专利名称：一种诱导毛脉蓼产生毛状根的方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导毛脉蓼产生毛状根的方法，利用植物组织培养技术和转基因技术通过农杆菌介导毛脉蓼试管苗叶片获得毛脉蓼毛状根，属于生物技术领域。
背景技术：
1982 年，Chilton 等人首次报道了发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) Ri 质粒在感染植物细胞时，通过细菌和植物细胞之间的附着，Vir基因(virulencegene)的激活和表达，其T-DNA (transferred DNA)片段被转移、插入并稳定地在植物细胞基因组中表达诱导植物细胞产生毛状根(hairy roots)。与培养细胞相比，毛状根培养具有激素自主性快速生长、分化，次生代谢物种类多、含量高，遗传性稳定，且在基因转移过程中无需标记基因等优点，使毛状根在生产植物次生代谢物和传统中药材有效成分方面具有很大的工业化生产潜力，并取得了飞速的发展。毛脉蓼(Λ^τ^ο/" ciliinerve (Nakai) Ohwi)，亦名朱砂七，别名朱砂莲、红药子，始载于《图经本草》，为蓼科蓼属的多年生缠绕草本植物，分布于中国东北及陕西(大巴山)、湖北、四川、贵州等省，海拔200 - 2700 m。毛脉蓼主要药用部位为根茎，含食用大黄甙 (rhapontin)、蒽醌类物质及鞣质，其味苦、性凉，功能清热解毒、活血凉血、止血止泻、去风湿、强腰膝，民间广泛用于治疗急性胃痛、胃肠炎、菌痢、扁桃体炎、尿路感染及跌打损伤、风湿腰痛等症，临床效果显著，为“太白七药”之一。目前毛脉蓼的药用价值已经得到临床证实，有关毛脉蓼的研究多集中在其药用有效成分的检测分离，未见利用发根农杆菌转化的毛脉蓼获得毛状根，继而进行其药用有效成分利用的报道。
发明内容
本发明的目的是以毛脉蓼叶片外植体为受体，利用含甘露碱型Ri质粒的发根农杆菌菌株w. T15834对其侵染转化，历经共培养、筛选培养、鉴定，诱导和培养获得毛脉蓼毛状根。本发明的实现过程如下
一种诱导毛脉蓼产生毛状根的方法，其以毛脉蓼叶片为外植体，通过发根农杆菌株 W. T15834对其诱导形成毛状根，培养得到大量毛脉蓼毛状根。具体诱导毛脉蓼产生毛状根的步骤如下
(1)选取在MS固体培养基上继代培养的毛脉蓼20天龄无菌苗的幼嫩叶片切成1.0cm2 大小的不具叶柄的叶片外植体，置于MS基本培养基上预培养Mh ；
(2)浸入用MS液体培养基稀释5倍的发根农杆菌W.T15834菌悬液中震荡，取出外植体，用无菌滤纸吸去多余菌液并放回原培养基上黑暗共培养5天；
(3)转入MS筛选培养基上，在25°C、每天14h散射光下培养诱导形成毛状根；
(4)切取从叶片外植体切口中脉处产生的毛状根，置于MS筛选培养基上除菌培养，每7天继代一次获得无菌毛脉蓼毛状根；
(5)毛脉蓼毛状根培养于MS固体或液体培养基上继代培养，最好在1/2MS液体培养基上，培养时间为4周。所述MS液体培养基组成为MS基本培养基，附加30 g/L蔗糖，pH为5. 8 6. 2。所述MS固体培养基组成为MS基本培养基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂，pH 为 5. 8 6. 2。所述MS筛选培养基组成为MS固体培养基，附加300 mg/L头胞噻肟钠，pH为 5. 8 6. 2。本发明的优点和积极效果
本发明利用离体培养建立无菌快繁体系的基础上，利用发根农杆菌转化毛脉蓼，可以获得大量毛脉蓼毛状根。对于用根的药用植物而言，根中的次生代谢产物含量高于其他组织，在体外建立根培养体系利于药用成分的提取利用。本发明所提供的毛脉蓼毛状根的诱导和培养方法，具有激素自主性快速生长、分化，增殖系数高，遗传稳定，取材方便，不受季节限制，具有培养时间短的优点，对于毛脉蓼转基因技术的完善，为毛脉蓼毛状根的大量培养及利用后期毛脉蓼毛状根的次生产物的生物转化具有积极作用。
图1毛脉蓼毛状根的诱导和培养，A叶片IOd诱导的毛状根，B MS固体继代培养的5 d的毛状根，C MS液体悬浮培养30 d的毛状根；
图2毛脉蓼毛状根中甘露碱的检测；1:甘露碱标品2:未转化植株根阴性对照3 7: 不同毛状根的单克隆；
图3毛脉蓼毛状根r^B基因PCR分析；M 分子量标记1 :Ri质粒阳性对照2 未转化植株的阴性对照3 7 不同毛状根的单克隆； 图4毛脉蓼毛状根MS固/液培养的生长曲线； 图5 MS固/液培养对毛脉蓼毛状根生长量的影响。
具体实施例方式以下通过实施例进一步描述本发明。本发明使用的MS培养基按手册通用方法配制，组成与含量如下大量元素NH4N03 1650mg/L, KNO3 1900 mg/L, CaCl2 · 2H20 440 mg/L, MgSO4 · 7H20 370mg/L, KH2PO4 1700mg/L ；微量元素KI 0. 83 mg/L, H3BO3 6. 2 mg/L, MnSO4 · 4H20 22. 3 mg/L, ZnSO4 · 7H208. 6 mg/L, Na2Mn04 · 2H20 0. 25 mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025 mg/L, CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L,FeSO4 ·7Η20 (27. 8)mg/L +Na2-EDTA ·2Η20 (27. 3)mg/L ；有机成分肌醇 IOOmg/ L，烟酸0.5 mg/L，盐酸吡哆醇(维生素 )0.5 mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1) 0. 5mg/L，甘氨酸2 mg/L。本发明使用的培养基组成如下
MS固/液体培养基组成为MS基本培养基，附加30 g/L蔗糖，pH为5. 8 6. 2 ；MS 固体培养基是在液体培养基中加入7 g/L琼脂。MS筛选培养基组成为MS固体培养基，附加300 mg/L头胞噻肟钠(cefotaxime)pH 为 5. 8 6. 2。YEB基本培养基组成为牛肉浸膏5 g/L，酵母浸膏1 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖5 g/ L，0. 002 mmol/L MgSO4. 7H20 ；
YEB固/液体培养组成为YEB基本培养基，附加lOOyg/mL链霉素(Str. )，pH7. 2 ;YEB 固体培养基是在液体培养基中加入15g/L琼脂。在本发明的下述实施实例中，所用菌株为发根农杆菌(A rhizogenes) M 株W. T15834，为陕西省生物技术重点实验室保存菌种；实验材料毛脉蓼(Polygonum ciliinerve (Nakai) Ohwi )采自西北大学生命科学学院生物园。实施例1 毛脉蓼毛状根诱导
1.细菌菌株及培养YEB固体培养基上暗培养发根农杆菌W. T15834后，挑取单菌落， 25°C活化J8°C，200 r/min黑暗震荡培养12h，转接到新鲜YEB液体培养基培养至0D_为 0.6时供感染用。2.外植体制备毛脉蓼20 d龄无菌苗的幼嫩叶片切成约1.0 cm2大小的不具叶柄的叶片外植体，并置于MS固体培养基上预培养24h后，用于转化。3.毛状根的诱导转化和诱导将上述预培养Mh的毛脉蓼叶片外植体浸入用MS 培养基稀释5倍的发根农杆菌W. T15834菌悬液中轻轻震荡lOmin，取出外植体，用无菌滤纸吸去多余菌液并放回原培养基上黑暗共培养5天后，转入MS筛选培养基上，在25°C、每天 14h散射光下培养诱导毛状根。发根农杆菌感染的叶片外植体培养10天后，从其叶片切口中脉处产生毛状根(图1，A)，随着培养时间的增加数量增多，毛状根产生频率约为35. 3%。 切下毛状根置于MS筛选培养基培养，每隔7天左右转接一次，5 6次后可完全除菌。之后可在MS固体培养基上快速自主生长(图1，B)，并且分枝较多，也可在MS液体培养基中快速生长(图1，C)。对照结果表明无菌苗的离体根(未用农杆菌感染)不能在MS固体培养基上自主生长，随着培养时间的延长而逐渐褐化坏死。实施例2 毛脉蓼毛状根甘露碱的检测
以非转化植株根为阴性对照，甘露碱标准品(1.02 mg/m /L)为阳性对照，参考王关林等的方法，检测转化毛根内的甘露碱。发根农杆菌W. T15834的Ri质粒TR-DNA (T-DNA右臂)区中编码冠瘿碱合成酶的基因可以整合到毛脉蓼基因组DNA中，并且在毛脉蓼细胞中得到表达出特异产物甘露碱(图2)。实施例3 毛脉蓼毛状根的PCR检测
1.植物DNA提取用微量CTAB法提取毛状根DNA，以非转化植株毛状根总DNA作为对照，纯化后用作PCR扩增的模板。2.发根农杆菌Ri质粒DNA提取取200μ1活化的发根农杆菌菌株W.T15834菌液，6000 r/min离心5min，收集沉淀菌体，加入40μ1裂解液(上海生工技术公司)，悬浮混勻，94°C裂解15min，13,000 r/min离心5min，取上清液备用。并取少量上清液测其OD6c 值为 0. 6。3. PCR反应反应体系20 μ L，其中DNA模板1 μ g，上下游引物各1 μ L(终浓度 20 pmol/L)，所用引物根据Ri质粒TL-DNA上存在的与毛状根发生相关基因r^B设计(上海生工技术公司合成)，上游引物为 &-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3’， 下游引物为 &-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3’。PCR反应程序为94°C预变性4min ；94°C变性40 s ；52°C退火55 s ；72°C，延伸1 min;循环5次；94°C变性50 s;50°C退火50 s ;72°C延伸1 min ;30次循环；72°C，延伸10 min0预期产物大小为564bp。扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳和KBr染色进行分析。PCR反应可以从毛脉蓼毛状根的基因组DNA中扩增到预期的564bp左右的特异性 DNA片段(图3)，即发根农杆菌W. T15834的rW基因的RiTL-DNA部分已整合在毛脉蓼基因组中。实施例4 毛脉蓼毛状根的MS固/液体培养
切取MS筛选培养基鉴定的毛状根各约0. 5克，分别于MS固/液体培养基上，在^rc, 暗培养/lOOr/min震荡培养，除菌、筛选培养，定期收集，滤纸吸干水分后进行鲜重和干重测量，统计分析固/液体培养的生长曲线及对毛状根生长的影响。毛脉蓼无菌毛状根MS固 /液体培养时的生长曲线(图4)结果得知其生长可基本分成3个阶段，即前2周的快速生长阶段，3 5周的持续增长5周后生长速度减慢，以此毛脉蓼毛状根培养的最佳继代培养时间为4周。培养方式对毛脉蓼毛状根生长有影响。无菌毛状根在MS固/液体培养基上均能快速生长，但在MS液体培养中的生长速度比MS固体培养的要快，1/2MS液体培养中生长速度最快，效果优于MS液体或固体培养。继代3次后，1/2MS液体培养的毛状根的鲜重和干重分别为MS固体培养的2. 72,2. 47倍，是MS液体培养的1. 26,1. 17倍(图5)。本发明所提供的毛脉蓼毛状根的诱导和培养方法，具有激素自主性快速生长、分化，增殖系数高，发根农杆菌转化后10天可以产生毛状根，产生频率约为35. 3%，最佳继代培养条件为1/2MS液体培养，4周收获，短时间内可以得到大量毛脉蓼毛状根，具有遗传稳定，取材方便，不受季节限制，具有培养时间短的优点。对于毛脉蓼转基因技术的完善，为毛脉蓼毛状根的大量培养和及利用后期毛脉蓼毛状根的次生产物的生物转化具有积极作用。
权利要求
1.一种诱导毛脉蓼产生毛状根的方法，其特征在于以毛脉蓼叶片为外植体，通过发根农杆菌株w. T15834对其诱导形成毛状根，培养得到大量毛脉蓼毛状根。
2.根据权利要求1所述的诱导毛脉蓼产生毛状根的方法，其特征在于包括以下步骤(1)选取在MS固体培养基上继代培养的毛脉蓼20天龄无菌苗的幼嫩叶片切成1.0cm2 大小的不具叶柄的叶片外植体，置于MS基本培养基上预培养Mh ；(2)浸入用MS液体培养基稀释5倍的发根农杆菌W.T15834菌悬液中震荡，取出外植体，用无菌滤纸吸去多余菌液并放回原培养基上黑暗共培养5天；(3)转入MS筛选培养基上，在25°C、每天14h散射光下培养诱导形成毛状根；(4)切取从叶片外植体切口中脉处产生的毛状根，置于MS筛选培养基上除菌培养，每7 天继代一次获得无菌毛脉蓼毛状根；(5)毛脉蓼毛状根培养于MS固体或液体培养基上继代培养。
3.根据权利要求2所述的诱导毛脉蓼产生毛状根的方法，其特征在于MS液体培养基组成为MS基本培养基，附加30 g/L蔗糖，pH为5. 8 6. 2。
4.根据权利要求2所述的诱导毛脉蓼产生毛状根的方法，其特征在于MS固体培养基组成为MS基本培养基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂，pH为5. 8 6. 2。
5.根据权利要求4所述的诱导毛脉蓼产生毛状根的方法，其特征在于MS筛选培养基组成为=MS固体培养基，附加300 mg/L头胞噻肟钠，pH为5. 8 6. 2。
6.根据权利要求2所述的诱导毛脉蓼产生毛状根的方法，其特征在于毛脉蓼毛状根继代培养时间为4周。
7.根据权利要求2所述的诱导毛脉蓼产生毛状根的方法，其特征在于毛脉蓼毛状根继代培养于1/2MS液体培养基上。
全文摘要
本发明公开了一种诱导毛脉蓼产生毛状根的方法，其以毛脉蓼叶片为外植体，通过发根农杆菌株W.T15834对其诱导形成毛状根，培养得到大量毛脉蓼毛状根。本发明利用离体培养建立无菌快繁体系的基础上，利用发根农杆菌转化毛脉蓼，可以获得大量毛脉蓼毛状根。本发明毛脉蓼毛状根的诱导和培养方法，具有激素自主性快速生长、分化，增殖系数高，遗传稳定，取材方便，不受季节限制，具有培养时间短的优点，对于毛脉蓼转基因技术的完善，为毛脉蓼毛状根的大量培养及利用后期毛脉蓼毛状根的次生产物的生物转化具有积极作用。
文档编号A01H5/06GK102517322SQ20111042071
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者步怀宇, 王英娟 申请人:西北大学