专利名称：一种香蕉组培苗种源的低温保存方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养方法，具体涉及一种香蕉组培苗种源的低温保存方法。
背景技术：
我国是香蕉主产国之一，也是世界上栽培香蕉历史最悠久的国家之一，我国香蕉的品种资源十分丰富，对世界的香蕉产业作出了重大贡献。我国人口众多，香蕉消费量巨大，但目前每年每人香蕉消耗量平均不足4kg，随着交通运输、香蕉保鲜技术的改善及人民生活水平的提高，香蕉的需求量仍会大大增加，我国的香蕉的生产规模也必然会继续扩大。 为提高我国香蕉产业的竞争力，发展其相关的高新生物技术并加以推广和应用十分迫切和必要。香蕉组培苗的成功推广和周年栽培技术的应用，使种植香蕉比种植水稻等其他作物的效益高，取得了明显的经济和社会的效益，达到了香蕉高产、优质、高效的目的。我国香蕉生产已基本上实现了种植品种的良种化，种苗生产的工厂化。目前国内香蕉种植的良种覆盖率已达90%以上，通过香蕉组培育苗技术，培育出大量优质无病毒、生长整齐的香蕉试管苗代替了传统的吸芽苗，从而大幅度地提高了我国香蕉的生产水平。进一步有计划地引进品质好、产量高、抗逆性强的外来名优新品种，并通过组织培养进行种苗的规模化生产， 实现区域化、标准化生产，可推进我国香蕉产业的快速发展。但是，我国在香蕉组培苗的生产中存在着一些问题，如变异株的识别和控制、组培苗种源的保存、生产成本的控制、组培苗质量的稳定等方面。特别是在组培苗种源的保存方面极少见报道。由于香蕉种苗需求的季节性和不稳定性，有时种源大多，市场上不需要种苗时将会造成大量的浪费，而当市场上突然需要大量种苗时，又没有足够的种源可用于生产， 因此，组培苗种源的保存在香蕉的规模化生产中有时会起到关键性的作用。在目前，国内外还没有香蕉组培苗种源保存的报道，也未见香蕉组培苗种源保存的专利申请。本发明采用独特的培养基和合适的培养温度和培养光照等培养条件进行香蕉组培苗种源的有效保存。本实验中采用的香蕉材料有皇帝蕉、巴西蕉、粉蕉等。皇帝蕉(Musa paradisiaca AA)，原产印度尼西亚，是独特的食用二倍体(AA型)香蕉。在东南亚广为栽培，古时为泰国、 越南进贡我国皇帝的佳果而又被称为贡蕉，在缅甸因其甜度高又称其为甜蕉。皇帝蕉果小， 长约10厘米左右，无籽，皮薄、熟后皮金黄色，色泽鲜艳，外型美观，果肉橙黄、清甜芬芳、香甜可口，在我国一上市就十分畅销。皇帝蕉果实营养丰富，据报道，每100克可食部分含碳水化合物20克，蛋白质1. 2克，脂肪0. 6克，还含有多种维生素，是世界上公认的高档香蕉品种之一。巴西蕉(Musa AAA Giant Cavendish cv. Baxi)是我国目前生产规模最大的香蕉品种，基因型为AAA，产量高，果实品质好。而粉蕉(Musa ABB)是芭蕉属的杂交栽培种，又名西贡蕉、安南蕉和奶蕉等，其基因型是ABB，抗风、 抗寒、抗旱能力较强，粉蕉果皮金黄，皮薄， 果肉乳白色或浅橙色，口感嫩滑甜蜜，微香，可食率高，近年来在我国种植面积迅速扩大。
发明内容
本发明的目的是提供一种保存成本低、操作简单、保存效果好的，能有效的对香蕉组培苗种源进行保存的方法，利用该方法可以先对香蕉组培苗种源进行保存，当需要进行香蕉种苗大规模生长时，可以将该低温保存的香蕉组培苗种源经种源恢复生长、继代增殖和生根培养后，在短时间内获得大量的试管苗，为香蕉种苗的适时生产提供一条有效的途径。本发明的香蕉组培苗种源的低温保存方法，包括以下步骤(1)种源的低温保存将香蕉通过组织培养获得的丛生芽切割后接种到低温保存培养基中，培养温度为14 18°C，培养光照为500 8001x，光照时间6 10小时/天，所述的低温保存培养基为每升培养基含有6-苄氨基腺嘌呤0. 1 0. 5mg、丁酰胼60 90mg， 蔗糖10 20g、琼脂6 7g、余量为1/2MS，pH 5. 5 5. 8，由此而保存了香蕉组培苗的种源；继代周期为3 4个月，保存过程中有时会有少量根产生，每周期的增殖系数为1. 8 (2)种源的恢复生长将低温保存的组培苗种源切割后接种到恢复生长培养基中，8 10天种源能恢复正常生长，30 35天时，将恢复正常生长的种源接种到新的恢复生长培养基中进行增殖快繁获得丛生芽，增殖倍数可达2. 5 3倍，培养条件培养温度 25 30°C，光照度1500 20001x，光照时间12 16小时/天，所述的恢复生长培养基为每升培养基含有6-苄氨基腺嘌呤3 5mg、吲哚丁酸0. 2 0. 5mg、蔗糖20 30g、琼脂6 7g、余量为MS, pH 5. 5 5. 8 ；丛生芽经常规生根培养获得试管苗。试管苗经常规移植、炼苗后获得栽培苗，栽培苗可用于生产栽培。所述的步骤(1)中的将香蕉通过组织培养获得的丛生芽优选是通过以下方法获得，外植体的选择和培养选取生长健壮、无病害的香蕉植株的40 50cm高的吸芽作为外植体，用水洗净，切除上部的外假莲，留下4 8cm高的茎和下部外假茎，无菌条件下，逐层剥去包在茎外的叶鞘，每剥一层用体积分数70 75%的酒精水溶液擦1次，当外植体为 2cmX2cmX2cm时，浸泡在体积分数为70 75%的酒精水溶液中10 15秒，再用质量体积百分浓度为0. 05% 0. 2%升汞溶液消毒1 2次，每次3 6分钟，无菌水冲洗4 5 次，切去基部变褐的部分，再将外植体剥至生长点，接种到腋芽启动培养基中培养，当腋芽长出时，将其切下在新的腋芽启动培养基上进行丛生芽增殖；培养条件培养温度25 30°C，光照度1500 20001x，光照时间12 16小时/ 天，所述的腋芽启动培养基为每升培养基含有6-苄氨基腺嘌呤4 6mg、吲哚丁酸0. 1 0. 5mg、蔗糖20 30g、琼脂6 7g、余量为MS, pH 5. 5 5. 8。丛生芽增殖的继代周期为30 40天，更优选当增殖到第3 4代时，每个外植体有20 30个芽，取样2 4个进行“巴拿马”病的病毒免疫学检测，检测无病菌的株系用于种源保存和随后的生长步骤(2)中所述的生根培养优选步骤为将在新的恢复生长培养基中进行增殖快繁获得丛生芽切成单芽后，再转入生根培养基中生根培养，培养温度25 30°C，光照度 1500 20001x，光照时间12 16小时/天，直至长成试管苗，所述的生根培养基为每升培养基含有吲哚丁酸1. 0 2. Omg、萘乙酸0. 2 0. 8mg、蔗糖20 30g、琼脂6 7g，余量为 MS, pH 5. 5 5. 8。经生根培养后，芽的生根率可达100%。所述的MS为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看文献(谭文澄、戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京中国林业出版社，1991)；所述的1/2MS是将MS中的大量元素浓度减半，而其他成分浓度不变而形成的培养基。本发明采用独特的培养基、合适的培养温度和培养光照等培养条件对丛生芽(种源)进行低温保存处理，使丛生芽由原来的继代周期为30 40天变成低温保存的继代周期3 4个月，由于继代周期的延长，使得丛生芽的保存时间延长，当需要试管苗时，可将低温保存的丛生芽经种源恢复生长、继代增殖又获得丛生芽，丛生芽经生根培养后，在短时间内获得大量的试管苗，为香蕉种苗的适时生产提供一条有效的途径。本发明具有保存成本低、操作简单和保存效果好等优点，在需要进行种苗大规模生长的时候，能在短时间内，将低温保存的种源经恢复生长、继代增殖又获得丛生芽，丛生芽经生根培养后，在短时间内获得大量的试管苗，为香蕉种苗的适时生产提供一条有效的途径。
具体实施例方式以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1 皇帝蕉组培苗种源的低温保存(1)外植体的选择和培养在无病害的皇帝蕉种植基地，在生长季节选取生长健壮、无病害的植株的40-50cm 高的吸芽为外植体，在自来水下冲洗干净表面的泥土后，切除上部的外假茎，留下4-8cm高的茎和下部外假茎。在超净工作台无菌条件下再逐层剥去包在茎外的叶鞘，每剥一层用体积分数为70%酒精水溶液擦1次，当外植体为2CmX2CmX2Cm大小时，浸泡在体积分数为70%酒精水溶液中10秒，再用质量体积百分比浓度为0. 05%的升汞溶液消毒2次，每次6分钟，无菌水冲洗4次，切去基部变褐的部分，再将外植体剥至高约0. 5cm左右生长点，接种到腋芽启动培养基中培养，该腋芽启动培养基为每升培养基含有6-苄氨基腺嘌呤 (6-BA)4mg、吲哚丁酸(IBA)O. lmg、蔗糖20g、琼脂6g、其余为MS，pH 5. 5，培养温度25°C，光照度15001x，光照时间12小时/天，当腋芽长出时，将其切下在新的腋芽启动培养基上进行丛生芽增殖，培养温度25°C，光照度15001x，光照时间12小时/天。继代周期为40天，当增殖到第4代，每个外植体有20个芽，取2个进行“巴拿马”病的病毒免疫学检测，检测无病菌的株系才能用于种源保存和随后的生产。(2)种源的低温保存将上一步骤继代培养获得的，经检测无病菌的株系的丛生芽(种源)切割后接种到低温保存培养基中，该低温保藏培养基为每升培养基含有6-苄氨基腺嘌呤 (6-BA)0. lmg、丁酰胼(比久，B9)60mg、蔗糖10g、琼脂6g、余量为1/2MS，pH 5. 5，培养温度为14°C，培养光照为5001x，光照时间10小时/天，继代周期为4个月。保存过程中有时有少量根产生，每周期的增殖系数为1. 8，由此而保存了组培苗的种源。(3)种源的恢复生长将上一步骤经低温保存的组培苗种源切割后接种到恢复生长培养基中，该恢复生长 培养基为每升含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg、吲哚丁酸(IBA)O. 2mg、蔗糖20g、琼脂 6g、其余为MS, pH 5. 5，培养温度25°C，光照度15001x，光照时间16小时/天，10天能恢复正常生长，35天时再转入新的恢复生长培养基上进行增殖快繁，增殖倍数可达2. 5倍。
(4)生根培养将上一步骤增殖所获得的丛生芽切成单芽后再转入到生根培养基中，该生根培养基为每升含有吲哚丁酸(IBA) 1. Omg、萘乙酸(NAA)O. 2mg、蔗糖20g、琼脂6g、其余为MS，pH 5. 5，培养培养温度25°C，光照度15001x，光照时间16小时/天，经生根培养，生根率可达 100%，而后长成试管苗。实施例2 巴西蕉组培苗种源的低温保存(1)外植体的选择和培养 在无病害的巴西蕉种植基地，在生长季节选取生长健壮、无病害的的植株的 40-50cm高的吸芽为外植体，在自来水下冲洗干净表面的泥土后，切除上部的外假茎，留下 4-8cm高的茎和下部外假茎。在超净工作台无菌条件下再逐层剥去包在茎外的叶鞘，每剥一层用体积分数为75%酒精水溶液擦1次，当外植体为2CmX2CmX2Cm大小时，浸泡在体积分数为75%酒精水溶液中15秒，再用质量体积百分比浓度为0. 2%升汞溶液消毒1次，每次 3分钟，无菌水冲洗5次，切去基部变褐的部分，再将外植体剥至高约0. 5cm左右生长点，接种到腋芽启动培养基，该腋芽启动培养基为每升培养基含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)6mg、 吲哚丁酸(IBA)O. 5mg、蔗糖30g、琼脂7g、其余为MS、pH 5. 8，当腋芽长出时，将其切下在新的腋芽启动培养基上进行丛生芽增殖，上述培养条件为培养温度30°C，光照度20001x，光照时间16小时/天。继代周期为30天，当增殖到3代，每个外植体有30个芽，取2个进行 “巴拿马”病的病毒免疫学检测，检测无病菌的株系才能用于种源保存和随后的生产。(2)种源的低温保存将继代培养获得的、经检测无病菌的株系的丛生芽作为种源切割后接种到低温保存培养基中，该低温保藏培养基为每升含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0. 5mg、丁酰胼(比久， B9)90mg、蔗糖20g、琼脂7g、其余为1/2MS，pH5. 8，培养温度为18°C，培养光照为8001x，光照时间6小时/天。继代周期为3个月，保存过程中有时有少量根产生，每周期的增殖系数为2. 2，由此而保存了组培苗的种源。(3)种源恢复生长将上一步骤低温保存的组培苗种源切割后接种到恢复生长培养基中，该恢复生长培养基每升培养基含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)5mg、吲哚丁酸(IBA)O. 5mg、蔗糖30g、琼脂7g、其余为MS, pH 5. 8，培养温度30°C，光照度20001x，光照时间12小时/天，8天能恢复正常生长，30天时再转入新的恢复生长培养基上进行增殖快繁，培养温度30°C，光照度 20001x，光照时间12小时/天，增殖倍数可达3. O倍。(4)生根培养将上一步骤增殖所获得的丛生芽切成单芽后再转入到生根培养基中，该生根培养基为每升培养基含有吲哚丁酸(IBA) 2. Omg、萘乙酸(NAA)O. 8mg、蔗糖30g、琼脂7g，其余为 MS，pH 5. 8，培养温度30°C，光照度2000Ix，光照时间12小时/天，经生根培养，生根率可达 100%，而后长成试管苗。实施例3 粉蕉组培苗种源的低温保存(1)外植体的选择和培养在无病害的粉蕉种植基地，在生长季节选取生长健壮、无病害的的植株的40-50cm 高的吸芽为外植体，在自来水下冲洗干净表面的泥土后，切除上部的外假茎，留下4-8cm高的茎和下部外假茎。在超净工作台无菌条件下再逐层剥去包在茎外的叶鞘，每剥一层用体积分数为72%的酒精水溶液擦1次，当外植体为2CmX2CmX2Cm大小时，浸泡在体积分数为72%的酒精水溶液中12秒，再用质量体积百分比浓度为0. 升汞溶液消毒2次，每次5 分钟，无菌水冲洗4次，切去基部变褐的部分，再将外植体剥至高约0. 5cm左右生长点，接种到腋芽启动培养基，该腋芽启动培养基为每升含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)5mg、吲哚丁酸 (IBA)O. 3mg、蔗糖25g、琼脂6. 5g、其余为MS，pH 5. 6，培养温度28°C，光照度18001x，光照时间14小时/天。当腋芽长出时，可将其切下在新的腋芽启动培养基进行丛生芽增殖，，培养温度28°C，光照度18001x，光照时间14小时/天。继代周期为35天，当增殖到第4代， 每个外植体有25个芽，取4个进行“巴拿马”病的病毒免疫学检测，检测无病菌的株系才能用于种源保存和随后的生产。(2)种源的低温保存将上一步骤继代培养获得的、经检测无病菌的株系的丛生芽切割后接种到低温保存培养基中，该低温保藏培养基为每升含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0. 2mg、丁酰胼(比久， B9)80mg、蔗糖15g、琼脂6. 5g、其余为1/2MS，pH 5. 6，培养温度为16°C，培养光照为7001x, 光照时间8小时/天，继代周期为100天。保存过程中有时有少量根产生，每周期的增殖系数为2. 0，由此而保存了组培苗的种源。(3)种源恢复生长将上一步骤低温保存的组培苗的种源切割后接种到恢复生长培养基中，该恢复生长培养基每升含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)4mg、吲哚丁酸(IBA) 0. 4mg、蔗糖25g、琼脂 6. 5g、其余为MS，pH 5. 6，培养温度28°C，光照度18001x，光照时间14小时/天，9天能恢复正常生长，35天时再转入新的恢复生长培养基中上进行增殖快繁，培养温度28°C，光照度 18001x，光照时间14小时/天，增殖倍数可达2. 8倍。(4)生根培养将上一步骤增殖所获得的丛生芽切成单芽后再转入到生根培养基中，该生根培养基每升 含有吲哚丁酸(IBA) 1.5mg、萘乙酸(NAA)O. 4mg、蔗糖25g、琼脂6. 5g、其余为MS，pH 5. 6，培养培养温度28°C，光照度18001x，光照时间14小时/天，经生根培养，其生根率可达 100%，而后长成试管苗。
权利要求
1.一种香蕉组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤(1)种源的低温保存将香蕉通过组织培养获得的丛生芽切割后接种到低温保存培养基中，培养温度为14 18°C，培养光照为500 8001X，光照时间6 10小时/天，所述的低温保存培养基为每升培养基含有6-苄氨基腺嘌呤0. 1 0. 5mg、丁酰胼60 90mg，蔗糖 10 20g、琼脂6 7g、余量为1/2MS，pH 5. 5 5. 8，由此而保存了香蕉组培苗的种源；(2)种源的恢复生长将低温保存的组培苗种源切割后接种到恢复生长培养基中， 30 35天时，将恢复正常生长的种源接种到新的恢复生长培养基中进行增殖快繁获得丛生芽，培养条件培养温度25 30°C，光照度1500 2000lx，光照时间12 16小时/天，所述的恢复生长培养基为每升培养基含有6-苄氨基腺嘌呤3 5mg、吲哚丁酸0. 2 0. 5mg、 蔗糖20 30g、琼脂6 7g、余量为MS，pH 5. 5 5. 8 ；丛生芽经常规生根培养获得试管苗。
2.根据权利要求1所述的香蕉组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，所述的步骤 (1)中的将香蕉通过组织培养获得的丛生芽是通过以下方法获得，外植体的选择和培养 选取生长健壮、无病害的香蕉植株的40 50cm高的吸芽作为外植体，用水洗净，切除上部的外假茎，留下4 8cm高的茎和下部外假茎，无菌条件下，逐层剥去包在茎外的叶鞘，每剥一层用体积分数70 75%的酒精水溶液擦1次，当外植体为2CmX2CmX2Cm时，浸泡在体积分数为70 75%的酒精水溶液中10 15秒，再用质量体积百分浓度为0. 05% 0. 2% 升汞溶液消毒1 2次，每次3 6分钟，无菌水冲洗4 5次，切去基部变褐的部分，再将外植体剥至生长点，接种到腋芽启动培养基中培养，当腋芽长出时，将其切下在新的腋芽启动培养基上进行丛生芽增殖；培养条件培养温度25 30°C，光照度1500 20001x，光照时间12 16小时/天，所述的腋芽启动培养基为每升培养基含有6-苄氨基腺嘌呤4 6mg、吲哚丁酸0. 1 0. 5mg、 蔗糖20 30g、琼脂6 7g、余量为MS，pH 5. 5 5. 8。
3.根据权利要求2所述的香蕉组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，所述的在新的腋芽启动培养基上进行丛生芽增殖是在当丛生芽增殖到第3 4代时，每个外植体有 20 30个芽，取样2 4个进行“巴拿马”病的病毒免疫学检测，检测无病菌的株系用于种源低温保存。
4.根据权利要求1所述的香蕉组培苗种源的低温保存方法，其特征在于，步骤(2)中所述的生根培养步骤为将在新的恢复生长培养基中进行增殖快繁获得丛生芽切成单芽后，再转入生根培养基中生根培养，培养温度25 30°C，光照度1500 20001x，光照时间 12 16小时/天，直至长成试管苗，所述的生根培养基为每升培养基含有吲哚丁酸1. 0 2. Omg、萘乙酸0. 2 0. 8mg、蔗糖20 30g、琼脂6 7g，余量为MS，pH 5. 5 5. 8。
全文摘要
本发明公开了一种香蕉组培苗种源的低温保存方法。它是将香蕉经组培获得的丛生芽切割后接种到低温保存培养基中，在合适的条件下培养，然后将低温保存的种源切割后接种到恢复生长培养基中，在合适的条件下增殖快繁获得丛生芽，丛生芽经生根培养获得试管苗。本发明采用独特的培养基、合适的培养温度和培养光照等培养条件对丛生芽(种源)进行低温保存处理，使丛生芽由原来的继代周期为30～40天变成低温保存的继代周期3～4个月，由于继代周期的延长，使得丛生芽的保存时间延长，当需要试管苗时，可将低温保存的丛生芽经种源恢复生长、继代增殖又获得丛生芽，丛生芽经生根培养后，在短时间内获得大量的试管苗，为香蕉种苗的适时生产提供一条有效的途径。
文档编号A01H4/00GK102217537SQ20111009979
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者吴坤林, 张建霞, 曾宋君, 段俊 申请人:中国科学院华南植物园