专利名称：控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因OsCHR4及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种图位克隆技术克隆的水稻0sCHR4 (chromatin remodeling 4)基因的CDS序列，该CDS编码的蛋白与人类皮肌炎自身抗原Mi-2同源，属于CHD蛋白家族。转基因功能恢复实验结果确证该基因同时控制不定根伸长和地上部叶肉细胞中叶绿体的形成。
背景技术：
水稻属于须根系单子叶植物，主根不发达，早期即停止生长或枯萎，后期生长发育所需要的水分和养分都是靠不断生长的不定根吸收的。不定根(主要指禾本科作物)是胚后发生的器官，水稻节位产生的大量不定根组成了水稻地下部的主要部分。不定根的发育过程可以划分为不定根原基的起始和不定根的伸长(Hochholdinger and Zimmermann, 2008)，每个阶段发育受阻都会造成不定根生长发育异常。大多数双子叶植物的叶片具有栅栏组织和海绵组织的分化，即具有背腹性，被称为两面叶。而禾本科植物的叶肉组织是单一形态的，没有背腹性，这种叶被称为等面叶。近年来植物叶片发育极性方面的研究取得了很大进展，但是主要集中在双子叶模式植物拟南芥的相关突变体展开的(Xu et al.，2003)，而以水稻为模式植物的禾本科植物的叶肉细胞极性发育机制的研究还很少，水稻叶色突变体的研究为探索单子叶植物的叶绿体发育机制和叶肉细胞的极性发育奠定了良好基础。“染色质重塑”普遍地被用来描述蛋白质-DNA之间相互作用和结构的改变，基因转录也正是通过改变DNA的包装结构、实现调控元件与DNA的可接近性而被调节。Mi-2最早是从皮肌炎患者血清中分离得到的一种自身抗原，体现了皮肌炎患者的一种自身免疫现象 (Seelig et al.，1995)。Mi_2属于高度保守的CHD(Qiromodomain helicase DNA-binding) 蛋白亚家族，该家族含有两个PHD锌指基序；两个chromo结构域，是染色质识别修饰的结构域；一个隶属于SWI2/SNF2家族的ATPase/helicase功能域和一个DNA结合结构域Geelig et al. , 1995 ；Woodage et al.，1997)，该家族蛋白是一个ATP依赖的染色质调控因子，介导蛋白质与DNA或者蛋白与蛋白之间的相互作用(Brehm et al.，2004)。该家族蛋白在生物进化过程中是非常保守的，Mi-2-like蛋白已经在脊椎动物、果蝇、线虫、酵母和拟南芥中报道了(Delmas et al.，1993 ；Woodge et al.，1997 ；Kehle et al.，1998 ；Eshed et al.， 1999 ；Zelewsky et al.，2000)。另外，Mi_2蛋白是ATP依赖的核小体重塑和组蛋白去乙酉先基化复合体 NuRD (ATP-dependent Nucleosome Remodeling and histone Deacetylase complex)的一个核心成分，该复合体与组蛋白的去乙酰基化以及基因转录沉默之间可能有联系(Wade et al.，1999)。关于水稻Mi_21ike基因还未见报道，该基因突变产生的水稻突变体表型和控制植株发育的机制也是未知的。参考文献如下1、Brehm, A.，Tufteland, K. R.，Aasland, R. and Becker, P. B. (2004). The many colours ofchromodomains. Bioessays, 26 133-140(Brehm,A. ,Tufteland,K. R. ,Aasland,R. and Becker, P. B. (2004). chromo 功能域的多种角色·生物学评论，26 :133-140)。2、Delmas, V. ， Stokes, D. G. and Perry, R. P. (1993). A mammalian DNA-binding protein that contains a chromodomain and an SNF2/SWI2-like helicase domain. Proceeding of the National Academy of Sciences,90 :2414-2418(Delmas,V. ,Stokes, D. G. and Perry, R. P. (1993). 一种含有 chromo 功能域和 SNF2/SWI2_like 解旋酶功能域的哺乳动物DNA结合蛋白·美国科学院院刊，90 =2414-2418)。3>Eshed, Y. ,Baum,S.F.and Bowman,J. L. (1999). Distinct mechanisms promote polarity establishment in carpels of Arabidopsis. Cell, 15 199-209(Eshed, Y., Baum, S. F. and Bowman, J. L. (1999).截然不同的机制促进拟南芥心皮的极性建立.细胞， 15 :199-209)。4> Hiei, Y. , Ohta, S. , Komari, T. and Kumashiro, Τ. (1994). Efficient transformation of rice, Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal,6 :271-282(Hiei, Y., Ohta, S.，Komari, T. and Kumashiro, T. (1994).农杆菌介导的水稻有效转化和T-DNA边界的序列分析.植物学杂志，6 :271-282)。5、Hochholdinger, F. and Zimmermann, R. (2008). Conserved and diverse mechanisms in root development.Current Opinion in Plant Biology,11 70-74 (Hochholdinger, F. and Zimmermann, R. (2008).根发育中保守的且多样化的机制·植物生物学当前观点，11 :70-74)。6、Kehle，J.，Beuchle，D.，Treuheit, S.，Christen，B.，Kennison, J. A.，Bienz, M. and Miiller, J. (1998). dMi-2, a Hunchback-Interacting Protein That Functions in Polycomb Repression. Science,282(5395) : 1897-1900(Kehle，J. ,Beuchle,D.,Treuheit, S.，Christen，B.，Kennison，J. A.，Bienz，Μ. and Muller, J. (1998). dMi_2，一个 Hunchback 相互作用蛋白，具有阻遏I5Olycomb的功能.科学，282(5395) :1897-1900)。7、Seelig, H. P. ，Moosbrugger, I. ， Ehrfeld, H. ， Fink, Τ. ， Renz, Μ. and Genth, Ε. (1995). The major dermatomyositis-specific Mi_2 autoantigen is a presumed helicase involved in transcriptional activation.Arthritis & Rheumatism，38 1389-1399 (Seelig, H. P. ， Moosbrugger, I. ， Ehrfeld, H. ， Fink, Τ. ， Renz, Μ. and Genth, Ε. (1995).皮肌炎特异的Mi-2自身抗原是一种参与转录激活的假定的解旋酶，38: 1389-1399)。8、Wade, P. Α.，Gegonne, Α.，Jones，P. L，Ballestar, Ε.，Aubry, F. and Wolffe, Α. P. (1999). Mi-2 complex couples DNA methylation to chromatin remodelling and histone deacetylation. Nature Genetics，23 :62-66 (Wade，P. A.，Gegonne, Α.，Jones， P. L ,BallestariE. ,AubryiF. and WolffeiA. P. (1999). Mi-2 复合物将 DNA 甲基化与染色质重塑和组蛋白去乙酰基化连接起来.自然遗传，23 :62-66)。9、Woodage，T.，Basrai，Μ. A.，Baxevanis, A. D.，Hieter, P. and Collins， F. S. (1997). Characterization of the CHD family of proteins. Proceeding of the National Academy of Sciences，94 :11472-11477 (Woodage，T.，Basrai，M. A.，Baxevanis， A.D.，Hieter，P. and Collins，F. S. (1997). CHD 家族蛋白的描述.美国科学院院刊，94 11472-11477)。10、Xu, L.，Xu, Y.，Dong, Α.，Sun, Y. , Pi, L. , Xu, Y. and Huang, H. (2003). Novel as 1 and as 2defects in leaf adaxial-abaxial polarity reveal the requirement for ASYMMETRIC LEAVES1 and 2and ERECTA functions in specifying leaf adaxial identity. Development, 130 :4097-4107 (Xu, L. ,Xu, Y. ,Dong, A. , Sun, Y. ,Pi,L. ,Xu, Y. and Huang, H. (2003).新突变体asl和as2缺失叶的近轴面-离轴面极性，揭示了 ASYMMETRIC LEAVESU2和ERECTA对于叶的近轴面形态建成是必要的.发育，130 =4097-4107)。11、Zelewsky, T. , Palladino, F. , Brunschwig, K. , Tobler, H. , Haj nal, A. and Miiller, F. (2000). The C. elegans Mi_2 chromatin-remodelling proteins function in vulval cell fate determination. Development,127 :5277-5284 (Zelewsky, Τ., Palladino，F. , Brunschwig, K.，Tobler，H.，Hajnal，A. and Muller,F, (2000).线虫的 Mi_2 染色质重塑蛋白在外阴细胞命运决定中起功能.发育，127 =5277-5284)。12、Yoshida S. , Fomo D. A. , Cock J. H. and Gomez K. Α. (1976). Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice, Ed 3.The International Rice Research Institute :The Philippines. (Yoshida S. , Fomo D. A. , Cock J. H. and Gomez K. A. (1976). 水稻生理研究实验手册，第三版.国际水稻研究所)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时控制水稻不定根伸长和叶绿体形成的新基因0sCHR4，如SEQ ID NO 1所示的⑶S序列，也包括与SEQ ID NO 1所示的⑶S序列至少有80%同源性的基因序列。本发明中的SEQ IDNO :2所示的蛋白质属于CHD家族，包括其中进行一个或几个氨基酸替换、插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID NO 1中取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。为了解决上述技术问题，本发明提供一种控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因 0sCHR4编码的蛋白质，其特征在于其具有SEQ ID NO :2 (即序列表中的序列2)所示的氨
基酸序列。作为本发明的蛋白质的改进氨基酸序列还包括在SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。本发明还同时提供编码上述蛋白质的基因，其具有SEQ ID NO :1(即序列表中的序列1)所示的核苷酸序列。作为本发明的基因的改进核苷酸序列还包括在SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。本发明还同时提供了上述基因的用途用于构建转基因水稻。本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，为包含本发明所述基因的转基因植物细胞。本发明的另一个目的是提供一种用0sCHR4基因进行高效的植物转化方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO :1所示的序列片段的载体。本发明的具体实施内容如下
从本实验室发展的EMS(ethyl methylsulfonate)诱变的粳稻(Oryza Sativa L. ssp japonica)地方品种SSBM突变体库中筛选到一个水稻不定根伸长受抑和叶片上表面白化的突变体0schr4(命名参照克隆到的突变基因的注释信息，图1A)，不定根长度和叶绿素含量测定结果显示在突变体中都有明显降低(图1B)。叶片的组织学观察和透射电镜分析，发现突变体叶肉上表面细胞中的叶绿体不能正常发育(图1C，D)，这就是叶片上表面白化的原因。在植株生长后期，突变体叶片发生明显的向上卷曲，不定根发育受阻和分蘖数显著减少(图1E)。本发明采用图位克隆方法获得了突变体表型控制基因0sCHR4。首先创建了一个 F2定位群体，由纯合突变体为母本，籼稻野生型Kasalath为父本杂交获得F1杂合体，以F1 自交后代F2中突变体性状的个体作为基因的定位群体。通过对遗传群体分析(F2中野生型和突变体表型的个体比例约为3 1)，确定该突变体是一个符合单基因控制的孟德尔遗传规律的隐性突变体。首先，利用实验室通用的SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记进行粗定位，将突变基因定位在第七条染色体长臂上RM1135和RM3404两个标记之间(图 2A)。然后对这两个标记之间的BAC序列分析比较，发展新的STSGequence Tagged Site) 标记将突变基因精细定位于0J1457_D07和0J1197_D06上STS3和STS5分子标记之间，即 STS4分子标记附近。该区间的物理距离为211Λ，根据水稻基因注释信息，该区间包含3个基因。序列分析表明突变体表型是由于L0C_07g31450基因座上一个T碱基缺失造成的，这个缺失突变导致终止密码子前移，产生无功能的蛋白质产物。该基因编码一个染色质重塑因子4(CHR0MATINREM0DELING 4)，MI-2LIKE蛋白，由此将基因命名为0sCHR4，将突变体命名为0schr4。通过对该基因cDNA序列(SEQ ID NO 1)和基因组序列比对确定了该基因结构 (图2B)，并将T碱基的缺失定位于该基因最后一个外显子上。并且利用pfam网站(http // pfam. sanger. ac. uk)，分析了 0sCHR4 蛋白(SEQ IDNO 2)的保守结构域(图 2B)。为了确证突变体表型是由0sCHR4基因突变引起的。我们对突变体进行了转基因恢复验证。将由0sCHR4基因自身启动子驱动的完整的⑶S序列(SEQ ID NO 1)克隆到双元植物转基因载体pCAMBIA1300-sGFP的多克隆位点BamHI位点，得到Pfeaffi4: 0sCHR4 sGFP 恢复载体。将构建好的恢复载体通过农杆菌介导的遗传转化系统转化突变体愈伤，经过抗性愈伤诱导进而分化成转基因苗。转化了外源0sCHR4基因的突变体(即转基因阳性株系) 的不定根长度恢复到野生型，叶片上表面颜色复绿。图3为两个T1转基因恢复株系结合野生型和突变体的表型(图3A-C)和相应的生物学统计结果(图3D-E)，叶绿素的含量和不定根的长度都能恢复到野生型的水平。转基因恢复试验确证了突变体表型是由0sCHR4基因突变引起的，表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻。为了观察0sCHR4蛋白(SEQ ID NO 2)的亚细胞定位功能，将0sCHR4基因的CDS 序列(SEQ ID NO 1)构建到35S: :sGFP表达载体内，得到35S: 0sCHR4 sGFP融合表达载体。用洋葱的瞬时表达系统观察0sCHR4(SEQ ID NO :2)的蛋白表达。首先，提取融合表达载体35S: :0sCHR4::sGFP及无基因融合空载体35S: :sGFP的质粒，用金粉分别包裹后， 基因枪轰击至洋葱表皮细胞。暗环境下培养16小时后，激光共聚焦显微镜下观察。结果表明，无基因融合的对照载体35S::sGFP的绿色荧光均勻地表达于整个洋葱表皮细胞，而 35S: :0sCHR4: :sGFP融合蛋白则特异性地分布于细胞核内(图4)。进一步，对转基因恢复水稻中GFP荧光信号进行了检测，结果也表明0sCHR4(SEQ ID NO 2)是一种核定位蛋白(图5)。这些结果表明，我们克隆的水稻0sCHR4基因具有一定的应用价值。我们可以通过利用该基因对作物品种进行转基因改造，获得外源基因能正确表达的转基因恢复植株。同时也表明通过基因工程手段，该基因具有改良叶色及根发生能力的潜力。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明，但并非对发明作限定。图1是水稻不定根伸长缺陷和叶色白化突变体0schr4的表型图；A为水稻营养液培养8天的植株表型，左边为野生型(SSBM)，右边为突变体 (0schr4)，bar = 2cm ；B为SSBM和0schr4的不定根长度和叶绿素含量测定结果；C为叶片组织学观察结果，bar = 100 μ m，左边为SSBM的叶片，右边为0schr4的叶片；D为叶绿体的超微结构，左边为SSBM的叶绿体，中间为0schr4上表面的叶绿体，右面为0schr4下表面的叶绿体，bar = 0. 5μπι;Ε为SSBM (左边)和0schr4(右边)植株生长后期表型，突变体 0schr4表现为叶片卷曲、不定根伸长受阻、分蘖数减少，bar = 6cm。图2是0sCHR4基因在水稻第七条染色体上的图位克隆和基因结构图；A为0sCHR4基因的定位图；B为0sCHR4基因结构和0sCHR4蛋白结构图。图3是转基因恢复株系的表型图；A为SSBM(左一)、0schr4(左二)和两个转基因恢复株系(左三和左四)在水稻营养液中培养8天的植株表型，bar = 2cm ；B和C分别为叶片上表面和叶片下表面表型，叶片顺序排列从左到右为SSBM、0schr4和两个转基因恢复株系；D和E分别为它们的不定根长度和叶绿素含量测定结果。图4是35S: :0sCHR4::sGFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表达结果图；上行为 35S::sGFP空载体的定位结果，下行为35S: :0sCHR4: sGFP融合载体的定位结果；左边为白光图，中间为GFP荧光图，右边为前二者的融合图。图5是在T1转基因恢复植株根部和叶片中的GFP荧光检测结果图；左列为PI染色或者叶绿体自发荧光；中间列为GFP的检测信号；右列为前两者的融合。在转基因植株中 0sCHR4表现为细胞核定位，根部图片中bar = 100 μ m，叶片图片中bar = 50 μ m。图6是转基因恢复载体pCAMBIA1300_sGFP的结构示意图。图7是亚细胞定位载体35S: :sGFP的结构示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例1、突变体筛选和表型以EMS诱变的水稻地方品种SSBM突变体库为突变体筛选对象，M2种子(诱变处理前为M。，处理后为MnM2种子为M1的自交后代)用蒸馏水冲洗干净，0. 67%稀ΗΝ03(质量浓度)破休眠处理18小时，37°C暗处催芽至露白。将露白的种子播于水稻培养液(培养液配方为国际水稻所的标准配方，具体参考^shida et al. ,1976)上浮着的尼龙网纱上面，在温度为30/22°C (昼/夜)左右、光照12小时条件下培养8天，以不定根构型(包括长度、数量等)的改变为筛选标准进行突变体的筛选，从中筛选到一个不定根缩短的突变体， 并且该突变体叶片上表面发生白化而下表面表现正常(图1A)。该突变体不定根长度和叶片叶绿素含量显著降低(图1B)。该突变体的地上部的株高及根部的主根长度、侧根长度和数量与野生型SSBM之间都没有显著性差异(图1A)。为了进一步明确突变体叶片上表面白化的原因，对叶片进行组织学分析，发现突变体上表面2-3层叶肉细胞不能被0. 1 %的亚甲基蓝染料着色(图1C)；通过叶绿体超微结构观察，发现突变体上表面叶绿体不能进行正常发育，而叶片下表面的叶绿体结构表现是正常的(图1D)。在成熟期阶段，突变体表现出分蘖数和不定根数目显著减少以及叶片内卷特征(图1E)。上述筛选到的突变体命名为0schr4。实施例2、基因定位F2定位群体来自于纯合突变体(0schr4)和籼稻品种Kasalath杂交后代，由杂合子&自交获得，共筛选出观50个具有突变表型的F2个体(其突变表型具体为叶片上表面白化且不定根短小)，从水稻叶片中提取基因组DNA。取大约0. Ig水稻幼嫩叶片于1. 5ml 的离心管中用组织磨样器将叶片打成粉末，提取总DNA，获得的DNA溶解于200 μ 1无菌水中作为DNA样品，每个PCR反应用0. 5 μ 1 DNA样品作为模板。在0sCHR4基因的粗定位试验中，用30个具有突变表型的F2个体进行分析。根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均勻分布于各条染色体上的146个SSR 引物，SSR引物来源于Gramene (http://www. gramene. org/)网站提供的已经公知的标记， 用到的各染色体上的SSR引物名称如下水稻1号染色体(17个)RM1282, RM1167, RM272, RM243, RM600, RM3412, RM8115, RM329, RM5638, RM6716, RM1349, RM1297, RM3411, RM6547, RM1198, RM165, RM6141水稻2号染色体(12个)RM6938, RM279, RM6378, RMl74, RM5699, RM1358, RM7426, RM341, RM3688, RM6, RM425, RM5607水稻3号染色体(13个)RM523, RM6038, RM1022, RM157A, RM5551, RM1164, RM6881, RM6266, RM347, RM1350, RM5813, RM143, RM148水稻4号染色体(13个)RM25054, RM3471, RM2416, RM16604, RM5688, RM1100, RM1359, RM6997, RM3866, RM2441, RM348, RM567, RM3648水稻5号染色体(9个)RM3334, RM267, RM3193, RM3381, RM6645, RM1237, RM3573, RM334, RM3170 水稻 6 号染色体(14个)RM170, RM190, RM584, RM276, RM50, RM3183, RM6536, RM3, RM3187, RM5371, RM7434, RM6458, RM5307, RM5814水稻7号染色体(13个)RM5344, RM82, RM125, RM1186, RM3755, RM1135, RM3404, RM346, RM3826, RM7564,RM3589, RM1209, RM3555水稻8号染色体(12个)RM1235, RM8018, RM1376, RM310, RM6429, RM3395, RM325A, RM8264, RM556, RM334, RM3120, RM3754水稻9号染色体(10个)RM5688, RM2855, RM444, RM7390, RM105, RM409, RM3700, RM257, RM328, RM6174水稻10号染色体(9个)RM474, RM7545, RM25185, RM3311, RM25369, RM271, RM1108, RM5666, RM228水稻11号染色体(13个)RM286, RM7557, RM1124, RM552, RM3701, RM4862, RM3428, RM6272, RM254, RM144, RM5349, RM4601, RM2191水稻12号染色体(11个)RM628, RM3455, RM83,12_9528k，RM7102, RM1261, RM101, RM1246, RM1103, RM3739, RM1296然后按照引物要求的反应条件进行PCR扩增(反应体系如下)。通过6%的聚丙烯酰胺凝胶(凝胶配置方法如下)电泳分离，通过检测条带的多态性，将基因粗定位到水稻第七条染色体上的分子标记RMl 135和RM3404之间。PCR反应体系
DNA模板Ιμ
10XPCR BufferΙμ
dNTP (2.5mM)0.6μ1上游引物(ΙΟμΜ) 0.2μ1
下游引物(ΙΟμΜ) 0.2μ1 Taq 酶(5U L) 0.2μ1 ddHzO_6.8μ1聚丙烯酰胺凝胶(6% )配方
尿素4.
5 χ TBE6ml 注40% Arc-Bis (丙烯酰胺38g和亚甲基双丙烯酰胺2g溶于IOOml水所得)聚丙烯酰胺凝胶显色液配方Na3(BO4)40.152g
NaOH12g甲醛3.2mlddH,0至 800ml注甲醛是临用前现加，其他三个按相应量提前配好。然后我们扩大F2个体到200个，继续缩小定位区间至分子标记STSl和STS2 (设计的引物序列如下)之间。最后将F2定位群体扩大到观50个进行精细定位，根据网上公布的 Nipponbare BAC末端序列，再设计3个分子标记，分别命名为STS3，STS4，STS5(引物序列如下)。利用这三个分子标记对观50个F2个体进行连锁分析，将目的基因卡定在STS3和 STS5分子标记之间，STS4分子标记附近21kb范围之内。这5个STS分子标记的引物序列(包括上下游)为STS1U-5，GTTCCCATCATTCTAATATGCT 3’ ；STS1L-5’ CGTTCCCACAGGTCTCAAC 3’STS2U-5，ACGGTGACTCAAACAGCAT 3’ ； STS2L-5，TGGAGAGGCATAAATGTGCTAT 3’STS3U-5，CGTGAAAGAGGAATTCATAT 3’ ； STS3L-5，GGACAGGCTCTATGCTTAGT 3’STS4U-5，GCTTAAAGCTTCATTAGGA 3’ ； STS4L-5，GCTTAAAGCTTCATTAGGA 3’STS5U-5，ATAGAGTTCTCCTGAGTATT 3’ ； STS5L-5，CTGAAAAATGACTATGTTAG 3’实施例3、基因预测和序列分析根据精细定位结果，0sCHR4基因位于BAC克隆0J1457_D07和0J1197_D06上STS4 分子标记附近 21kb 范围之内(图 2A)。根据 TIGR(http://www. tigr. org/tdb/e2kl/osal/) 的水稻基因注释信息和EST数据库(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)，对此染色体区段内的3个基因进行测序分析。这3个基因分别是0s07g31430 (phosphate-induced protein 1) ；0s07g31440 (expressed protein) ；0s07g31450 (CHR4/MI-2-LIKE)。对这 3 个候选基因在野生型(SSBM)和突变体(0schr4)的cDNA模板下进行扩增，经过测序和序列比对分析， 发现0s07g31450基因在突变体中的CDS序列(SEQ ID NO 1)起始密码子ATG后M73bp处缺失一个碱基T，导致终止密码子前移，产生无功能的蛋白质。然后通过该基因的cDNA序列(SEQ ID NO 1)和基因组序列比对分析确定了基因结构，利用0sCHR4的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)，得到其保守结构域(图2B)。实施例4、0sCHR4遗传恢复载体的构建由于0sCHR4基因组序列较大，启动子和0sCHR4基因组融合的PCR扩增很困难， 因此构建恢复载体时，选择使用0sCHR4基因的启动子接其全长CDS序列(SEQ ID NO :1)。 首先分别构建0sCHR4基因启动子的克隆和0sCHR4基因全长CDS的克隆，测序后确定序列正确的克隆，然后用I^rimeSTAR高保真酶(TaKaRa生物公司)和以扩增启动子的上游引物 Pro-F (引物序列如下，带恢复载体上的酶切位点BamHI和保护碱基)、以扩增0sCHR4基因全长CDS的下游引物CDS-R(引物序列如下，带恢复载体上的酶切位点BamHI和保护碱基) 作为引物对进行两片段融合PCR扩增，PCR反应体系和扩增条件如下。融合片段经过限制性酶切后与同样经过BamHI酶切过的pCAMBIA1300_SGFP载体(终载体)连接，得到恢复载体 P。sCHR4: :0sCHR4: :sGFP。
PCR反应体系
权利要求
1.一种控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因编码的蛋白质，其特征在于其具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因彻以/拟编码的蛋白质， 其特征在于所述氨基酸序列还包括在SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
3.一种编码权利要求1或2所述的蛋白质的基因，其特征在于其具有SEQ ID NO 1 所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述核苷酸序列还包括在SEQID NO 1 所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
5.如权利要求3或4所述基因的用途用于构建转基因水稻。
6.一种转基因植物细胞，其特征在于包含权利要求3或4所述基因的转基因植物细胞。
全文摘要
本发明公开了一种控制水稻不定根伸长和叶片颜色基因OsCHR4编码的蛋白质，其具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蛋白质的基因，其具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。本发明所述的基因能用于构建转基因水稻。本发明还同时公开了一种包含本发明所述基因的转基因植物细胞。
文档编号A01H5/00GK102153638SQ20111007122
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者刘绍军, 吴平, 张帆, 毛传澡, 王晓飞, 赵春芳 申请人:浙江大学