短雄花序板栗品种的分子育种方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子育种领域，具体地说，设及一种短雄花序板栗品种的分子育种方 法。
【背景技术】
[0002] 板栗在北京市山区林果生产中占据着十分重要的地位，2010年的统计资料显示， 板栗是最大栽培面积的树种，超过60万亩，产值达2. 2亿元，占干果总产值的40%。板栗雄 花序为柔美花序，正常雄花序长17cm左右，花量极大，其消耗树体水分及营养的20-40 %， 是栗树低产的重要原因之一。因此，培育短雄花序板栗品种在板栗生产中具有重要意义。
[0003] 在果树育种中，传统育种主要是根据植株在田间的表现进行评价与选择，但由于 受到环境影响，选择准确度不高，且大多数性状需要多年后才能观察到，选择周期长。随着 基因组学的飞速发展，植物分子育种在多种作物中得到应用研究，目前，鲜有板栗分子育种 实践的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是借助分子育种手段加速筛选出优质高产短雄花序板栗新品种。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的一种培育短雄花序板栗新品种的方法，包括W下 步骤：
[0006] 1)配置杂交组合拟板栗品种'黑山寨7号'作为母本，选择具有优异性状的板栗 种质资源作为父本，收集花粉对'黑山寨7号'进行授粉，授粉过程中，无需对'黑山寨7号' 去雄及套袋（由于板栗自交结实率低且'黑山寨7号'雄花序极短，花粉量少），杂交获得F1 代；
[0007] 2)构建杂交亲本的基因单倍型分子身份证：通过测序技术分析板栗MYB转录因 子基因在各杂交亲本间的序列差异，通过软件network(ht1:p: //www.fluxus-engineering. com/)构建各杂交亲本单倍型，W核屯、SNP作为鉴定杂交亲本的"分子身份证"；
[0008] 3)开发与板栗短雄花序性状相关的分子标记，具体过程如下：①人工分离群 体与自然群体中板栗雄花序发育生长过程的观察及长度鉴定；②利用二代测序技术如 RAD巧estriction site Associated DNA)开发新的分子标记，并利用分离群体与自然群 体进行连锁与关联分析验证新标记和SNP标记与板栗短雄花序长度的相关性；③根据W上 连锁分析及关联分析结果，将相关性极显著的SNP标记等作为筛选短雄花序性状的分子标 记；
[0009] 4)杂交苗的分子标记筛选：利用上述构建的杂交亲本的基因单倍型分子身份证 W及开发的与板栗短雄花序性状相关的分子标记，分别对F1代杂交苗进行分子标记筛选， 从而筛选到既具有纯合短雄花序基因又具有优异种质材料背景的杂交苗。
[0010] 前述的方法，步骤1)中所述的优异性状包括防寒、矮化、短枝、耐短截、防褐变、早 熟、大果等。
[0011] 前述的方法，步骤1)中可将收集到的具有不同优异性状的板栗种质资源的花粉 混合，对'黑山寨7号'进行开放式人工授粉（无需去雄套袋）。
[0012] 前述的方法，步骤2)中利用特异性PCR引物对I扩增各杂交亲本的MYB转录因子 基因，通过测序比较板栗MYB转录因子基因在各杂交亲本间的序列差异；所述引物对I为：
[0013] 1F:5' -AGGAGAGGCAGCGTTGGAGA-3'
[0014] 1R:5' -GGTCTGCAGCCCATCTGCTCAA-3'
[0015] 获得的核屯、SNP标记位于板栗肌B转录因子基因如SEQIDNo. 2所示的核巧酸序 列上，其中，Y为C或T，R为A或G，S为C或G，N代表缺失突变。
[0016] 前述的方法，步骤3)中用于PCR扩增所述与板栗短雄花序性状相关的分子标记的 特异性引物对II为：
[0017] 2F :5' -ACTTAGGCATTTAGCCATGTTTGG-3' 阳0化]2R:5' -CTCCCACGACCACGGAAC-3'
[0019] 步骤3)所述的SNP标记位于板栗如SEQIDNo. 1所示的核巧酸序列上，分别为 A28G、G51A、A52C、A124G、A138G、A169T和T202C。
[0020] 前述的方法，步骤1)中所述具有优异性状的板栗种质资源包括叶里藏、毛板栗、 信阳5号、拖桌早熟、孙家营7号、遵达、昨板栗、大油栗、毛蒲、留山10号、九龙早熟、高家早 熟、燕魅、昨县、中迟栗、暑处红、确罗32号、团结早熟、特早熟、遵玉、节节红、浅刺大板栗、 青扎、光山2号、孙家营4号、宜良早熟、大板红、固始4号、六月暴、红栗、林谓2号、下村、 下村1号、茅栗、羊毛栗、山东薄、屯月红、正义大毛栗、张庄子S号、软刺早、大乌壳、山东红 光、垂2、水富毛栗、宜良大板栗、罗山、油板栗、山东无花、南山4号、永平早熟、板优3号子 代、确山27号等。优选特早熟、大油栗、固始四号。
[0021] 前述的方法，构建的杂交亲本的基因单倍型分子身份证如下： 阳0。]父本为大油栗：5, -CGATAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGAACAGTWRG-3,
[0023]父本为特早熟：5' -TGACAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGRACAGTTGG-3'
[0024]父本为固始四号：5' -CRATAAGAACCGGGGAGGAGGAAGGGAACAGTWGG-3' 阳02引其中，W代表A或T，R代表A或G。
[00%] 本发明还提供与板栗短雄花序性状相关的SNP分子标记，利用北京百迈客生物科 技有限公司研发的SLAF-seq(Specific-Lo州SAmplifiedFragmentSequencin邑）技术对 板栗短雄花遗传分离群体进行关联分析，获得与板栗短雄花紧密关联的分子标记。具体过 程为：利用板栗基因组，通过bwa比对软件和GATK软件进行SNP识别。并对SNP进行过 滤。过滤方法如下：首先过滤read支持度小于3的位点，然后过滤子代混池中与相应亲本 的SNP类型差异的位点，最终得到高质量的可信SNP位点，并在此基础上识别两混池间差异 的位点。最终利用混池间差异的位点进行关联分析。经过W上步骤的分析，筛选出显著富 集关联位点的contig，其中，一个contig上在两混池间SNP位点，都与板栗短雄花表现出关 联，因此该contig有非常大的概率与性状关联，根据该contig序列设计引物开发出与板栗 短雄花序相关SNP分子标记。获得的与板栗短雄花序性状相关的SNP标记位于板栗如SEQ IDNo. 1 所示核巧酸序列上，分别为A28G、G51A、A52C、A124G、A138G、A169T和T202C。 [0027] 经传统育种手段培育的具有极短花序（长0. 3-1. 0厘米）的优系板栗品种'黑山 寨7号'已获得国家新品种保护，并且构建了W其为亲本之一的两个分离群体近500株。研 究认为，细胞程序性死亡相关基因等可能与板栗短雄花序发育有关。本发明人同源克隆到 板栗转录因子基因。将上述基因在'黑山寨7号'与其他正常雄花序品种中进行比较 发现了SNP位点，值得一提的是，MYB转录因子基因在'黑山寨7号'中为纯合，为筛选'黑 山寨7号'的杂交后代提供了便利。
[0028] 本发明利用分离群体和自然群体，通过连锁分析和关联分析的方法来开发分子标 记，通过分子标记辅助选择与常规育种手段相结合的方式，实现在杂种F1代中快速聚合板 栗短雄花序基因及其他优异基因的目的。
[0029] 本发明具有W下优点：
[0030] (一）本发明提供的培育短雄花序板栗新品种的方法为板栗分子育种实践研究提 供借鉴。
[0031] (二）本发明采用开放式人工授粉，减少了杂交劳动量，提高了杂交效率，能够获 得大量的杂种苗。
[0032](=)本发明亲本基因单倍型分子身份证的建立能够在杂种苗后代中选择出特定 父本的后代。
[0033](四）本发明提供的与短雄花序显著相关的分子标记能够在F1代筛选到具有短雄 花序基因的材料。
[0034](五）本方法经过两轮分子标记筛选，能够在F1代筛选到既具有短雄花序基因且 具有优异种质基因背景的杂种苗。
【附图说明】
[0035] 图1为本发明实施例2-4中培育短雄花序板栗新品种的技术路线图。
【具体实施方式】
[0036]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0037] 实施例1与板栗短雄花序性状相关的分子标记的开发
[0038] 利用北京百迈客生物科技有限公司研发的SLAF-seq(Specific-LocusAmplified 化agmentSequencing)技术对板栗短雄花遗传分离群体进行关联分析，获得与板栗短雄花 紧密关联的分子标记。具体过程为：利用板栗基因组，通过bwa比对软件和GATK软件进行 SNP识别。并对SNP进行过滤。过滤方法如下：首先过滤read支持度小于3的位点，然后过 滤子代混池中与相应亲本的SNP类型差异的位点，最终得到高质量的可信SNP位点，并在此 基础上识别两混池间差异的位点。最终利用混池间差异的位点进行关联分析。经过W上步 骤的分析，筛选出显著富集关联位点的contig，其中，一个contig上在两混池间SNP位点， 都与板栗短雄花表现出关联，因此该contig有非常大的概率与性状关联，根据该contig序 列设计引物开发出与板栗短雄花序相关分子标记。
[0039] 用于PCR扩增所述与板栗短雄花序性状相关的SNP分子标记的特异性引物对II 如下：
[0040] 2F:5' -ACTTAGGCATTTAGCCATGTTTGG-3'
[0041] 2R:5' -CTCCCACGACCACGGAAC-3'
[0042] 获得的与板栗短雄花序性状相关的SNP标记位于板栗如SEQ ID No. 1所示核巧酸 序列上，分别为A28G、G51A、A52C、A1