专利名称：一种紫花苜蓿分子聚合育种方法
技术领域：
本发明涉及植物育种技术领域，特别是涉及一种紫花苜蓿分子聚合育种方法。
背景技术：
植物分子育种是指把供体植物带目的性状的遗传信息DNA分子或其中的目的基 因分离提取出来，导入待改良受体细胞中(受精卵、种胚细胞等)，使之整合、复制、表达和遗 传，并根据需要选育出带有目的性状的优良个体，培育出具有经济价值的新品种。高产、优质、抗逆是植物育种所追求的最终目标之一，寻找与高产、优质、抗逆相关 的功能基因，对育种具有重要意义。近年来，以分子标记、转基因技术为代表的分子育种技 术已成为植物育种发展的重要方向，分子育种正在由目前只能改变单个或少数遗传性状向 系统改良转变。传统的“经验育种”正逐步向定向、高效的“精确育种”转化。控制植物性状的通常为多基因，因此通过转基因来改变植物性状，往往需要转多 个基因才能达到改变植物某个性状的目的。转多个基因可以通过构建多个目的基因的多价 植物表达载体和多次转基因操作来实现。但是构建多价植物表达载体比较困难，因此要把 多个基因聚合到1个植株上，通常需要进行多次转基因操作，但是有些植物如紫花苜蓿获 得转基因植株的周期比较长，而且每次转基因时由于目的基因插入位点不同而表达有明显 差异，更是由于目的基因插入往往会改变原有的遗传平衡，使得多数转基因植株生命力差， 获得转了多个基因的正常植株的可能性很小。异花授粉植物是以异花授粉为主的一类植物，其中有些自交不孕，如苹果、梨；有 些自交后代严重退化，如紫花苜蓿、青蒿。因此要把分布于不同植株上的多个基因聚合到 1个植株上，就需要采用植物群体改良方法进行多次复合杂交(混合授粉)与优良单株的选 择，提高群体中目的基因的频率，从而达到将多个基因聚合到一起的目的。因此，有必要把植物转基因技术与群体改良方法相结合，形成一种异花授粉植物 分子聚合育种技术，以大大提高获得生长正常的转了多个基因植株的可能性，从而提高异 花授粉植物分子聚合育种效率。目前尚无相关研究报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种异花授粉植物分子聚合育种方法，特别是一 种紫花苜蓿分子聚合育种方法，该方法能够提高分子聚合育种效率。本发明一种紫花苜蓿分子聚合育种方法，包括运用转基因技术获得紫花苜蓿的不 同单株、运用复合杂交(混合授粉)技术进行1-3代繁育获得子代种子，以及运用依据逆境适 应性或性状表型的传统选择方法及分子检测技术选择聚合了全部目的基因的优良单株，并 通过混合选择法培育新品种三个步骤，具体通过以下步骤实现
(1)用常规转基因方法将目的基因导入紫花苜蓿的不同单株，获得相应的转基因单
株；
(2)运用复合杂交(混合授粉)技术进行1-3代繁育获得子代种子将转基因单株种植在一处，开花时混合授粉，种子成熟后混合収种，获得1代种子；或 再将1代种子种植在一处，开花时同样混合授粉，种子成熟后混合収种，获得2代种子；或继 续将2代种子种植在一处，开花时同样混合授粉，种子成熟后混合収种，获得3代种子；上述 复合杂交均设置隔离，以免外来花粉混杂和转基因植株花粉外窜；
(3 )运用依据逆境适应性或性状表型的传统选择方法及分子检测技术选择聚合了全部 目的基因的优良单株，并通过混合选择法培育新品种对步骤2所得种子进行检测，如果检 测结果未见聚合了全部目的基因的优良单株，再返回步骤2，将聚合了比较多目的基因的优 良单株再进行复合杂交；最后将聚合了全部目的基因的优良单株混合授粉，成熟后混収种 子，即育成了新品系。本发明的有益效果本发明一种紫花苜蓿分子聚合育种方法，通过运用转基因技 术获得紫花苜蓿的不同单株、运用复合杂交(混合授粉)技术进行1-3代繁育获得子代种子， 以及运用依据逆境适应性或性状表型的传统选择方法及分子检测技术选择聚合了全部目 的基因的优良单株，并通过混合选择法培育新品种三个步骤，把转基因技术与群体改良方 法相结合，进行多个目的基因聚合于一体的优良品种选育，提高了紫花苜蓿分子聚合育种 效率。本发明方法还可用于其它异花授粉植物比如青蒿等的育种。
具体实施例方式以下实施例的紫花苜蓿分子聚合育种方法，包括运用转基因技术获得紫花苜蓿的 不同单株、运用复合杂交(混合授粉)技术进行1-3代繁育获得子代种子，以及运用依据逆 境适应性或性状表型的传统选择方法及分子检测技术选择聚合了全部目的基因的优良单 株，并通过混合选择法培育新品种三个步骤，其中涉及到的基因，MDH为苹果酸脱氢酶基因， PEPC为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，CS为柠檬酸合成酶基因，A-T为苹果酸通道蛋白基 因，这些基因的序列及其克隆方法均已公开报道，为公知技术。实施例1:
(1)将MDH、PEPC基因分别导入紫花苜蓿2个不同单株，获得转MDH基因植株和转PEPC 基因植株；
(2)将转MDH基因植株和转PEPC基因植株种植在一处，开花时混合授粉，种子成熟后混 合収种，获得1代种子；开花授粉时设置隔离，以免外来花粉混杂和转基因植株花粉外窜；
(3)将获得的种子种植于酸性土壤中，选择得到生长性状表现好的植株8个，并用分子 技术检测这8株，最后获得聚合了 MDH、PEPC基因的优良单株5个；将聚合了全部目的基因 的5个优良单株混合授粉，成熟后混収种子，即育成了新品系。实施例2:
(1)将MDH、PEPC、CS基因分别导入紫花苜蓿3个不同单株，获得转MDH基因植株、转 PEPC基因植株和转CS基因植株；
(2)将转MDH基因植株、转PEPC基因植株和转CS基因植株种植在一处，开花时混合授 粉，种子成熟后混合収种，获得1代种子；又将1代种子种植在一处，开花时同样混合授粉， 种子成熟后混合収种，获得2代种子；再继续将2代种子种植在一处，开花时同样混合授粉， 种子成熟后混合収种，获得3代种子；上述复合杂交均设置隔离，以免外来花粉混杂和转基 因植株花粉外窜；(3)将获得的3代种子种植于酸性土壤中，选择得到生长性状表现好的植株13个，并用 分子技术检测这13株，最后获得聚合了 MDH、PEPC、CS基因的优良单株10个；将聚合了全 部目的基因的10个优良单株混合授粉，成熟后混収种子，即育成了新品系。实施例3:
(1)将MDH、PEPC、A-T基因分别导入紫花苜蓿3个不同单株，获得转MDH基因植株、转 PEPC基因植株和转A-T基因植株；
(2)将转MDH基因植株、转PEPC基因植株和转A-T基因植株种植在一处，开花时混合授 粉，种子成熟后混合収种，获得1代种子；又将1代种子种植在一处，开花时同样混合授粉， 种子成熟后混合収种，获得2代种子；上述复合杂交均设置隔离，以免外来花粉混杂和转基 因植株花粉外窜；
(3)将获得的2代种子种植于酸性土壤中，选择得到生长性状表现好的植株20个，并 用分子技术检测这20株，结果没有获得聚合了 MDH、PEPC、A-T基因的优良单株，但获得聚 合了 2个不同基因的植株12个；再将这12个植株种植在一处，开花时混合授粉，种子成熟 后混合収种，获得1代种子；又将1代种子种植在一处，开花时同样混合授粉，种子成熟后混 合収种，获得2代种子；上述复合杂交均设置隔离，以免外来花粉混杂和转基因植株花粉外 窜；将获得的2代种子种植于酸性土壤中，选择得到生长性状表现好的植株15个，并用分子 技术检测这15株，最后获得聚合了 MDH、PEPC、A-T基因的优良单株10个；将聚合了全部目 的基因的10个优良单株混合授粉，成熟后混収种子，即育成了新品系。实施例4:
(1)将A-T基因分别导入紫花苜蓿2个不同单株，获得转A-T基因的2个植株； (2MfRA-T基因的2个植株种植在一处，开花时混合授粉，种子成熟后混合収种，获得 1代种子；开花前设置隔离，以免外来花粉混杂和转基因植株花粉外窜；
(3)将获得的1代种子种植于酸性土壤中，选择得到生长性状表现好的植株20个，并用 分子技术检测这20株，最后获得聚合了 A-T基因的优良单株18个；将聚合了全部目的基因 的18个优良单株混合授粉，成熟后混収种子，即育成了新品系。实施例5:
(1)将A-T基因分别导入紫花苜蓿3个不同单株，获得转A-T基因的2个植株；
(2)将转A-T基因的2个植株种植在一处，开花时混合授粉，种子成熟后混合収种，获 得1代种子；又将1代种子种植在一处，开花时同样混合授粉，种子成熟后混合収种，获得2 代种子；再将2代种子种植在一处，开花时同样混合授粉，种子成熟后混合収种，获得3代种 子；上述复合杂交均设置隔离，以免外来花粉混杂和转基因植株花粉外窜；
(3)将获得的3代种子种植于酸性土壤中，选择得到生长性状表现好的植株12个，并用 分子技术检测这12株，结果获得聚合了 A-T基因的优良单株10个；将聚合了全部目的基因 的10个优良单株混合授粉，成熟后混収种子，即育成了新品系。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较 佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技 术方案进行参数范围内的修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其 均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种紫花苜蓿分子聚合育种方法，其特征在于，包括运用转基因技术获得紫花苜蓿 的不同单株、运用复合杂交技术进行1-3代繁育获得子代种子，以及运用依据逆境适应性 或性状表型的传统选择方法及分子检测技术选择聚合了全部目的基因的优良单株，并通过 混合选择法培育新品种三个步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体通过以下步骤实现(1)用常规转基因方法将目的基因导入紫花苜蓿的不同单株，获得相应的转基因单株；(2)运用复合杂交技术进行1-3代繁育获得子代种子将转基因单株种植在一处，开花时混合授粉，种子成熟后混合収种，获得1代种子；或 再将1代种子种植在一处，开花时同样混合授粉，种子成熟后混合収种，获得2代种子；或继 续将2代种子种植在一处，开花时同样混合授粉，种子成熟后混合収种，获得3代种子；上述 复合杂交均设置隔离，以免外来花粉混杂和转基因植株花粉外窜；(3)运用依据逆境适应性或性状表型的传统选择方法及分子检测技术选择聚合了全部 目的基因的优良单株，并通过混合选择法培育新品种对步骤2所得种子进行检测，如果检 测结果未见聚合了全部目的基因的优良单株，再返回步骤2，将聚合了比较多目的基因的优 良单株再进行复合杂交；最后将聚合了全部目的基因的优良单株混合授粉，成熟后混収种 子，即育成了新品系。
全文摘要
本发明公开了一种紫花苜蓿分子聚合育种方法，包括运用转基因技术获得转基因植株、运用复合杂交技术进行种子繁育，以及运用依据逆境适应性或性状表型的传统选择方法及分子检测技术选择聚合了全部目的基因的优良单株，并通过混合选择法培育新品种三个步骤，该方法把转基因技术与群体改良方法相结合，有利于多个目的基因聚合在一体的优良品种选育，可提高紫花苜蓿分子聚合育种效率。
文档编号A01K1/02GK102144570SQ20111010601
公开日2011年8月10日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者刘卢生, 李佺, 玉永雄, 甘智才, 胡艳, 马雪梅 申请人:西南大学, 重庆市茂泽科技有限公司