专利名称：制备高硒灵芝材料的方法
技术领域：
本发明涉及高硒材料的制备方法，具体是指一种获取高有机硒灵芝材料的方法。
技术背景
硒是人和动物体内必需的微量元素，是构成谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、硒蛋白P等多达23种功能蛋白的活性中心，具有以下功效(1)清除体内过氧化物、自由基，保护细胞结构与功能不受干扰与损害，延缓衰老；(2)加速致癌物质的代谢，促进DNA损伤修复，降低癌症发病率；(3)拮抗体内有毒物质，降低其毒性，有效保护肝脏；(4)增强机体细胞免疫功能，提高机体免疫力。但是我国有约72%的人群处于缺硒状态，日摄入硒的总量约为35 μ g，显著低于世界卫生组织(WHO)推荐的硒日摄入量50-200 μ g。因此，补充硒的有效摄入成为我国低硒地区和缺硒人群的迫在眉睫的问题。
有机硒的摄入相较于无机硒具有如下优势1、有机硒远远低于无机硒在人体内的累积效应，对人体的毒害效应远远低于无机硒2、有机硒的人体消化吸收效率远远高于无机硒，补硒的效率远远强于无机硒；同时在相同的效果下，有机硒的补充并未明显提高成本。
因此，有机硒逐渐取代无机硒成为低硒地区和缺硒人群补硒的首选。
灵芝因其具有繁殖时间短、生物量大、蛋白含量高等特点，同时具有传统的保健功能，而且对硒具有一定的富集能力，对其进行富硒研究和开发具有广阔的应用前景。但是，目前的专利主要集中在对灵芝的传统保健功能的研究和开发，有限的硒营养强化工作也集中在固体培养、直接食用上，如一种富硒段木灵芝孢子粉的培育方法(专利号 200810109660)、有机硒灵芝孢子粉的生产方法(申请号200910144893. 6)，均具有有机硒含量不高、有机硒转化率低下、有机硒形态不明等缺陷。有研究显示，液体富硒深层发酵可以大幅提高灵芝的有机硒转化率和有机硒含量，如四种食用菌富硒能力的比较研究 (尚德静，王关林，1999，食用菌学报)表明，液体深层发酵条件下，灵芝的耐硒能力达到 500 μ g/g，菌丝体有机硒含量达到8000 μ g/g (干重)，但是依然存在所获得有机硒形态不明的缺陷，不利于后期产品的开发，而且灵芝的富硒能力还有提高的可能。目前，在中国的专利和科技文献中，尚未开展任何将灵芝作为高硒载体、作为食品、保健品的添加剂的形式进行开发的先例。本发明因此而来。发明内容
本发明的目的是提供一种获取高有机硒灵芝材料的方法，为开发高效的补硒产品和保健品提供优质的材料。
本发明的技术方案如下
一种制备高硒灵芝材料的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤
(1)将灵芝菌种接入PDA综合培养基中进行试管菌种培养得到初始试管菌种；
(2)将硒源与PDA综合培养基混合分别配制成梯度硒浓度的含硒培养基，对含硒培养基进行灭菌处理，采用菌悬液接种方式将灵芝菌种接种到灭菌处理后的含硒培养基上按照硒浓度从低到高的顺序按照常用的灵芝菌种培养方式逐一硒浓度进行耐硒培养得到耐硒培养菌种；首次耐硒培养使用的菌悬液为初始试管菌种，以后耐硒培养采用的菌悬液为当前硒浓度进行耐硒培养得到的耐硒培养菌种，依次类推；当灵芝菌种生长出现下列情形之一时
i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；
ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；
iii)菌株明显变色；
且相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值在预定阈值内时，停止耐硒培养，并确定灵芝的最佳耐受硒浓度为前一批次耐硒培养基的硒浓度和高耐硒灵芝菌种；
(3)将步骤O)中获得的高耐硒灵芝菌种接入经灭菌处理的含硒液体发酵培养基中，所述含硒液体发酵培养基的硒含量为500-1500mg/L，培养条件为温度为25 33°C，转速为100 200转/分的最优化条件下，进行灵芝液体富硒深层培养即得高硒灵芝材料。
优选的，所述方法中当灵芝菌种生长出现下列情形之一时
i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；
ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；
iii)菌株明显变色；
当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度，使耐硒培养基的硒浓度大于前一批次耐硒培养基的硒浓度，且耐硒培养基的硒浓度小于当前批次耐硒培养基的硒浓度，然后以调整硒浓度后的耐硒培养基按照步骤O)的方法继续进行耐硒培养。
优选的，所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据预定阈值或预定阈值的整数倍数进行调整，当灵芝菌种生长出现下列情形之一时
i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；
ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；
iii)菌株明显变色；
当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度为当前批次耐硒培养基的硒浓度减去预定阈值或预定阈值的整数倍数后的硒浓度。
优选的，所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据相邻批次耐硒培养基的硒浓度进行调整，当灵芝菌种生长出现下列情形之一时
i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；
ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；
iii)菌株明显变色；
当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度为相邻批次耐硒培养基的硒浓度的平均值。
优选的，所述方法中PDA综合培养基每IOOml定容培养基中，所用原料为马铃薯20g，葡萄糖 2g，琼脂 1. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，KH2PO4O. 3g，VBl 0. OOlg，pH 调至 6. 0。
优选的，所述方法中所述PDA综合培养基的配制方法包括先将应加入的马铃薯与蒸馏水混勻，保持沸腾30分钟后过滤，加入其他原料并充分混合后定容至所需体积的步马聚ο
优选的，所述方法中硒源选自亚硒酸钠、硒酸钠或富硒酵母粉。
优选的，所述方法中梯度硒浓度的含硒培养基为硒浓度分别为10、30、50、80、100、 120，140、160mg/L的含硒培养基；当灵芝菌种完成160mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒灵芝菌种。
优选的，所述方法中所述含硒液体发酵培养基的配方为每IOOml定容培养基中， 所用原料为玉米粉Ig,葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7Η200· 2g，KH2PO4 0. 3g，175-263mg亚硒酸钠或190-287mg硒酸钠，pH为自然状态。
优选的，所述方法中所述含硒液体发酵培养基的硒含量为800_1200mg/L，培养条件为温度为30°C，转速为150转/分的最优化条件下，进行灵芝液体富硒深层培养3-4天， 即得高硒灵芝材料。
具体的获取高有机硒灵芝材料的方法，按照以下条件和步骤制备先将灵芝菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养得到初始试管菌种；将硒源与 PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作成10，30，50，80，100，120，140，160mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌；将初始试管菌种接入含硒浓度为10mg/L的含硒培养基中，进行灵芝菌种一级耐硒培养得到一级耐硒灵芝菌种；将一级耐硒灵芝菌种接入 30mg/L的含硒培养基中，进行灵芝菌种二级耐硒培养得到二级耐硒灵芝菌种；依此类推， 直至灵芝菌种完成160mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒灵芝菌种；将获得的高耐硒灵芝菌种接入经灭菌处理的含硒液体发酵培养基中，在最优化的条件下，进行灵芝液体富硒深层培养；在发酵的第3-4天，单位发酵液的灵芝有机硒含量达到最大，达到50-80mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占灵芝总硒的80%以上。
本发明得到的高硒灵芝材料可制备高有机硒食品或保健品添加剂。作为优化，上述PDA综合培养基配方为每IOOml定容培养基中，所用原料为马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂 1. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，KH2PO4 0. 3g，VBl 0. OOlg, pH 调至 6. 0 ；所述 PDA 综合培养基配置方法是先将应加入的马铃薯与蒸馏水混勻，保持沸腾30分钟后过滤，加入其他原料并充分混合后定容至所需体积。
作为优化，硒源是指亚硒酸钠或硒酸钠。
作为优化，最优化条件是指含硒液体发酵培养基的硒含量为800-1200mg/L，培养条件为温度为30°C，转速为150转/分；所述含硒液体发酵培养基的配方为每100ml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g， 175-263mg亚硒酸钠或190_287mg硒酸钠，pH为自然状态。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果
1、大幅提高灵芝的耐硒浓度耐硒浓度可提高到800-1200mg/L ；
2、大幅提高灵芝菌丝体中的有机硒含量灵芝菌丝体硒含量可达 15000-18000 μ g/g (干重)，其中硒代蛋氨酸占80%以上;
3、大幅缩短灵芝液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的2/3-1/2 ；
4、有机硒产量较高单位发酵液的灵芝有机硒产量达到50_80mg/L ；
5、可生产高硒材料所收获的灵芝菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂，也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例13L液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买灵芝菌种(编号5. 653)。
2)将灵芝菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将亚硒酸钠(Na2SeO3)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，80，100，120，140，160mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行灵芝菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒灵芝菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行灵芝菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至灵芝菌种完成160mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒灵芝菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒灵芝菌种接入经灭菌处理的500mL含硒1000mg/L的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，219mg 亚硒酸钠，pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的3L发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第3天，收获灵芝菌丝体，其生物量为3. 5g (干重)/L,菌丝体硒含量为17mg/ g (干重)，单位发酵液的灵芝硒含量达到59. 5mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占灵芝总硒的 80-85% ο
实施效果
大幅提高灵芝的耐硒浓度灵芝在硒含量为1000mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短灵芝液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的1/2。
有机硒产量较高灵芝菌丝体硒含量可达17000 μ g/g (干重)，灵芝有机硒产量达到59. 5mg/L，其中硒代蛋氨酸占80-85%。
可生产高硒材料所收获的灵芝菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂， 也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例2 10L液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买灵芝菌种(编号5. 653)。
2)将灵芝菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将亚硒酸钠(Na2SeO3)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，80，100，120，140，160mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行灵芝菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒灵芝菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行灵芝菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至灵芝菌种完成160mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒灵芝菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒灵芝菌种接入经灭菌处理的500mL含硒1000mg/L的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，219mg 亚硒酸钠，pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的IOL发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第4天，收获灵芝菌丝体，其生物量为4. Og (干重)/L,菌丝体硒含量为18mg/ g (干重)，单位发酵液的灵芝硒含量达到72mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占灵芝总硒的 80-85%。
实施效果
大幅提高灵芝的耐硒浓度灵芝在硒含量为1000mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短灵芝液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的2/3。
有机硒产量较高灵芝菌丝体硒含量可达18000 μ g/g (干重)，灵芝有机硒产量达到7ang/L，其中硒代蛋氨酸占80-85%。
可生产高硒材料所收获的灵芝菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂， 也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例3 :30L液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买灵芝菌种(编号5. 653)。
2)将灵芝菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将亚硒酸钠(Na2SeO3)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，80，100，120，140，160mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行灵芝菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒灵芝菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行灵芝菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至灵芝菌种完成160mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒灵芝菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒灵芝菌种接入经灭菌处理的500mL含硒1000mg/L的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，219mg 亚硒酸钠，pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的30L发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第4天，收获灵芝菌丝体，其生物量为3. 8g (干重)/L,菌丝体硒含量为16mg/ g (干重)，单位发酵液的灵芝硒含量达到60. 8mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占灵芝总硒的 80-85% ο
实施效果
大幅提高灵芝的耐硒浓度灵芝在硒含量为1000mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短灵芝液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的2/3。
有机硒产量较高灵芝菌丝体硒含量可达16000 μ g/g (干重)，灵芝有机硒产量达到60. 8mg/L，其中硒代蛋氨酸占80-85%。
可生产高硒材料所收获的灵芝菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂， 也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例4 IOL液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买灵芝菌种(编号5. 653)。
2)将灵芝菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将亚硒酸钠(Na2SeO;3)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，80，100，120，140，160mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行灵芝菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒灵芝菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行灵芝菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至灵芝菌种完成160mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒灵芝菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒灵芝菌种接入经灭菌处理的500mL含硒800mg/L的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgS04 ·7Η20 0. 2g, KH2P04 0. 3g，亚硒酸钠175mg，pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的IOL发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第3天，收获灵芝菌丝体，其生物量为4. 3g(干重)/L，菌丝体硒含量为 14.5mg/g (干重)，单位发酵液的灵芝硒含量达到62.35mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占灵芝总硒的80-85%。
实施效果
大幅提高灵芝的液体培养耐硒浓度灵芝在硒含量为800mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短灵芝液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的1/2。
有机硒产量较高灵芝菌丝体硒含量可达14500 μ g/g (干重)，灵芝有机硒产量达到62. 35mg/L，其中硒代蛋氨酸占80-85%。
可生产高硒材料所收获的灵芝菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂， 也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例5 IOL液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买灵芝菌种(编号5. 653)。
2)将灵芝菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将亚硒酸钠(Na2SeO;3)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，80，100，120，140，160mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行灵芝菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒灵芝菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行灵芝菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至灵芝菌种完成160mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒灵芝菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒灵芝菌种接入经灭菌处理的500mL含硒1200mg/L的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgS04 ·7Η20 0. 2g, KH2P04 0. 3g，亚硒酸钠263mg，pH自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的IOL发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第4天，收获灵芝菌丝体，其生物量为3. 05g(干重)/L，菌丝体硒含量为 17.5mg/g (干重)，单位发酵液的灵芝硒含量达到53.38mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占灵芝总硒的80%。
实施效果
大幅提高灵芝的液体培养耐硒浓度灵芝在硒含量为1200mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短灵芝液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的2/3。
有机硒产量较高灵芝菌丝体硒含量可达17500 μ g/g (干重)，灵芝有机硒产量达到53. 38mg/L，其中硒代蛋氨酸占80%。
可生产高硒材料所收获的灵芝菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂， 也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例6 IOL液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买灵芝菌种(编号5. 653)。
2)将灵芝菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将硒酸钠(NajeO4)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，80，100，120，140，160mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行灵芝菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒灵芝菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行灵芝菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至灵芝菌种完成160mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒灵芝菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒灵芝菌种接入经灭菌处理的500mL含硒800mg/L的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，硒酸钠 191mg，pH 自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的IOL发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第3天，收获灵芝菌丝体，其生物量为3. 9g (干重)/L,菌丝体硒含量为Hmg/ g (干重)，单位发酵液的灵芝硒含量达到M.6mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占灵芝总硒的 80%。
实施效果
大幅提高灵芝的液体培养耐硒浓度灵芝在硒含量为800mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短灵芝液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的1/2。
有机硒产量较高灵芝菌丝体硒含量可达14000 μ g/g (干重)，灵芝有机硒产量达到54. 6mg/L，其中硒代蛋氨酸占80%。
可生产高硒材料所收获的灵芝菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂， 也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
实施例7 IOL液体深层发酵
1)从中国科学院菌种保藏中心购买灵芝菌种(编号5. 653)。
2)将灵芝菌种接入经灭菌处理后的PDA综合培养基中进行试管菌种培养。
3)将硒酸钠(Na2SeO4)与PDA综合培养基按照一定的配比进行混合，制作硒含量为10，30，50，80，100，120，140，160mg/L的系列浓度梯度的含硒培养基，然后灭菌备用。
4)将步骤2培养的试管菌种接入步骤3制备的含硒浓度为10mg/L的培养基中，进行灵芝菌种一级耐硒培养。
5)将步骤4培养的一级耐硒灵芝菌种接入步骤3制备的30mg/L的培养基中，进行灵芝菌种二级耐硒培养。
6)依此类推，直至灵芝菌种完成160mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒灵芝菌种。
7)将步骤6中获得的高耐硒灵芝菌种接入经灭菌处理的500mL含硒1200mg/L的液体发酵培养基中，进行液体发酵种子液制备。其中发酵培养基组成为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，硒酸 m 287mg, pH 自然。
8)将步骤7中制备的种子液接入经灭菌处理的IOL发酵罐，发酵条件为温度为 30°C，转速为150转/分。其中的发酵培养基也经灭菌处理，组成与步骤7中液体发酵培养基相同。
9)在第4天，收获灵芝菌丝体，其生物量为3. Og (干重)/L,菌丝体硒含量为17mg/ g (干重)，单位发酵液的灵芝硒含量达到51mg/L，其中硒代蛋氨酸(有机硒)占灵芝总硒的 80%。
(3)实施效果
大幅提高灵芝的液体培养耐硒浓度灵芝在硒含量为1200mg/L的液体发酵培养基中生长良好。
大幅缩短灵芝液体深层发酵的生长周期生长周期缩短至对照组的2/3。
有机硒产量较高灵芝菌丝体硒含量可达17000 μ g/g (干重)，灵芝有机硒产量达到51mg/L，其中硒代蛋氨酸占80%。
可生产高硒材料所收获的灵芝菌丝体可作为优质的食品、保健品的硒源添加剂， 也可以进一步提取硒代蛋氨酸，作为硒氨基酸保健品。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种制备高硒灵芝材料的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)将灵芝菌种接入PDA综合培养基中进行试管菌种培养得到初始试管菌种；(2)将硒源与PDA综合培养基混合分别配制成梯度硒浓度的含硒培养基，对含硒培养基进行灭菌处理，采用菌悬液接种方式将灵芝菌种接种到灭菌处理后的含硒培养基上按照硒浓度从低到高的顺序按照常用的灵芝菌种培养方式逐一硒浓度进行耐硒培养得到耐硒培养菌种；首次耐硒培养使用的菌悬液为初始试管菌种，以后耐硒培养采用的菌悬液为当前硒浓度进行耐硒培养得到的耐硒培养菌种，依次类推；当灵芝菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；iii)菌株明显变色；且相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值在预定阈值内时，停止耐硒培养，并确定灵芝的最佳耐受硒浓度为前一批次耐硒培养基的硒浓度和高耐硒灵芝菌种；(3)将步骤(2)中获得的高耐硒灵芝菌种接入经灭菌处理的含硒液体发酵培养基中，所述含硒液体发酵培养基的硒含量为500-1500 mg/L，培养条件为温度为25 33°C，转速为 100 200转/分的最优化条件下，进行灵芝液体富硒深层培养即得高硒灵芝材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中当灵芝菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；iii)菌株明显变色；当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度，使耐硒培养基的硒浓度大于前一批次耐硒培养基的硒浓度，且耐硒培养基的硒浓度小于当前批次耐硒培养基的硒浓度，然后以调整硒浓度后的耐硒培养基按照步骤(2)的方法继续进行耐硒培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据预定阈值或预定阈值的整数倍数进行调整，当灵芝菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；iii)菌株明显变色；当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度为当前批次耐硒培养基的硒浓度减去预定阈值或预定阈值的整数倍数后的硒浓度。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中调整耐硒培养基的硒浓度是根据相邻批次耐硒培养基的硒浓度进行调整，当灵芝菌种生长出现下列情形之一时i)菌株生长周期延长至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的一倍以上；ii)菌种生物量下降至前一硒浓度的耐硒培养基培养时的30%以下，甚至不生长；iii)菌株明显变色；当相邻批次耐硒培养基的硒浓度差值大于预定阈值时，调整耐硒培养基的硒浓度为相邻批次耐硒培养基的硒浓度的平均值。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中PDA综合培养基每IOOml定容培养基中，所用原料为马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂1. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，KH2PO4 0. 3g, VBl 0. OOlg, pH 调至 6. 0。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中所述PDA综合培养基的配制方法包括先将应加入的马铃薯与蒸馏水混勻，保持沸腾30分钟后过滤，加入其他原料并充分混合后定容至所需体积的步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中硒源选自亚硒酸钠、硒酸钠或富硒酵母粉。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中梯度硒浓度的含硒培养基为硒浓度分别为10、30、50、80、100、120，140、160 mg/L的含硒培养基；当灵芝菌种完成160 mg/L含硒培养基的培养，制备高耐硒灵芝菌种。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述含硒液体发酵培养基的配方为每IOOml定容培养基中，所用原料为玉米粉lg，葡萄糖2g，麸皮汁3g， MgSO4 · 7H20 0. 2g，KH2PO4 0. 3g，175-263 mg 亚硒酸钠或 190-287 mg 硒酸钠，pH 为自然状态。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述含硒液体发酵培养基的硒含量为800-1200 mg/L，培养条件为温度为30°C，转速为150转/分的最优化条件下，进行灵芝液体富硒深层培养3-4天，即得高硒灵芝材料。
全文摘要
本发明公开了一种制备高硒灵芝材料的方法，包括以下步骤(1)将灵芝菌种接入PDA综合培养基中进行试管菌种培养得到初始菌悬液；(2)将硒源与PDA综合培养基混合分别配制成梯度硒浓度的含硒培养基，对含硒培养基进行灭菌处理，采用菌悬液接种方式将灵芝菌种接种到灭菌处理后的含硒培养基上按照硒浓度从低到高的顺序按照常用的灵芝菌种培养方式逐一硒浓度进行耐硒培养；首次耐硒培养使用的菌悬液为初始菌悬液，以后耐硒培养采用的菌悬液为当前硒浓度进行耐硒培养使用的菌悬液，依次类推；得到灵芝的最佳耐受硒浓度和高耐硒灵芝菌种；(3)将步骤(2)中获得的高耐硒灵芝菌种发酵培养即得高硒灵芝材料。经过灵芝菌种的高硒耐受性培养后，其在液体深层培养的状态下，对培养基中的硒含量的耐受性大幅提高。
文档编号A01G1/04GK102511304SQ20111040218
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者胡海涛, 袁林喜 申请人:苏州硒谷科技有限公司