专利名称：玉米干旱诱导型启动子及活性分析的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种来源于玉米干旱应答蛋白基因CKS2 并在植物中高度表达的干旱诱导型启动子序列、含有该启动子序列的植物干旱诱导型表达载体，以及应用该启动子生产转基因植物。
背景技术：
逆境胁迫是目前农业生产中影响粮食产量最重要的因素和挑战之一。土壤退化、 淡水匮乏、气候(象)多变等因素导致扣除零产出的荒芜、盐碱、滩涂地(15亿亩以上)夕卜， 每年直接由盐碱、干旱、低温等逆境胁迫造成的农作物减产仍超过总产的20%左右。在这些严重影响农作物生产的逆境因子中，干旱和盐胁迫是最主要的因素。据统计，全国每年有7 亿亩农田受旱灾威胁，干旱所造成的损失几乎是其它自然灾害所造成损失的总和。特别是担负我国粮食生产任务65%以上的华北、东北和西北，恰恰是我国最缺水和最干旱的地区。解决粮食生产中严重的多元逆境胁迫问题，提高其产量，除了常规育种技术以外， 基于基因遗传转化的生物育种技术是一个重要的选择。通过转基因技术提高作物抗逆性是有效应对逆境挑战的根本途径，而分离、克隆抗逆关键基因是解决这一重要问题的核心与关键，克隆和组建逆境诱导型启动子是进行多抗基因转化实现分子育种目标的重要保障。 目前，从实践上应用的启动子来看，仍以CaMV35S、玉米WDiquitin promoter等组成型表达启动子为主，而且多为天然分离DNA片段的直接应用，无法实现高效、可控和特异(定点、定时、定量)的调控，而且由35S启动的基因过表达会使转基因植物表型产生一些负面效应， 如矮化等。因此克隆并应用胁迫诱导型启动子来启动抗逆基因的表达，在提高植物的抗性方面具有重要作用。目前，许多学者对逆境胁迫诱导型启动子进行了研究。如rd29A启动子是缺水等逆境诱导启动子。Kasuga等用组成型的CaMV 35S启动子和rd29A启动子分别驱动DREBlA 基因转化拟南芥(Kasuga M，Liu Q,Miura S，，1999)。CaMV 35S启动子驱动的DREBlA基因的过量表达激活了许多其他耐胁迫基因的表达，例如rc^9A、Kin l、Cor6.6等。转基因植株都比非转基因植株的抗旱、抗盐、抗冻能力显著提高。但是，过量表达DREBlA基因也导致了植株在正常生长条件下生长迟缓；与之相反，由胁迫诱导型启动子rd29A驱动的基因表达不仅使植株有更强的胁迫耐受力还对其生长有着最小的负面影响。0sABA2基因编码玉米黄质环氧化酶，该基因启动子含有一个MYBR元件和5个MYCR元件，表明它的表达与ABA响应诱导有关。Rai等用0sABA2基因启动子与GUS构建的表达载体转化玉米，实验表明在没有胁迫的条件下，由0sABA2基因启动子驱动的的转基因株系的GUS活性要比由Actl驱动的对照组低得多(feii M，He CK，2009)。缺水处理后，叶片中由0sABA2基因启动子驱动的⑶S 的表达量是无缺水处理对照组的5倍；而由Actl启动子驱动的对照组GUS的表达量没有任何增加。corlfe基因启动子具有低温诱导表达的特性，朱青等从拟南芥Columbia生态型的基因组中扩增出corlfe基因的启动子片段，将其插入pBI121的⑶S基因和NOS终止子上游构成表达载体PLB，获得转化株。⑶S组织染色结果表明，经过低温处理的转基因马铃薯的叶片均表达了⑶S产物，而没有经过低温处理的转基因马铃薯及非转基因植株则检测不到⑶S活性(朱青，宋波涛等，2004)。Rrandl等分析了大豆Gmhspl7. 32B热诱导启动子在转基因烟草中的调节作用，并在转基因植物的种子上测得GUS活性，发现该启动子具有一段热诱导因子(HSE)的同功序列。杜鹃等从小麦中克隆了 mWCS120启动子，构建了诱导型瞬时表达质粒pmw-GUS，用pmw-GUS转化玉米愈伤组织和烟草叶片证明，mwcsl20启动子在单子叶和双子叶植物中均可受低温等逆境诱导，可以用于驱动结构基因的表达(杜娟， 朱祯，李晚忱，2005)。Nazmul等分离了 1. 6kb的AmCMO基因上游启动子片段，5'端缺失分析发现，翻译起始点上游410bp片段中含有盐胁迫响应序列，300mmol/L NaCl处理24h后， ⑶S活性显著提高，AmCMO基因上游410bp片段可以作为盐诱导启动子(Nazmul HB, Akira H, Nana Y,2007)。利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在转基因植物中表达是培育抗逆作物新品种的有效方法。目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少，对于新的抗逆相关启动子的发现、克隆、顺式作用元件分析以及与顺式元件相互作用的转录因子的研究仍然是今后研究的重点，将功能明确的抗逆启动子成功应用到转基因植物中调控抗逆基因的表达是植物抗逆基因工程的一个重要研究方向。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种干旱诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目标基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米干旱应答蛋白基因CKS2。本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的干旱诱导型启动子载体，该载体指导高水平表达目标基因的干旱诱导型启动子序列和5’非翻译区。本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因植物。该转基因植物能反映启动子诱导活性的高低。为实现上述目的，本发明克隆了玉米干旱应答蛋白基因CKS2的干旱诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有玉米干旱应答蛋白基因CKS2的5’ 非翻译区的上述启动子。本发明提供一种获得的玉米干旱诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的-Ibp至-1444bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，干旱可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。获得的玉米干旱诱导型启动子序列源自玉米干旱应答蛋白基因CKS2。一种克隆得到的玉米干旱应答蛋白基因CKS2的5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的+Ibp至+219bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。为实现另一个目的，本发明提供一种用于玉米转化的干旱诱导型的植物表达载体，包含玉米干旱诱导型启动子序列和玉米干旱应答蛋白基因CKS2的5’非翻译区。上述用于植物转化的干旱诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA (转移DNA)的RB (右边界序列)和 LB (左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens) Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如PCAMBIA1301载体、 PBI121 载体。一种用植物表达载体转化的转基因植物，包含玉米干旱诱导型启动子序列和玉米干旱应答蛋白基因CKS2的5’非翻译区。本发明提供SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(PCAMBIA1301)，所述的玉米干旱应答蛋白CKS2基因CKS2的启动子和5’非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米干旱应答蛋白基因CKS2的启动子和5’非翻译区至含有GUS报告基因的载体中而构建的PCAMBIA1301。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。本发明提供一种应用干旱诱导型二元载体的转基因植物，以及一种应用本发明所述进行瞬时表达的玉米成熟胚。植物能通过使用例如根癌农杆菌(An，G 1987, Plant Physiology)或粒子轰击方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)由上述植物干旱诱导型启动子二元载体进行转化。在本发明中，例如烟草可以用叶盘转化法进行转化。本发明提供来自玉米干旱应答蛋白基因CKS2的干旱诱导型启动子和5’非翻译区，根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在植物中进行干旱诱导型表达。本发明有益效果在于可用于启动抗旱基因的高效表达，应用于抗旱的转基因植物中，对于解决干旱地区粮食生产并提高其产量具有积极意义。
图1为玉米(B73)基因组电泳图其中1. 2. 3.代表目的条带扩增的模板玉米B73基因组DNA图 2 为 ZmCKS2_pro PCR 电泳图其中1.ZmCKS2 Μ. Marker IV图3为pCAMBIA 1301 ZmCKS2pro质粒酶切鉴定电泳图其中:M.marker ν 1. Cks-1301 质粒酶切 2. Cks-1301 质粒图4为pCAMBIA 1301: ZmCKS2pro植物表达载体构建示意5为ZmCKS2pro启动子的GUS检测(用20 %的PEG处理)图6为ZmCKS2pro启动子的⑶S检测(未处理)图7为pCAMBIA 1301 :ZmCKS2pro农杆菌侵染烟草叶片筛选照片图8为pCAMBIA 1301:: ZmCKS2pro农杆菌侵染烟草叶片筛选后生根照片图9为转基因(ZmCKS2pr0)侵染烟草根的⑶S染色照片(未处理)图10为转基因(ZmCKS2pro)侵染烟草根的⑶S染色照片(用20%的PEG处理)
具体实施例方式下面结合附图介绍具体实施例以下的实施将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明优选的具体实施方式
来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。本发明的其它方面对于本发明有关领域的技术人员来说是显而易见的。实施例1 玉米干旱应答蛋白基因CKS2的干旱诱导型启动子的克隆玉米干旱应答蛋白基因CKS2的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID NO=I的转录起始位点的-Ibp至-1444bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米干旱应答蛋白基因CKS2的 5’非翻译区序列中得到鉴定。玉米干旱应答蛋白基因CKS2登录在NCBI GenBank (登录号⑶556566. 1)，序列表显示本发明上述基因的植物干旱诱导型启动子和5’非翻译区的DNA序列。在图1中，蛋白合成的起始密码子ATG带有下划线，而且转录起始位点的碱基T用+1示出。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。启动子分析网站为http://bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/0以玉米基因组DNA(图1)为模板，扩增得到目的片段，经
琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度为1860bp的特异条带，并进行回收(图幻。电泳后回收目的片段，与PMD 18-T载体连接得到重组质粒pMD 18-T::Zm CKS2ft~o，提取质粒并进行琼脂糖凝胶电泳检测，酶切验证，并测序。更具体地说，通过PCR扩增克隆的干旱应答蛋白基因CKS2的启动子和219bp的5’ 非翻译区(见序列表)，上述PCR所用引物详细显示在表1中。对于PCR扩增，反应程序: 940C 4min ；94°C 50S，55. 5°C 50S，72°C 2min，29 个循环；72°C IOmin ；表1:引物
上游引物5' CAATCCTGTCTTGCCCCATACT 3'SEQ ID NO 2下游引物5' TCCATGGCTACCMGACTTCTCG 3'SEQ ID NO 3 实施例2 植物干旱诱导型载体的构建将在实施例1中所克隆的玉米干旱应答蛋白基因CKS2的启动子和219bp的5’非翻译区ZmCKS2ftx)(见序列表)插入到载体中，从而构建植物干旱诱导型载体。更具体地说，将植物表达载体pCAMBIA 1301及重组质粒pMD 18-T: :Zm CKS2Pro 用克隆序列内部的I3StI和NcoI分别进行酶切，然后将它们插入载体pCAMBIA1301的I^stI 和NcoI酶切位点。该载体被称作pCAMBIA 1301: Zm CKS2ftx)，用于驱动⑶S基因的表达， 经酶切鉴定(图3)获得了启动子片段，与预期结果相同。在图4中，以编码β -葡糖酸醛酶的基因GUS为报告基因，选择标记为潮霉素抗性基因。此外35s-pro代表HPTII的启动子，而35s_ter代表HPTII的终止子，Sn CKS2Pro代表⑶S的启动子，而Nos-ter代表⑶S的终止子。实施例3 鉴定玉米干旱诱导型启动子的活性通过热激转化法，将在实施例2中构建的载体pCAMBIA 1301:: Zm CKS2Pro转移到根癌农杆菌EHA105中，提取质粒并进行酶切鉴定。为鉴定启动子的干旱诱导活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法对农杆菌侵染后的玉米的胚干旱处理再检测GUS的活性。更具体地说，将玉米种子浸泡催芽，然后将种子纵切成两半，用20 % PEG诱导培养Mh，将玉米种子在⑶S检测液中于37 °C过夜，⑶S检测液3mg/mlX-gluc (5-溴-4-氯-3- 口引哚-β -D-葡糖苷酸)、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH = 7. 0)，IOmM EDTA，0. 5mM铁氰化钾、0. 5mM亚铁氰化钾、0. 1% TritonX-100，20%甲醇。如图所示(图5， 图6)，经过PEG诱导的胚根组织显示出高水平的⑶S活性，而未经诱导的愈伤组织显示出低水平的GUS活性。实施例4 烟草的叶盘转化4.1受体材料的准备将烟草种子(NC89)用10%的次氯酸钠消毒，用无菌水冲洗三次，接种在MS培养基上，得到无菌烟草苗。待幼叶长至2 3cm时，将叶片取下用直径为7mm的打孔器制成叶盘，近轴面向下接种在分化培养基(MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L ΝΑΑ,ΡΗ = 5. 8,0. 7%琼脂) 上，预培养2 3d。叶盘切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。4. 2农杆菌菌液的制备将农杆菌EHA105接种于YEP(50mg/L rif、50mg/L kan)固体培养基上，28°C暗培养，至长出单菌落。挑取单菌落，接种在5mL含有相应抗生素的YEP液体培养基中，于， 200r/min振荡培养M 36小时，将菌液按1 20的比例进行二次活化。当0D600 = 0. 4 0. 6时，吸取菌液置于无菌离心管中，5000rpm离心5min，弃上清，用等体积的MS液体培养基
重悬，备用。4. 3侵染取预培养2 3d的外植体叶片于无菌三角瓶中，加入适量活化好的农杆菌菌液，侵染5 IOmin左右。4. 4共培养将侵染过的外植体接种在共培养培养基上，暗培养2d。4. 5除菌及筛选培养将经过共培养的外植体用无菌水冲洗3 4次，然后用附加除菌剂的液体培养基振荡培养30min，用无菌滤纸吸干表面水分，再转移到附加选择压力的除菌筛选培养基上，28°C光照培养，每IOd继代一次(图7)。4. 6继代筛选培养筛选培养2 3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性芽，将抗性芽转入相应的筛选培养基中进行继代培养。4. 7生根培养待不定芽长到3 4cm时，将其切下并插入生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根。(图8)实施例5 转化烟草的组织化学法染色将实施例4中的烟草根在含有20% PEG的MS培养基中诱导Mh，浸入⑶S检测液， 于37°C保温过夜，将染色材料用70%的乙醇脱色除去叶绿素。⑶S检测液lmg/ml X-gluc、 50mM磷酸钠缓冲溶液(PH = 7. 0), IOmM EDTA,0. 5mM铁氰化钾、0. 5mM亚铁氰化钾、0. 1 % ΗΟηΧ-100，20%甲醇。如图9、图10所示，经过PEG诱导的根示出高水平的⑶S活性，而未经诱导的根未检测出GUS活性。工业实用性如上所述，本发明提供玉米干旱应答蛋白基因CKS2的干旱诱导型启动子和5’非翻译区。本发明提供分别将启动子和5’非翻译区插入至pCAMBIA1301而制得的植物表达载体。经使用所述的植物表达载体进行鉴定，本发明所述的玉米干旱应答蛋白基因CKS2 的启动子和5’非翻译区使得能够进行干旱诱导型的表达。因此，本发明可用于提高耐旱基因的启动活性，最终获得能用于生产的耐旱植物。 序列表
SEQ ID NO. 1的序列(带功能元件标记)
⑴序列特征(A)长度-lbp至-1444bp ；+Ibp至+219bp ； (B)类型核苷酸；(C) 单链。
( )分子类型核苷酸 (iii)序列描述=SEQ ID NO. 1
-1444 GTTGTGCTCA A0GGTCA00C GTGGACATOC ATOGTGMOC OCMTTOGTG AGTGATTGAT ATTCAGTTTT CCAAT-box MBS
-1374 GCCTACATCT IUTTCTTGCT TGTTTCTTCA ATTGATTGTA GGMTAGMC TTTGTGTTCA GGTTGATCTT -1304 GTCAOCAGCA AGGTCMTM OCATTTGGM TTGCTTCTGC GMTGCTMG GTGCCAOGAC CIUTTOGTTC Box-WlG-box
-1234 GTAGTOGGAT OGCGAGTCAT GTTCTOCAOC MTCMMTT AT0CA0CT0G TOGAMGATC GGGGACTOCA
Skn-l_motif TC-rich repeats circadian -1164 GCTCTATCAC CTTTTATAGG TCAGGAMGG GGTOGGCCAG AGATGGMGG AGCOGCGAGG
-1094 AOCMOGTTC TATCTAGGGT AMGCCATGT
C-repeat/DRE GTACTOGTGG GAOOOGGMT TGTTTG1TTC
CMGGGTMT
ABRE GTATTTAOOG
G-box
-1024 TGGCGCATGA OGTGGGGCTG OGATGGTAOC AGGCGCTACT GTOCTCTOCA CACAOGCTAC ACT000CT0G CGTCA-motif
-954 GCCTOGTTGT GACTOGTGTC AAMCTCTTC OGTGAAMOC GTATOCACTA AGGCAGACTC CMOGAOGCC
CE3
TGA-element
-884 OOCTCTGCTC 000CTCA00C TOGCCAOGGC GTAOGACAGC TOCATGMOG ACTOCATOGT TGCOOOCTCT
TGA-element
AGAGAMOGT nOCTTOCAC
-814
-744 -674
(XCTOOOOCT CAOGCOGATG Spl
GTGTGAmT CTGATMCM
TTGATGTATA AMGTCAMT
TATGTAmT MCTTAGm
GATMTMTT ATGAMTTM mTTTTCAG
TAATbox ATACAmn Α ΤΠΤΤΑΜ ACTTCAAAM ATGAGCTGM TAAMGGMT GGTTGGAGM GA-motif
GGTACTACM MTGATAMG as-2—box
-604 GGGATAGMT AGGGGGMGA ATAGTTGAGG GGGAGGTATG TAMTATGM AAMGTATM mGGGGGAT
TCA-element -534 TTGAGAGAGA GMTGGmG AGATAOOCTA AGGGCTGAH
-464 -394
GGGATTGAGG AMnMOOC
GGGAMmG TTTAITTOOC ACTCMTOOC TMGGGGGAC TOCMCAGTG OOOCTOGACA
TGGTGAOOOG GGATOOOGGG AGGATOGMG Spl
CTATMTOCT CTOGGGATOC OCTTGTCAOC OCTMOCTGA MGMTGGAG GGCGGGGAOG
Spl
-324 OCAOCTOGCC GCTOCMOGG OGCOCTTGCC TGQXTCTOG OGGGCGTGGA GMTATTTOC OOCTTGGAGA
CCAAT-boxTC-rich repeats
-254 GGGMGCTCT AGTCTTOOOC TCTOCACTM TCMTMTM ΤΜπΑ Μ ΑπΜπΑπ TTTGAG1TTA
-184 CTAGCAGATA ACMTGTGTA mmCTAT AMTATGGCA GTGTTTTTTG AMCT0CAM MCAMTGTACAAT-box-114 AAAAMGm MTTGCTCAG HAAMGATA MMGMMC TGMTAGGM GMTGATMG AGAGMGATAMBS+1-44 ΑΜΤΜΤΑπ TAMTATGM TAAAMGTAT AMTAGCGGG GCTTTGAGAG GGGGMTGGT AGGAGATACT+27 ATMGGTAOG T000GA0GCC OGTTGCCTTC TCAOOOCAM TOCTOCMn TCTTGTCTTC TOOGCGAMTCCAATT-boxCAAT-box 5UTR Py-rich stretch+97 GnOCTCTGT CTGTOGTGTC TTTCTTCTGG T0G1TT000G AHOGGTAGT TGGCTTGGGG ATTTCACTGCG-boxGCN4_motif+167 AAGTTTGGGG ATTTTCTGTA GGAAAGTTGA TCGAGAAGTC TTGGTAGCCA TGG
权利要求
1.一种获得的玉米干旱诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列包含相对于 SEQID NO 1的转录起始位点的-Ibp至-1444bp区的DNA核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的获得的玉米干旱诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列源自玉米干旱应答蛋白基因CKS2。
3.根据权利要求2所述的获得的玉米干旱诱导型启动子序列，其特征在于一种克隆得到的玉米干旱应答蛋白基因CKS2的5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO :1的转录起始位点的+Ibp至+219bp区的DNA核苷酸序列。
4.一种用于玉米转化的干旱诱导型的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体包含权利要求1所述的玉米干旱诱导型启动子序列和权利要求3所述的玉米干旱应答蛋白基因CKS2的5’非翻译区。
5.一种用植物表达载体转化的转基因植物，其特征在于所述转基因植物包含权利要求 1所述的玉米干旱诱导型启动子序列和权利要求3所述的玉米干旱应答蛋白基因CKS2的 5’非翻译区。
6.SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的PCR引物，其特征在于所述引物适于扩增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。
全文摘要
玉米干旱诱导型启动子及活性分析属生物工程技术领域，本发明提供获得的玉米干旱诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO1的转录起始位点的-1bp至-1444bp区的DNA核苷酸序列；同时提供用于玉米转化的干旱诱导型的植物表达载体，其包含玉米干旱诱导型启动子序列和玉米干旱应答蛋白基因的5’非翻译区；用植物表达载体转化的转基因植物包含玉米干旱诱导型启动子序列和玉米干旱应答蛋白基因的5’非翻译区；SEQ ID NO2和3的PCR引物引物适于扩增包含SEQ ID NO1的序列DNA片段；本发明可用于启动抗旱基因的高效表达、用于抗旱的转基因植物中，对于解决干旱地区粮食生产并提高其产量具有积极意义。
文档编号A01H5/00GK102417910SQ201110363699
公开日2012年4月18日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者刘金亮, 张世宏, 张桂珍, 李桂华, 潘洪玉, 王凤婷, 贾承国 申请人:吉林大学