝胶中的气泡。随后倒入事先准备好的模子里(图la)，趁热盖上一块涤纶薄膜和玻璃板，压一重物，冷却1.5 2.0小时，即可进样。②制样称取苹果实生苗茎伸长区或相应部位的叶片50 lOOmg，加样品缓冲液 0. 25 0. 5ml，制取勻浆上清液。③进样如图(Ib)所示，用梳子在凝胶负极端4 6cm处切点样口。用新华3号滤纸片蘸上酶粗提液，插入凝胶切口里，盖上涤纶膜，玻璃板，即可电泳④电泳按图2所示，将电极缓冲液倒入电泳槽，没过档板孔，将进好样的凝胶放在电泳槽上，二端搭好纱布，浸入电极液，盖上涤纶玻璃板，接通电源。电泳是在1 5°C条件下进行，通稳恒电流，每厘米保持2mA，电泳4 6小时。⑤切胶电泳完毕后，将凝胶放同制胶的模子里，底下再垫一块1 2mm厚的玻璃板，用金属细丝横向切割胶板，每切下一块胶板，置于染色缸内。⑥染色0. 5mol/L醋酸缓冲液，PH7. 050ml，联苯胺50mg ；3% H2O2IO滴，将电泳后的胶片，浸没在染色液中，室温下立即显兰色谱带，30mim后用自来水冲洗过夜，显橘红色，照相保存。2、同工酶标志的稳定性、可靠性①同工酶标志的可靠性矮生型同工酶标志在苹果属内具有普遍性意义，苹果属不同种不同类型的矮生习性与同工酶标志关系密切，根据苹果属17个种不同类型资源分析表明，其矮生习性与同工酶标志一致、准确率为90.0%;分析了 41个不同类型的矮化砧，其矮生性(矮化作用)与具有同工酶标志一致，准确率为85. 37% ；分析了 51个不同类型栽培品种，其矮生习性与具有同工酶标志一致，其准确性为81. 85%。平均值为86. 14%。表明矮生型同工酶标志在苹果属内具有广泛的适用性。②同工酶标志生物学稳定性矮生型同下酶标志不受树龄、树体发育时期的影响。 由国光、金冠、富士、红星、新红星，短枝元帅等栽培品种组配成七个杂交组合，树龄分别在 7 13年，分别分析比较，其母树新梢利萌蘖皮层或相应部位叶片中的同工酶标志带，共 446株。结果母树新梢与其萌蘖中的同工酶标志完全一致，不受树体发育时期的影响；分析了由国光X元帅158组合的2年龄和2 3个月龄实生苗；富士 X新红星组合的2年龄、6年龄和2 3个月龄实生苗；国光X短枝元帅组合的2年龄、5年龄和2 3个月龄实生苗。结果2 3个月龄实生苗的同工酶标志与之相应的2 6年生幼树的同工酶标志完全一致。分析了由国光XM7、国光XM8 二个组合，共64株，从2月龄开始至3年龄，每年定株分析观察2次，结果每个单株从2月龄开始至3年龄，其新梢皮层或相应部位叶片中同工酶标志完全一致，表明，二个月龄实生苗就可以进行早期预选，不受树龄和发育期的影响。矮生型同工酶标志不受砧木的影响，将玫瑰红、新红星、烟青、金矮生、红星、富士品种分别嫁接在M7，匪106、匪111、M27等不同类型根砧上；将国光、金冠、红冠、富士、红星品种分别嫁接在MM104、MM106、MM111、M2、M4、M5、M9、]\C6、M27等22个以山定子，茶果为根砧的中间砧上，组成48个中间砧/根砧组合；将新红星、红星、烟青、金矮生、矮红高接在红冠大树上。结果所有不同品种接穗的同工酶标志与原品种一样，不受根砧、中间砧、高接的影响。③同工酶标志的遗传性稳定性以39个亲本品种相互进行杂交，回交、正反交组配成58个组合，获得3515个Fl代杂交种实生苗，作同工酶标志分离分析，结果具有同工酶标志的实生苗可能有AABB、AaBB、AaBb、AABb四种基因型，而没有同工酶标志带的实生苗可能有AAbb、Aabb、aaBb、aaBB、aabb五种基因型。结果，查明了 39个亲本同工酶标志的基因型。为进一步证明同工酶标志的遗传规律，采用88个栽培品种，相互组配成1 个杂交组合，其中普通型X普通型的有38个组合，普通型X矮生型的有63个组合，矮生型X矮生型的有27个组合，共获得7987株实生苗，由这些Fl代实生苗同工酶标志的分离结果证明， 苹果实生苗中同工酶标志(E9)是受A_B_ 二对互补基因控制，遗传性稳定。3、选择效果①矮生性1986、1987年果茶所比较鉴定结果，具有同工酶标志的135_1、35_3、 41-6、66-11、61-18、22-62秋矮生(5 9年生)等优良品系的枝类比、新梢长度，节间长度并与秋矮生相比。结果平均短枝数、中枝数、长枝数比例分别为59. 4^^24.43^^16.8%, 平均新梢长为42. 63cm，平均节间长为1. 42cm枝类比例，新梢长度，节间长度都与秋矮生相近。表明具有同工酶标志，这些品系、品种都具有显著的矮生习性。同样又鉴定了具有同工酶标志的杂种实生苗O 3年龄)160株，结果短、中、长枝比例分别为75. 61%,21. 29%, 3. 10%，平均新梢长度为16. 63cm，平均节间长为1. 25cm，这些具有同工酶标志的实生苗其枝类比，新梢长、节间长，符合矮生习性标准。上述试材，都是先经常规选育后再用同工酶标志筛选材料。下面用同工酶标志早期预选后对矮生习性选择效果由60个杂交组合，1535株实生苗，2 3个月龄，经同工酶早期预选后，再经常规选择获得的具有同工酶标志的16个组合20个单株系，其特性都具有短枝习性，短枝比在60 80%之间，以短枝结果为主，坐果率高。用同工酶标志早期预选对提高矮生习性的中选率是有效的。②早熟性以选择早熟性为主要目标，由35个熟期不同的亲本，组配成晚X晚组合16个，晚X中组合25个，晚X早组合6个，中X早组合5个，中X中组合8个，共60 个组合。获得杂种实生苗1535株，经同工酶早期预选后，再按常规选育程序继续选择，最后中选16个组合，68个单株，这些单株在2-3年龄即始花结果，其中有中X早组合的1株，熟期60天，晚X早组合的30株，熟期80-95天，晚X中组合的18株，熟期90-120天，晚X 晚组合；16株熟期95 105天；其余3株熟期在150-160天。用同工酶标志早期预选能提高早熟性单株的中选率。③选择效率同工酶标志早期预选与常规选育相结合的程序研究，开始于1992 年，1993年间，以39个亲本组配成60个组合的杂交种子，1993年播种并进行同工酶早期预选，以后又按形态指标选择，经1994年严格筛选，选择植株健壮，枝短叶肥，色浓绿，芽饱满，无病虫害的单株306株，1996 1997年间始花结果，精选16个组合，68个品质优良单株。至1999年决选获得优良组合8个，株系22个，组合选择效率为13%，单株选择效率为 1. 4%。采用同工酶标志与常规选育相结合的程序，仅在7年内，在3亩苗圃地上，完成了 60 个杂交组合，1535株实生苗的全部选择过程，并取得了良好的选择效果。采用本项选育程序确实能显著地提高苹果选育进度，并能节省资源。4、选择程序建成由同工酶标志早期预选与常规选育相结合的高效选择程序(图 3)，专项试验证明其特点是目标明确，选择效率高，周期短，进度快，能提高资源利用率。试验结果如下①亲本的选择与组配选用丰产水平高，适应性广，综合抗性强的当地主载品种， 如富士等；选用符合育种目标要求的，丰产性好的早熟种质，矮生习性种质，开花结果习性优良的种质，综合抗性强的种质，选用目标性状遗传力强的种质等。共选择39个亲本材料， 共组配成60个杂交组合，其中有富士系为亲本的杂交组合占20. 3%，晚熟种为亲本的杂交组合占38. 9%，中熟种为亲本的杂交组合占32. 2 %，早熟种为亲本的杂交组合占8. 4%，获得杂交种子7137粒，1992 1993年间育成杂交种实生苗1535株，予编号，挂牌。②早期预选按照矮生型同工酶标志的要求，对2 3月令实生苗进行早期预选， 淘汰没有同工酶标志实生苗，占40-50%，对具有同工酶标志的实生苗，进入常规选育阶段。③常规选育1993 1994年间对具有同工酶标志的实生苗进行系统选育，先是淘汰有野生性状的单株，如枝条下垂、长有刺、蔓生、叶片弱小、植株生长不端正的、有病虫害的单株，选择植株健壮、枝条短粗、叶片肥大、色绿、芽大、饱满，植株生长端正，无病虫害的单株306株，并嫁接与八棱海棠，M26，高接于大树，观察生长开花习性。
1995-1997年间，中选的306株优良株系陆续开花结果，根据开花结果习性，果实大小、色泽、品质、口味等性状，选中了 16个组合，68个优良单株。A、中熟X早熟组合41有1个单株，95年始花结果15个，96年结果99个，6月下旬成熟，熟期65天，特早熟。B、晚熟X早熟有3个组合，30个单株，其中组合M，有20个单株，95年结果30 个，96年结果157个，品质优良，7月中下成熟，熟期80-90天；组合22，有2个单株，95年始花结果1个，96年开花结果12个，果大、色红，6月底成熟，熟期75天。组合37，有8个单株，96年始花结果22个，果大、色红，7月底成熟，熟期95天。C、晚熟X中熟7个组合，18个单株。其中组合10，有6个单株，95年结果2个， 96年结果M个，全红、浓香，7月初成熟，熟期70天；组合21，有6个单株，95年结5个果， 96年结51个果，红色，7月上成熟，熟期75天；组合33，有3个单株，96年结17个果，全红， 8月中下成熟。还有组合18、31、25、23，各中选1株。D、晚熟X晚熟，5个组合，19个单株，其中组合6，有9个单株，95年结2个果，96 年结34个果，全红，8月中成熟，熟期115天；组合32，有6个单株，95年结5个果，96年结 78个果，全红，8月中成熟，熟期105天；组合56，有2个单株，绿色、多汁、优质，8月上成熟， 熟期105天。还有组合30、29，晚熟，熟期150 160天。1998 1999年间，根据丰产性、稳产性及耐贮性进行最后决选，要求单株产量在 6kg以上，高产单株产量16kg以上，果实品质优良，耐贮运的单株，共入选22个株系，99年移栽到生产地。2004年平均单株产量62. 95kg，变幅50-72. 55、早熟优质苹果新品系按照早期预选与常规选育相结合的程序，育成的早熟优质新品系，有香苑1号、香苑2号、香苑3号、香苑5号、香苑6号、香苑7号、香苑8号、香苑12号等20多个优良品系， 其前列八个品系已通过专家鉴定。
图1，为制备淀粉凝胶制胶模具图； 图2，为电泳槽装置图3，为同工酶早期预选与常规选择相结合的选育程序简图。 图4，为缓冲液配方图。
权利要求
1.前序部分本发明主题是苹果早期预选培育新品种技术，其特点是用同工酶标志 (E9带)对苹果杂种实生苗早期预选与常规选择育种程序相比，选择效率高、进度快。
2.特征部分本项发明的特征是1、苹果早期预选的同工酶标志(E9)与苹果矮生习性密切相关，测试操作简便、可靠性高，稳定性好，遗传性稳定，测试准确率为1.4%，适于苹果属不同种、品种，不同栽培条件，具有一定普遍性。2、苹果实生苗同工酶早期预选与常规选择相结合的选择程序，能减少选择的随意性， 提高选择效率，加快育种进度。`3、同工酶早期预选与常规选择相结合的专项试验证明由60个杂交组合，1535株实生苗，经同工酶预选后，组合中选率达13. 0%，单株中选率为1. 4%，明显高于常规选择效率。本项发明专利要求，包括前序部分和特征部分特点是A.杂种实生苗同工酶早期预选标志(E9)；B.杂种实生苗同工酶早期预选与常规选择相结合的选育程序。
全文摘要
本项发明矮生型苹果(包括矮生、半矮生、短枝型及具有矮化作用，矮化潜力)同工酶早期预选与常规选育相结合的选育程序。同工酶标志可靠性高、稳定性强，准确率高(86.14％)用以对当年生杂种实生苗进行早期预选，能提高选择效率，加快育种进度。能在短期内获得大量优良单株。同工酶早期预选专项试验是对60个杂交组合1535株实生苗，采用本发明的选育程序，能显著加快选育进度，提高选择效率，单株中选率1.2％，在十多年内育成了20多个优良株系。其中8个品系已通过专家鉴定。这对苹果育种程序的改进具有重要意义。
文档编号A01H1/04GK102342244SQ20111002769
公开日2012年2月8日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者唐秀芝 申请人:唐秀芝