专利名称：玉米病害诱导型启动子的克隆及功能分析的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种源自玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)， 并能够在玉米中高水平表达的诱导型启动子序列。
背景技术：
玉米(Zea mays L.)是重要的粮食和饲料作物，在我国各种逆境胁迫每年都引起玉米减产20% -30%。干早、高盐、低温等逆境胁迫是影响植物生长发育的重要限制因子。 据统计，目前全世界很多耕地受到盐害威胁，干早、半干早地区，而我国有近亿人口受到土地过度盐碱化和荒摸化的威胁。因此，提高植物抗早能力已经成为现代植物育种工作急需解决的关键问题之一。为了抵抗外界逆境条件胁迫，植物通过调节自身体内基因的表达、生理生化变化来适应逆境，增强耐性。近年来，随着现代分子生物学技术的飞速发展，许多受逆境胁迫的基因被相继鉴定与克隆。在转基因植物中过表达能够提高植株的抗逆性，而启动子是基因表达调控的重要因素之一。同时，诱导型启动子能够调控外源基因在特定的生长时期，逆境条件下表达， 降低了植物能量的不必要浪费。因此，逆境胁迫诱导型启动子在植物抵御逆境胁迫反应中的作用越来越受到人们的重视。高等植物基因的表达调控已成为分子生物学研究领域的热点，启动子是基因表达调控的重要元件。深入研究启动子的结构和功能，建立可用于植物转基因表达的时、空、量三维调控系统，可为功能基因组学研究及通过基因工程技术精确地调节植物代谢提供全新的思路。选择适宜的启动子来驱动目的基因在转基因植物中表达，已成为植物基因工程研究的热点问题之一。针对不同的目的基因，人们选用不同的启动子，从而使靶基因在特定组织或条件下选择性表达，以利于转基因植物的正常生长发育(赵恢武等，2000 ；刘强等， 2000)。对植物在干旱逆境下大量表达的耐旱基因启动子研究表明，不同耐旱基因的启动子往往含有相同的顺式作用元件，并受相同的反式作用因子的调控。这为我们提供了另外一条研究植物耐旱机制的途径。国内外科学家利用一些耐旱相关的特异性启动子(如RD^A)、特异性蛋白(如脱水素)、耐旱相关的特异性酶(如TPQ基因进行植物遗传转化并获得了成功，得到一些耐旱品质明显提高的转基因植株。清华大学的刘强等000 将来自拟南芥的干旱诱导型基因RD29A的两个转录调控因子转入拟南芥后发现拟南芥的干旱耐受性能有很大提高。高世庆O006)通过基因枪介导转化小麦幼胚愈伤组织，经过分子生物学检测及在PEG胁迫下的 ⑶S组织化学染色证实了 RD29A启动子在小麦愈伤组织中能够诱导⑶S基因的表达。也有科研工作者直接利用干旱诱导型启动子启动某些耐旱有关的蛋白表达进行植物耐旱机理的研究。如利用特异性的启动子启动与耐旱有关的基因(如脱水素基因等)或特异性的渗透调节物合成酶基因在烟草、拟南芥等模式植物体内表达获得耐旱植株；通常情况下在双子叶植物中常用的组成型启动子CaM35S启动海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)在烟草和拟南芥中均获得耐旱植株，而用诱导型启动子RD^启动TSP (海藻糖-6-磷酸合酶)在烟草中表达，获得了较为明显的耐旱烟草植株。单子叶植物的WDiquitin-promoter有两部分组成eX0n和intron，其中intron具有增强子的功能。目的基因在其启动下能够大量稳定的在单子叶植物体内表达。浙江大学郝中娜等000 对水稻0sWRKY19及0sWRKY89基因的启动子进行功能研究，表明这两个基因的启动子是组织特异性表达的诱导型启动子。Brown 等Q010)首次发现冬小麦bltlOl基因启动子内存在高度保守的TCA-Iike元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密切相关。Takumi等分离了小麦低温应答基因家族基因WCorl5上游的启动子序列证实该启动子受低温和光诱导。利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因的高效表达，从而改良作物的抗逆性成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗逆境相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种病害诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目标基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)。本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的病害诱导型启动子载体，该载体指导在植物中高水平表达目标基因ZmRxol的病害诱导型启动子序列和5'非翻译区。本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因植物。该转基因植物能反映启动子诱导活性的高低。为实现上述目的，本发明克隆了玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的病害诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有ZmRxol基因的5'非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米中诱导表达，并观察到该启动子与病害诱导性相关的高水平活性。本发明提供一种获得的玉米病害诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的-Ibp至_155bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，病原菌侵染可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。获得的玉米病害诱导型启动子序列源自玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)。一种克隆得到的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的5'非翻译区，包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的+Ibp至+1421bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。为实现另一个目的，本发明提供一种用于玉米转化的病害诱导型的植物表达载体，所述植物表达载体包含玉米病害诱导型启动子序列和玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的 5'非翻译区。上述用于玉米转化的病害诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA (转移DNA)的RB (右边界序列)和 LB (左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agroba terium tumefaciens) Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如PCAMBIA1301载体、 PBI121 载体。
一种用于植物表达载体转化的转基因植物，包含玉米病害诱导型启动子序列和玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的5'非翻译区。本发明提供SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(PCAMBIA1301)，所述的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的启动子和5'非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的启动子和5'非翻译区含有GUS 报告基因的载体中而构建的PCAMBIA1301。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。本发明提供一种应用病害诱导型二元载体的转基因植物，以及一种应用本发明所述进行瞬时表达的玉米成熟胚。植物能通过使用例如根癌农杆菌(An，G. 1987，Plant Physiology)或粒子轰击方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)由上述植物病害诱导型启动子二元载体进行转化。在本发明中，例如烟草可以用叶盘转化法进行转化。本发明提供来自玉米的抗病蛋白基因(ZmRXOl)的病害诱导型启动子和5'非翻译区，根据本发明的启动子和5'非翻译区使得能够在植物中进行病害诱导型表达。本发明的有益效果在于可用于启动抵抗逆境基因的高效表达，对于玉米抗逆品种转基因技术的研究，培育综合抗性强、优质、高产的转基因新品系具有积极意义。
图1为玉米(B73)基因组电泳图
图2 为 ZmRXOl-pro PCR 电泳图
图3为ZmRXOΙ-pro连T载质粒提取电泳图
图4为ZmRXOΙ-pro连T载酶切鉴定电泳图
图5为pCAMBIA 1301: Zm RXOlPro酶切鉴定电泳图
图6为植物表达载体构建示意图
图7为pCAMBIA 1301: Zm RXOPro转农杆菌PCR鉴定电泳图
图8为pCAMBIA 1301: Zm RXOlPro转农杆菌质粒提取电泳图
图9为3 启动子的⑶S检测照片
图10为ZmRXOl启动子(未用20% PEG处理)的⑶S检测照片
图11为ZmRXOl启动子(用20%的PEG处理Mh)的⑶S检测照片
具体实施例方式下面结合附图具体说明实施例以下的实施例将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式
来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。实施例1 玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的逆境诱导启动子的克隆玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID NO=I的转录起始位点的-Ibp至_155bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米抗病蛋白基因ZmRXOl的5'非翻译区序列中得到鉴定。玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)登录在NCBI GenBank(登录号AY935244. 1)，序列表显示本发明上述基因的植物逆境诱导型启动子和5'非翻译区的DNA序列。在图1中，蛋白合成的起始密码子ATG带有下划线，而且转录起始位点的碱基A用+1示出。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。启动子分析网站http://WWW. dna. affrc. go. jp/PLACE/ signalscan. html。以玉米基因组DNA (图1)为模板，扩增得到目的片段，经1 %琼脂糖凝胶电泳分析， 扩增出长度为1576bp的特异条带(图2)。电泳后回收目的片段，与pMD 18-T载体连接得到重组质粒pMD 18-T: ZmRXOPro，提取质粒并进行琼脂糖凝胶电泳检测(图幻，酶切验证 (图4)，并测序。更具体地说，通过PCR扩增克隆的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的启动子和1421bp 的5'非翻译区(见序列表)，上述PCR所用引物详细显示在表1中。对于PCR扩增，反应程序94°C 5min ；94°C 45S，56°C 40S，72°C 2min，30 个循环；72°C IOmin ；表1:引物
上游引物5' CGGAATTCACAATATCGGTTCCGCTGC 3'SEQ ID NO 2下游引物5' CCCATGGCTTCTTATTCGATCAGAC 3'SEQ ID NO 3实施例2 植物逆境诱导型启动子载体的构建将在实施例1中所克隆的玉米抗病蛋白基因(ZmRXOl)的启动子和1421bp的5' 非翻译区ZmRXOl 见序列表)插入到载体中，从而构建植物逆境诱导型载体。具体地说，将植物表达载体pCAMBIA 1301及重组质粒pMD 18_T: ZmRXOlPro用 EcoRI和NcoI分别进行酶切，然后将它们插入载体pCAMBIA1301的EcoRI和NcoI酶切位点。该载体被称作pCAMBIA 1301::ZmRX01ftx)，用于驱动⑶S基因的表达，经酶切鉴定(图 5)获得了启动子片段，与预期结果相同。在图6中，以编码ρ-葡糖酸醛酶的基因GUS为报告基因，选择标记为潮霉素抗性基因。此外:35s-pro代表HPTII的启动子，而:35s_ter代表HPTII的终止子，ZmCIPK16Pro 代表⑶S的启动子，而Nos-ter代表⑶S的终止子。实施例3 鉴定玉米逆境诱导型启动子的活性通过热激转化法，将在实施例2中构建的载体pCAMBIA 1301: ZmRXOlPro转移到根癌农杆菌EHA105中，提取质粒(图8)并进行PCR鉴定(图7)。为鉴定启动子的逆境诱导活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法将玉米的成熟胚做了逆境之一的干旱处理再检测GUS的活性。具体地说，将玉米种子浸泡催芽，然后将种子纵切，成两半，用20 % PEG 诱导培养24h，将玉米种子在⑶S检测液中于37 °C过夜，⑶S检测液lmg/ml X-gluc (5-溴-4-氯-3- 口引哚-β -D-葡糖苷酸)、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH = 7. 0)，IOmM EDTA，0. 5mM铁氰化钾、0. 5mM亚铁氰化钾、0. iTritonX-IOO, 20%甲醇。如图所示(图9、 图10、图11)，经过PEG诱导的愈伤组织显示出高水平的⑶S活性，而未经诱导的愈伤组织显示出低水平的⑶S活性。
SEQ ID NO. 1的序列(带功能元件标记)⑴序列特征(A)长度-lbp至-155bp ；+Ibp至+1421bp ； (B)类型核苷酸；(C)链性单链。(ii)分子类型核苷酸(iii)序列描述:SEQ ID NO. 1-155 A EamIATCGG TTCCGCTGCG TCGGTTCGGA TGTGTGGATC GGTTGGGTCG GACCATGTGC
Q\AT4x)x-95 ACCTGGGCGC CTGGGT j(;cAT TC|TC f|^TT GAATGCACCC AGG Itataata T/vrAATA|ACA
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+1406
GATCGAATAA GAAGGGATG
权利要求
1.一种获得的玉米病害诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列包含相对于 SEQID NO 1的转录起始位点的-Ibp至_155bp区的DNA核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的获得的玉米病害诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列源自玉米抗病蛋白基因ZmRXOl。
3.根据权利要求2所述的获得的玉米病害诱导型启动子序列，其特征在于一种克隆得到的玉米抗病蛋白基因ZmRXOl的5'非翻译区包含相对于SEQ ID NO=I的转录起始位点的+Ibp至+142Ibp区的DNA核苷酸序列。
4.一种用于玉米转化的病害诱导型的表达载体，其特征在于所述植物表达载体包含权利要求1所述的玉米病害诱导型启动子序列和权利要求3所述的玉米抗病蛋白基因ZmRXOl 的5'非翻译区。
5.一种用于植物表达载体转化的转基因植物，其特征在于所述转基因植物包含权利要求1所述的玉米病害诱导型启动子序列和权利要求3所述的玉米抗病蛋白基因ZmRXOl的 5'非翻译区。
6.SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的PCR引物，其特征在于所述引物适于扩增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。
全文摘要
玉米病害诱导型启动子的克隆及功能分析属于生物工程技术领域，本发明提供一种获得的玉米病害诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO1的转录起始位点的-1bp至-155bp区的DNA核苷酸序列；同时提供用于玉米转化的病害诱导型的表达载体，包含玉米病害诱导型启动子序列和玉米抗病蛋白基因ZmRX01的5′非翻译区；SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的PCR引物适于扩增包含SEQ ID NO1的序列DNA片段；本发明可用于启动抵抗逆境基因的高效表达，对于玉米抗逆品种转基因技术的研究，培育综合抗性强、优质、高产的转基因新品系具有积极意义。
文档编号A01H5/00GK102417908SQ20111036366
公开日2012年4月18日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者刘金亮, 张世宏, 李桂华, 潘洪玉, 贾承国, 陈婷婷, 陈景源, 陶冶 申请人:吉林大学