专利名称：一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法， 专用于小菘菜游离小孢子培养。
背景技术：
小菘菜(Brassica campestris var. peruviridis)系十字花科二年生草本植物， 为不结球白菜的一个变种。原产亚洲，经日本系统改良形成具有独特风味的品种。以幼嫩的植株供食用，品质柔嫩，味道鲜美，经烹调后色泽翠绿，营养价格高，超过绿叶菜之首的菠菜，并且具有防癌的保健功能。在日本市场周年供应，成为销售量最大的蔬菜品种之一。我国宁波市2002年开始大面积种植，目前已成为宁波市出口日本的主要创汇蔬菜品种之一。 小菘菜为异花授粉植物，在育种上获得一个纯系需要5 6年的时间，而游离小孢子培养可以在1 2年获得双单倍体植株，大大节省纯化时间和工作量。除此之外，小孢子还是一种优良的转化受体，它具备了单细胞和单倍体两个特性，不会获得杂合体或嵌合体，因此也是突变体筛选和基因工程研究的理想材料。我国游离小孢子培养的起步较晚，但最近几年，对不结球白菜的游离小孢子培养已取得了较大的进展，李岩等(1993)、卢钢等(2001)、蒋武生等Q005)和耿建峰等Q007) 均获得了不结球白菜小孢子再生植株，并对影响培养的各种因素进行了分析，但小菘菜的游离小孢子培养未见过报道，冯辉O007)曾利用花药培养获得了小菘菜的再生植株，但是花药离体培养容易受到花药壁、药隔等二倍体细胞的干扰，后期检测程序复杂，而小孢子已是单倍体细胞，具有花药培养所不具备的单细胞单倍性、不受体细胞干扰、便于遗传操作等优点，但是游离小孢子培养受基因型的影响很大，而且小菘菜的游离小孢子培养出胚率很低，所以本发明旨在建立稳定高频的小菘菜游离小孢子胚胎发生体系。
发明内容
本发明目的在于针对上述现有技术中小菘菜游离小孢子存在的培养效率低的问题，提供一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，选取小菘菜单核靠边期的花蕾， 消毒后分离纯化出小孢子，将纯化后的小孢子悬浮于高糖培养基中，调整小孢子的密度达到1 X IO5 1 X IO6个/ml，置于33°C _:35°C下黑暗处理12h_Mh，离心弃上清后，加入低糖培养基，获得小孢子悬浮液；其中，所述的高糖培养基是在1/2NLN培养基中加入15% -17% 蔗糖及0. 8mg/L-l. Omg/L秋水仙碱，再经0. 22 μ m的微孔滤膜抽滤灭菌所得，pH为6. 0 ； 所述的低糖培养基是在1/2NLN培养基加入10 13%蔗糖及0. 5 0. 8g/L活性炭，再经 0.22 um的微孔滤膜抽滤灭菌所得，pH为6. 0。所述的小孢子悬浮于高糖培养基后优选于33°C黑暗处理Mh。所述的小菘菜单核靠边期的花蕾长度为2. Omm-3. 0mm，外观特征为花瓣、花药长度比为1/2 4/5。消毒前将选取的适宜花蕾保湿并置于4°C冰箱中处理Mh。所述的消毒是将花蕾用75 %的酒精消毒30s，然后用质量比为0. 1 %的HgCl2消毒 6min,最后用无菌水冲洗3次待用。所述的分离纯化小孢子是将消毒后的花蕾置于研钵中，加入小孢子提取液，采用挤压法使小孢子游离出来，然后用400目滤网过滤，将滤液收集于离心管，SOOrpm离心 5min，弃上清液，重复3次；所述的小孢子提取液为小孢子提取液为加入10 13%蔗糖的 B5基本培养基，pH为5.8。所述的离心条件是800rpm-1000rpm离心5min_7min。所述的小孢子悬浮液于黑暗处理10d-14d后即可出现肉眼可见的胚状体，将其置于振荡培养箱中培养，当出现子叶型胚后立即放于光照下转绿，然后接到分化培养基上继代进而形成再生植株。所述的分化培养基是在&基本培养基中加入10 13%蔗糖、0. 1 0.3mg/L 6-BA、0. 01 0. 03mg/LNAA、0. 6 0. 9%琼脂以及 0. 4 0. 7g/L 活性炭所得，pH 为 5. 8。本发明方法中培养基的灭菌条件均为121°C，1. IMpa条件下灭菌20分钟。有益效果本发明提供了一种促进小菘菜游离小孢子培养胚胎发生的方法，培养的小孢子获得了再生植株。通过本发明改良后的小孢子培养(IMC)方法，使对常规培养没有反应的小菘菜品种产生了胚状体，诱导基因型成功率达到60% ；除此之外，还使可出胚的小菘菜品种的成胚率有了很大的提高，从0. 4个/花蕾提高到1. 3个/花蕾，提高了 3. 25倍。
具体实施例方式实施例1提高小菘菜游离小孢子培养胚胎诱导率的方法，包括1 基因型=NHCC 秋-631 ；NHCC 秋-632 ；NHCC 秋-634 ；NHCC 秋-635 ；NHCC 秋-636。2培养基的配置及灭菌基本培养基为大量元素减半的NLN培养基，即1/2NLN培养基；①高糖培养基(1/2NLN-17):1/2NLN+17% 蔗糖 +0. 8mg/L 秋水仙碱 pH 为 6. 0 ；②低糖培养基(1/2NLN-13):1/2NLN+13% 蔗糖 +0. 8g/L 活性炭 pH 为 6. 0 ；以上培养基用0. 22 μ m的微孔滤膜抽滤灭菌。③小孢子提取液(B5-13培养基)=B5基本培养基+13%蔗糖，pH为5. 8 ；④分化培养基 基本培养基+13%蔗糖+0. 2mg/L 6-BA+O. 02mg/L ΝΑΑ+0. 8%琼脂+0. 5g/L活性炭，pH为5.8 ；以上小孢子提取液和分化培养基于121°C，1. IMpa条件下灭菌20分钟。3取材2011年1月选取长度为2 3mm的花蕾，将花蕾保湿置于4°C冰箱中保存 24h。4消毒选取的花蕾用75%的酒精消毒30s，然后用质量比为0. 的HgCl2消毒 6min，最后用无菌水冲洗3次待用；
5小孢子分离与纯化将消毒后的花蕾置于研钵中，加小孢子提取液(B5-13)，采用挤压法使小孢子游离出来，然后用400目滤网过滤，将滤液收集于离心管，SOOrpm离心 5min，弃上清液，重复3次；6将纯化后的小孢子悬浮于两种不同的预处理培养基中①低糖培养基(含13% 蔗糖的1/2NLN培养基)；②高糖培养基(含17%蔗糖及0.8mg/L秋水仙碱的1/2NLN培养基)分别进行低糖处理和高糖、秋水仙碱处理，利用血球计数板调整小孢子的密度达到 1 X 10"个 /ml ；7高温诱导将上述小孢子悬浮液置于33°C高温下黑暗处理Mh ；8换培养基将上述小孢子悬浮液SOOrpm离心5min弃上清后，加入低糖培养基 (1/2NLN-13液体培养基)，获得小孢子悬浮液；9胚状体形成及植株再生25°C黑暗处理2周后即可出现肉眼可见的胚状体，将其置于振荡培养箱中培养，当出现子叶型胚后立即放于光照下转绿，然后接到分化培养基上继代进而形成再生植株。实施结果如下表1结果表明，五种基因型的小菘菜对常规培养即低糖处理没有反应，出胚率为 0，而经过高糖及秋水仙碱处理后，有三种基因型可诱导出胚，诱导基因型成功率达到60%， 其中NHCC秋-631平均出胚3. 7个/蕾，NHCC秋-635平均出胚1. 3个/蕾，NHCC秋-636 平均出胚4.3个/蕾。表1五种基因型两种培养方式的出胚对比情况
权利要求
1.一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于选取小菘菜单核靠边期的花蕾，消毒后分离纯化出小孢子，将纯化后的小孢子悬浮于高糖培养基中，调整小孢子的密度达到1 X IO5 1 X IO6个/ml，置于33°C 下黑暗处理12h Mh，离心弃上清后， 加入低糖培养基，获得小孢子悬浮液；其中，所述的高糖培养基是在1/2NLN培养基中加入 15% 17%蔗糖及0. 8mg/L 1. Omg/L秋水仙碱，再经0. 22 μ m的微孔滤膜抽滤灭菌所得， PH为6. 0 ；所述的低糖培养基是在1/2NLN培养基加入10 13%蔗糖及0. 5 0. 8g/L活性炭，再经0. 22 μ m的微孔滤膜抽滤灭菌所得，pH为6. 0。
2.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于小孢子悬浮于高糖培养基后于33°C黑暗处理Mh。
3.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的小菘菜单核靠边期的花蕾长度为2. Omm 3. 0mm。
4.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于消毒前将选取的适宜花蕾保湿并置于4°C冰箱中处理Mh。
5.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的消毒是将花蕾用75%的酒精消毒30s，然后用质量比为0. 1 %的HgCl2消毒6min，最后用无菌水冲洗3次待用。
6.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的分离纯化小孢子是将消毒后的花蕾置于研钵中，加入小孢子提取液，采用挤压法使小孢子游离出来，然后用400目滤网过滤，将滤液收集于离心管，SOOrpm离心5min，弃上清液，重复3次；所述的小孢子提取液为加入10 13%蔗糖的B5基本培养基，pH为5. 8。
7.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的离心条件是800rpm IOOOrpm离心5min 7min。
8.根据权利要求1所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的小孢子悬浮液于黑暗处理IOd 14d后即可出现肉眼可见的胚状体，将其置于振荡培养箱中培养，当出现子叶型胚后立即放于光照下转绿，然后接到分化培养基上继代进而形成再生植株。
9.根据权利要求8所述的提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于所述的分化培养基是在B5基本培养基中加入10 13%蔗糖、0. 1 0. 3mg/L 6 BA、0. 01 0. 03mg/LNAA、0. 6 0. 9%琼脂以及0. 4 0. 7g/L活性炭，灭菌所得，pH为5. 8。
全文摘要
本发明公开了一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法。一种提高小菘菜游离小孢子胚胎发生率的方法，选取小菘菜单核靠边期的花蕾，消毒后分离纯化出小孢子，将纯化后的小孢子悬浮于高糖培养基中，调整小孢子的密度达到1×105～1×106个/ml，置于33℃-35℃下黑暗处理12h-24h，离心弃上清后，加入低糖培养基，获得小孢子悬浮液。小孢子悬浮液于黑暗处理10d-14d后即可出现肉眼可见的胚状体，将其置于振荡培养箱中培养，出现子叶型胚后立即放于光照下转绿，然后接到分化培养基上继代进而形成再生植株。通过本发明改良后的小孢子培养方法，使对常规培养没有反应的小菘菜品种产生了胚状体，诱导基因型成功率达到60％。
文档编号A01H4/00GK102349443SQ20111020193
公开日2012年2月15日 申请日期2011年7月19日 优先权日2011年7月19日
发明者于文佳, 侯喜林 申请人:南京农业大学