专利名称：一种尤加利提取物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种天然植物提取物，特指一种尤加利(桉树Eucalyptus)提取物及其在医药领域中的应用，本发明的尤加利提取物能有效提高院内感染的重要病原菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对苯唑西林的敏感性，这是本发明的技术重点(创新点)； 本发明的有加利提取物的作用机制在于，抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的肽聚糖合成酶 PBP2’ (penicillin-binding protein2')的产生，并且，本发明的尤加利提取物在医药领域中可应用于对院内感染菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的消毒，杀菌，从而有效防止临床上因MRSA引起的感染。
背景技术：
金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌，自从本世纪40年代青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制，但随着青霉素的广泛使用，有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解β-内酰胺环，表现为对青霉素的耐药；因而人们又研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林(methicillin)，1959年应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感染，可1961年，英国的Jevons就首次发现了而押氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)，MRSA从发现至今感染几乎遍及全球，已成为院内感染的重要病原菌之一，因此，开展对降低MRSA的耐药性的研究与开发，对于控制医院内感染的流行，指导临床治疗有着十分重要的意义。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是引起医院内获得性感染得多重耐药菌，在第一个耐青霉素酶的β内酰胺类抗生素甲氧西林应用于临床不久，1961年便在英国发现了世界首例甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)；从此，MRSA逐渐成为全世界医院内获得性感染的主要病因，目前，在许多国家耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的感染率仍在增长， 据美国疾病控制和预防中心(⑶C)统计，世界每年约有100，000人感染MRSA，并逐渐扩展到社区，引起社区获得性感染的流行，与艾滋病、病毒性乙型肝炎并列成为世界三大感染性疾病，因其携带多种毒素，感染更强，破坏性更大，严重威胁着人类的健康;MRSA 几乎对所有β-内酰胺类抗生素耐药，对其它临床常用的抗生素，如红霉素、四环素也耐药，近年来由于头孢菌素的广泛应用，选择压力较大，耐药性也在不断增加；其有效治疗药物主要为糖肽类抗生素，如万古霉素和替考拉宁，2002年美国发现第一例耐万古霉素 ^^11^ (VRSA Vancomycin resistant Staphylococcus aureus), MRSA ^Sft 耐药性，导致临床上可选用药非常有限，从而造成治疗上的困难，所以，降低MRSA的耐药性研究对于正确治疗因MRSA引起的感染、防止其播散有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种尤加利提取物及其在医药领域中，能有效降低院内感染的重要病原菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对苯唑西林的耐药性，苯唑西林(Oxacillin)为耐青霉素酶青霉素，对产青霉素酶葡萄球菌具有良好抗菌活性，苯唑西林通过抑制细菌细胞壁合成而发挥杀菌作用，而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对苯唑西林具有耐药性的特性，因此本发明开发了 2种可有效降低耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)对苯唑西林的耐性的尤加利提取物。所述的一种尤加利提取物，采用如下方法制备 1.尤加利乙醇提取物
尤加利叶子清洗干净之后，剪切，烘干，用无水乙醇浸泡提取，尤加利与乙醇质量比例为1 :9，浸泡提取时间为48小时，过滤后将滤液利用旋转蒸发仪蒸发掉无水乙醇后得到尤加利乙醇提取物。2.尤加利水提取物
尤加利叶子清洗干净之后，剪切，烘干，用蒸馏水浸泡加热提取，尤加利与蒸馏水质量比例为1:9，加热温度为100°C (煮沸)，加热时间为1小时，将热水提取物过滤后，使用过滤灭菌法将滤液灭菌后，得到质量浓度为10%的尤加利水提取物。本发明的尤加利提取物对各种院内感染病原菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的有效抗菌浓度范围是，尤力口利乙醇提取物为0. 2%-0. 5% (质量百分浓度)，所述浓度是以尤加利乙醇提取物的重量/尤加利乙醇提取物的重量+药物的基准重量；尤加利水提取物为0. 5% (质量百分浓度)，所述浓度是以尤加利水提取物的重量/尤加利水提取物的重量+药物的基准重量，尤加利乙醇提取物与苯唑西林并用显示协同效果时，尤加利乙醇提取物的浓度范围为0. 02%-0. 05%(质量百分浓度)，所述浓度是以尤加利乙醇提取物的重量/尤加利乙醇提取物的重量+药物的基准重量+苯唑西林的重量；尤加利水提取物与苯唑西林并用显示协同效果时，尤加利水提取物的浓度范围为0. 05%-0. 1% (质量百分浓度)，所述浓度是以尤加利水提取物的重量/ 尤加利水提取物的重量+药物的基准重量+苯唑西林的重量，关于苯唑西林的有效浓度以及药物的基准重量，药典里早已规定，应用时需要按照药典执行。本发明的天然植物尤加利(桉树Eucalyptus)的乙醇提取物与水提取物不仅对各种等典型的食源性病原菌具有良好的抗菌效果，而且可有效降低耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林的耐性，从而提高苯唑西林的抗菌活性，本发明产品尤加利提取物可应用于医药领域中针对院内感染菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的消毒，杀菌，从而有效防止临床上因MRSA引起的感染。
图1尤加利提取物对各种MRSA的苯唑西林的MIC的影响；
图2尤加利乙醇提取物与苯唑西林对MRSA 11D1677的残存菌数的影响； 图3尤加利乙醇提取物与苯唑西林对MRSA No. 38的残存菌数的影响。
具体实施例方式实施例1
尤加利提取物对各种食源性病原菌的抗菌活性试验 (1)实验菌(食源性病原菌)大肠杆菌-.Escherichia coli IFO ； 金黄色葡萄球菌-.Staphyloccocus aureus ； ^!"11 -.Salmonella Enteritidis ； 枯草芽抱杆菌-.Bacillus cereus ； 枯草杆菌-.Bacillus subtil is ； 单核细胞增生李斯特菌-.Listeria monocytogenes ； 肉毒梭状芽孢杆菌-.Clostridium botuHnum ； 副溶血性弧菌Vibrio parahemolyticus。 (2)实验方法
在无菌的培养皿里添加30mL的无菌NA培养基与尤加利乙醇提取物或尤加利水提取物，使得尤加利乙醇提取物或尤加利水提取物的质量百分浓度分别为0.0596，0. 1%, 0.2%， 0.5%，1.0%，尤加利乙醇提取物的浓度是以尤加利乙醇提取物的重量/尤加利乙醇提取物的重量+无菌NA培养基的重量，尤加利水提取物的浓度是以尤加利水提取物的重量/尤加利水提取物的重量+无菌NA培养基的重量；培养基与尤加利提取物充分混合之后，放置，使培养基凝固；培养基凝固后，用接种环划线接种法接种各种前培养的食源性病原菌；已接种的培养基放在35°C的恒温箱里静止培养M-48小时，单核细胞增生李斯特菌要在30°C中培养，并测定最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentrations MIC)；最小抑菌浓度定为用肉眼看不出细菌繁殖的，即培养基中没有观察到菌落的，最小添加浓度。(3)结果
本发明的尤加利提取物对所有实验菌株显示了良好的抑菌效果如表1所示，尤加利乙醇提取物对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，枯草杆菌，单核细胞增生李斯特菌，肉毒梭状芽孢杆菌，大肠杆菌，沙门氏菌等食源性病原菌的最小抑菌浓度为0. 1%-0. 5%。尤加利水提取物对各种食源性病原菌的最小抑菌浓度为0. 2%-1. 0%。表1尤加利提取物对各种食源性病原菌的抗菌效果实施例2
尤加利提取物对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的抗菌活性试验
(1)实验菌
而才甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)
①MRSANo. 11 ；
②MRSA No. 19 ；
③MRSA No. 23 ；
④MRSA No. 36 ；
⑤MRSA No. 38 ；
⑥MRSA B-26 ；
⑦MRSA 11D1677。
(2)实验方法
在无菌的培养皿里添加无菌的含4% NaCl的Muller-Hinton琼脂培养基与尤加利乙醇提取物或尤加利水提取物，使得尤加利乙醇提取物或尤加利水提取物的质量百分浓度分别为的浓度为0.0596，0. 1%, 0. 2%, 0. 5%, 1. 0%，尤加利乙醇提取物的浓度是以尤加利乙醇提取物的重量/尤加利乙醇提取物的重量+琼脂培养基的重量，尤加利水提取物的浓度是以尤加利水提取物的重量/尤加利水提取物的重量+琼脂培养基的重量；培养基与尤加利提取物充分混合之后，放置，使培养基凝固；培养基凝固后，用接种环划线接种法接种各种前培养的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)，已接种的培养基放在35°C的恒温箱里静止培养48小时，并测定最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentrations MIC)，最小抑菌浓度定为用肉眼看不出细菌繁殖的，即培养基中没有观察到菌落的，最小添加浓度。(3)结果
本发明的尤加利提取物对7种院内感染病原菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)显示了良好的抑菌效果如表 2所示，尤加利乙醇提取物对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的最小抑菌浓度为 0. 2%-0. 5%。尤加利水提取物对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的最小抑菌浓度为 0. 5%ο表2尤加利提取物对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性
提取滔剤最小抑菌浓度MIC(%)IMRSANo. 11NoJPNo. 23 No. 36 . Ho. 38B-26IiD1677ZM0.20.20.2 0.2 . 0.20.50.2水0.50.50,5 0.5 0.50.50.5
实施例3
青霉素类抗生素苯唑西林对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的抗菌活性试验
(1)实验菌
而才甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)
①MRSA No. 11 ；
②MRSA No. 19 ；
③MRSA No. 23 ；
④MRSA No. 36 ；
⑤MRSA No. 38 ；
⑥MRSA B-26 ；
⑦MRSA 11D1677。
(2)实验方法
苯唑西林钠一水合物(Oxacillin Sodium Salt Monohydrate ；分子量C19H18N3NaO5S. H20=423. 42 )用蒸馏水溶解，溶解浓度为10，OOOppm,苯唑西林钠一水合物溶液利用过滤灭菌法灭菌之后用于抗菌实验，在无菌的培养皿里添加无菌的含4% NaCl的Muller-Hinton 琼脂培养基与苯唑西林钠溶液，使苯唑西林的浓度为31. 3ppm，62. 5ppm, 125ppm,250ppm, 500ppm,苯唑西林钠的浓度是以苯唑西林钠一水合物的重量/苯唑西林钠一水合物的重量+琼脂培养基培养基的重量，与苯唑西林溶液钠充分混合之后，放置，使培养基凝固，培养基凝固后，用接种环划线接种法接种各种前培养的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)，已接种的培养基放在35°C 的恒温箱里静止培养48小时，并测定最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentrations MIC)。最小抑菌浓度定为用肉眼看不出细菌繁殖的，即培养基中没有观察到菌落的，最小添加浓度。(3)结果
本实验测定了苯唑西林对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的抑菌效果如表3所示，苯唑西林对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌浓度范围是62.5ppm-250ppm。根据美国临床实验室标准化委员 (national committee for clinical laboratory standards, NCCLS) f/KJiII, ^R^Hf# MIC^4yg/ ml (4ppm)为耐药，即所有的实验菌对苯唑西林均显示了很强的耐药性。表3苯唑西林对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性实施例4
尤加利提取物对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的苯唑西林的MIC的影响试验
(1)实验菌
而才甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)
①MRSANo. 11 ；
②MRSA No. 19 ；
③MRSA No. 23 ；
④MRSA No. 36 ；
⑤MRSA No. 38 ；
⑥MRSA B-26 ；
⑦MRSA 11D1677。
(2)实验方法
苯唑西林钠一水合物(Oxacillin Sodium Salt Monohydrate ；分子量C19H18N3NaO5S. H20=423. 42 )用蒸馏水溶解，溶解浓度为10，OOOppm，苯唑西林溶液利用过滤灭菌法灭菌之后用于抗菌实验，在无菌的培养皿里添加无菌的含4% NaCl的Muller-Hinton琼脂培养基之后，添加苯唑西林钠溶液，使苯唑西林钠的浓度为3. 9ppm，7. 8ppm, 15. 6ppm, 31. 3ppm, 62. 5ppm, 125ppm, 250ppm,再分别添加0. 02%的尤加利乙醇提取物与0. 1%的尤加利水提取物，苯唑西林钠的浓度的计算方式同实施例3，尤加利乙醇提取物和尤加利水提取物的浓度的计算方式同实施例1，培养基与苯唑西林溶液，尤加利提取物充分混合之后，放置，使培养基凝固。培养基凝固后，用接种环划线接种法接种各种前培养的耐甲氧西林金 11^ (methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)。 禾中白勺: 养基放在35°C的恒温箱里静止培养48小时，并测定最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentrations MIC)。最小抑菌浓度定为用肉眼看不出细菌繁殖的，即培养基中没有观察到菌落的，最小添加浓度。(3)结果
如图1所示，苯唑西林对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度范围是 62. 5ppm-250ppm,而添加0. 02%的尤加利乙醇提取物之后，苯唑西林对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度范围减小至7. 8ppm-31. 3ppm，添加0. 1%的尤加利水提取物之后，苯唑西林对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度范围，除了实验菌株 MRSA No. 16之外，减小至7. 8ppm，而MRSA No. 16的最小抑菌浓度从250ppm减小至62. 5ppm, 以上结果，充分证明尤加利乙醇提取物与水提取物明显增强苯唑西林对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性，二者显示了良好的协同效果。实施例5
利用FICindex法测定尤加利提取物与苯唑西林对各种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的协同效应
(1)实验菌
而才甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)
①MRSA No. 11 ；
②MRSA No. 19 ；
③MRSA No. 23 ；
④MRSA No. 36 ；
⑤MRSA No. 38 ；
⑥MRSA B-26 ；
⑦MRSA 11D1677。
(2)实验方法
苯唑西林钠一水合物(Oxacillin Sodium Salt Monohydrate ；分子量C19H18N3NaO5S. H20=423. 42 )用蒸馏水溶解，溶解浓度为10，OOOppm，苯唑西林钠溶液利用过滤灭菌法灭菌之后用于抗菌实验。在无菌的培养皿里添加无菌的含4% NaCl的Muller-Hinton琼脂培养基之后，添加苯唑西林溶液，使苯唑西林的浓度为3. 9ppm，7. 8ppm, 15. 6ppm, 31. 3ppm, 62. 5ppm, 125ppm, 250ppm,再分别添加0. 02%的尤加利乙醇提取物与0. 1%的尤加利水提取物，苯唑西林钠的浓度的计算方式同实施例3，尤加利乙醇提取物和尤加利水提取物的浓度的计算方式同实施例1，培养基与苯唑西林溶液，尤加利提取物充分混合之后，放置，使培养基凝固，培养基凝固后，用接种环划线接种法接种各种前培养的耐甲氧西林金 11^ (methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA), B^ft W^ 1 养基放在35°C的恒温箱里静止培养48小时，并测定最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentrations MIC)。最小抑菌浓度定为用肉眼看不出细菌繁殖的，即培养基中没有观察到菌落的，最小添加浓度。尤加利提取物与苯唑西林的协同效果利用测定分级抑制浓度指数[fractional inhibitory concentration (FIC) index]法来进行评价，分级抑制浓度指数是根据琼脂棋盘稀释法定量判断不同浓度组合药物联用后对受试菌的最低抑菌浓度来计算分级抑制浓度FIC指数，协同效果的评价标准是FICindex ^ 0.5时，判断为协同效果；0. 权利要求
1.一种尤加利提取物，采用如下方法制备尤加利叶子清洗干净之后，剪切，烘干，用无水乙醇浸泡提取，尤加利与乙醇质量比例为1 :9，浸泡提取时间为48小时，过滤后将滤液利用旋转蒸发仪蒸发掉无水乙醇后得到尤加利乙醇提取物。
2.一种尤加利提取物，采用如下方法制备尤加利叶子清洗干净之后，剪切，烘干，用蒸馏水浸泡加热提取，尤加利与蒸馏水质量比例为1 :9，加热温度为100°C，加热时间为 1小时，将热水提取物过滤后，使用过滤灭菌法将滤液灭菌后，得到质量浓度为10%的尤加利水提取物。
3.如权利要求1所述的一种尤加利提取物在制备抗食源性病原菌药物中的应用。
4.如权利要求2所述的一种尤加利提取物在制备抗食源性病原菌药物中的应用。
5.如权利要求3或4所述的一种尤加利提取物在制备抗食源性病原菌药物中的应用， 其特征在于所述食源性病原菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、枯草杆菌、单核细胞增生李斯特菌、肉毒梭状芽孢杆菌或副溶血性弧菌。
6.如权利要求3所述的一种尤加利提取物在制备抗食源性病原菌药物中的应用，其特征在于所述尤加利提取物食源性病原菌的最小抑菌浓度为0. 1%-0. 5%，所述浓度是以尤加利提取物的重量/尤加利提取物的重量+药物基准重量。
7.如权利要求4所述的一种尤加利提取物在制备抗食源性病原菌药物中的应用，其特征在于所述尤加利提取物对食源性病原菌的最小抑菌浓度为0. 2%-1. 0%，所述浓度是以尤加利提取物的重量/尤加利提取物的重量+药物基准重量。
8.如权利要求1所述的一种尤加利提取物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)药物中的应用。
9.如权利要求2所述的一种尤加利提取物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)药物中的应用。
10.如权利要求8所述的一种尤加利提取物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)药物中的应用，其特征在于所述尤加利提取物对MRSA的有效抗菌浓度范围为 0. 2%-0. 5% (质量百分浓度)，所述浓度是以尤加利乙醇提取物的重量/尤加利乙醇提取物的重量+药物的基准重量；所述尤加利提取物与苯唑西林并用显示协同效果时，尤加利提取物对MRSA的的有效抗菌浓度范围为0. 02%-0. 05% (质量百分浓度)，所述浓度是以尤加利提取物的重量/尤加利提取物的重量+药物的基准重量+苯唑西林的重量。
11.如权利要求9所述的一种尤加利提取物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)药物中的应用，其特征在于所述尤加利提取物对MRSA的有效抗菌浓度为0. 5% (质量百分浓度)，所述浓度是以尤加利水提取物的重量/尤加利水提取物的重量+药物的基准重量；所述尤加利提取物与苯唑西林并用显示协同效果时，尤加利提取物对MRSA的有效抗菌浓度范围为0. 05%-0. 1%(质量百分浓度)，所述浓度是以尤加利提取物的重量/尤加利提取物的重量+药物的基准重量+苯唑西林的重量。
全文摘要
本发明涉及一种天然植物提取物，特指一种尤加利(桉树:Eucalyptus)提取物及其在医药领域中的应用，所述提取物能有效提高院内感染的重要病原菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林等青霉素类抗生素的敏感性。本发明的尤加利提取物不仅对各种等典型的食源性病原菌具有良好的抗菌效果，而且可有效降低耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对苯唑西林的耐药性，从而提高苯唑西林的抗菌活性。本发明产品尤加利提取物可应用于医药领域中针对院内感染菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的消毒，杀菌，从而有效防止临床上因MRSA引起的感染。
文档编号A01P1/00GK102396563SQ20111028172
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者崔海英, 林琳 申请人:江苏大学