专利名称：一种红皮云杉离体快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种植物组织培养的方法，尤其是红皮云杉离体快速繁殖方法。
背景技术：
红皮云杉(Picea koraiensis Nakai)又名红皮臭,是松科云杉属常绿乔木,树冠尖塔形，大枝斜伸或平展，小枝上有明显的木针状叶枕；芽长圆锥形，叶锥形，先端尖，多辐射伸展，横切面菱形，四面有气孔线。球果卵状圆柱形或圆柱状矩圆形，熟后绿黄的褐或褐色；种鳞薄木质，三角倒卵形，种子上端有膜质长翅。分布于东北小兴安岭、吉林山区海拔1400-1800米地带，朝鲜及乌苏里地区亦产。较耐荫，浅根性。适应性较强，在分布区内除沼泽化地带及干燥的阳坡、山脊外，在不同立地条件下均能生长。该树种姿态优美，具观赏特性和园林布景。目前，红皮云杉繁殖主要通过种子、扦插以及组培繁殖，然而由于种子繁殖变异率较高，扦插繁殖主要以3 6年生苗的插穗为材料生产扦插苗，培育周期长， 另外，因为从每个幼树可采集的插穗的数量有限，扦插繁殖的繁殖率也低，对于组培繁殖， CN101228848公开了一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生的方法，其主要通过取经过预处理的红皮云杉合子胚接种于改良RJW培养基中，获得胚性愈伤组织后经反复培养，在获得体细胞胚之后再接种到RJW培养基中，培养至根和茎的形成，即得到红皮云杉再生植株，然而其对操作要求高，培育周期长，影响了繁殖效率。
发明内容
本发明的目的是为了解决红皮云杉繁殖周期长、操作要求高、繁殖率低的问题，而提供的一种红皮云杉离体快速繁殖的方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种红皮云杉离体快速繁殖的方法，该方法包括如下步骤1、外植体诱导材料消毒的方法在生长季节选取生长旺盛红皮云杉的3 4厘米长的顶芽或带侧芽的茎段为外植体，将嫩芽依次在75%的酒精、O. 15%的 HgCl2,1. 5%的次氯酸钠溶液中进行消毒灭菌处理，其时间依次是消毒20-40秒，灭菌10-30 分钟，再消毒10-20分钟，最后用无菌水漂洗至少2次；2、不定芽诱导和继代增殖将经过消毒灭菌后的上述嫩芽在无菌工作环境中接种于下列诱导培养基中3/4MS培养基、6-BA O. 0-2. 0mg/L、0. 3-1. Omg/L 玉米素 ZT、鹿糖 30_40g/L、活性炭 lmg/L、琼脂 7_8g/L ;培养条件为:控制PH为6. 5，温度20-250C，13-15小时的光周期，光照强度1200-1800LX，经10-20 天培养便可得以诱导芽分化；将诱导出的不定芽切割后再继代培养在相同的培养基中在相同的条件下增殖，20-30天为I个继代增殖周期，每I个继代增殖周期由I个芽可增殖形成 3 4个芽；3、丛生芽诱导将继代培养得到的不定芽接种于下列诱导培养基中进行丛生芽诱导1/21^培养基、赤霉素0.01-0. lmg/L、萘乙酸O. 01-0. lmg/L、蔗糖30_40g/L、活性炭 lmg/L、琼脂7-8g/L ;培养条件为控制PH为6. 5，温度18-22°C，11-12小时的光周期，光照强度1000-1500LX，经10-15天培养便可得以诱导丛生芽；4、生根培养将丛生芽诱导得到的不定芽接种于下列诱导培养基中进行生根诱导1/2MS培养基、吲哚丁酸O. 1-1. Omg/L、萘乙酸O. 01-0. lmg/L、蔗糖30-40g/L、活性炭lmg/L、琼脂7_8g/L ;培养条件为控制PH为 6. 5，温度18-20°C，16-18小时的光周期，光照强度1400-1600LX，经20-25天培养便可生出根毛，生根率可达90-95%，每个分化芽有根4 5条；5、试管苗移栽当不定根长至I. O厘米时，打开瓶口的封口膜，在光照培养室内炼苗3-4天，然后用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入装有基质的容器内。本发明的有益效果主要体现在
1、提供红皮云杉离体组培快繁的成套技术，实现了红皮云杉的规模化生产；
2、本申请采用新芽或茎段作为外植体，对操作要求低，一般的技术人员都可以操作；
3、进行不同培养阶段的激素调节，采取激素混用和轮用，结合有效的灭菌技术，达到提闻增殖率和减少变异的目的。4、缩短了繁殖周期，在保证了成活率的基础上，提高了繁殖效率，增加了经济效
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具体实施例方式具体实施方式
一该具体实施方式
包括如下步骤1、外植体诱导材料消毒的方法在生长季节选取生长旺盛红皮云杉的3 4厘米长的顶芽或带侧芽的茎段为外植体，将嫩芽依次在75%的酒精、O. 15%的HgCl2U. 5%的次氯酸钠溶液中进行消毒灭菌处理，其时间依次是消毒20-40秒，灭菌10分钟，再消毒10-20分钟，最后用无菌水漂洗至少2次；2、不定芽诱导和继代增殖将经过消毒灭菌后的上述嫩芽在无菌工作环境中接种于下列诱导培养基中3/4MS培养基、6-BA 2. Omg/LU. Omg/L玉米素ZT、蔗糖30_40g/L、活性炭lmg/L、琼脂7-8g/L ;培养条件为:控制PH为6. 5，温度20-25°C，13小时的光周期，光照强度1800LX, 经20天培养便可得以诱导芽分化；将诱导出的不定芽切割后再继代培养在相同的培养基中在相同的条件下增殖，22天为I个继代增殖周期，每I个继代增殖周期由I个芽可增殖形成3 4个芽；3、丛生芽诱导将继代培养得到的不定芽接种于下列诱导培养基中进行丛生芽诱导1/2MS培养基、赤霉素0.01mg/L、萘乙酸O. lmg/L、蔗糖30_40g/L、活性炭Img/ L、琼脂7-8g/L ;培养条件为:控制PH为6. 5，温度18-22°C，11-12小时的光周期，光照强度 1000LX，经15天培养便可得以诱导丛生芽；4、生根培养将丛生芽诱导得到的不定芽接种于下列诱导培养基中进行生根诱导1/2MS培养基、吲哚丁酸I. Omg/L、萘乙酸0. lmg/L、蔗糖30-40g/L、活性炭lmg/L、琼脂7-8g/L ;培养条件为控制PH为6. 5，温度18_20°C，16-18 小时的光周期，光照强度1400-1600LX，经25天培养便可生出根毛，生根率可达90%，每个分化芽有根4 5条；5、试管苗移栽当不定根长至I. O厘米时，打开瓶口的封口膜，在光照培养室内炼苗3-4天，然后用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入装有基质的容器内，基质由体积比珍珠岩23% :蛭石30% :腐殖土 47组成。
具体实施方式
二 该具体实施方式
包括如下步骤1、外植体诱导材料消毒的方法在生长季节选取生长旺盛红皮云杉的3 4厘米长的顶芽或带侧芽的茎段为外植体，将嫩芽依次在75%的酒精、0. 15%的HgCl2U. 5%的次氯酸钠溶液中进行消毒灭菌处理，其时间依次是消毒20-40秒，灭菌15分钟，再消毒10-20分钟，最后用无菌水漂洗至少2次；2、不定芽诱导和继代增殖将经过消毒灭菌后的上述嫩芽在无菌工作环境中接种于下列诱导培养基中3/4MS培养基、6-BA 2. Omg/L,O. 6mg/L玉米素ZT、蔗糖30_40g/L、活性炭lmg/L、琼脂 7-8g/L ;培养条件为:控制PH为6. 5，温度20-250C，14小时的光周期，光照强度1500LX，经 10天培养便可得以诱导芽分化；将诱导出的不定芽切割后再继代培养在相同的培养基中在相同的条件下增殖，25天为I个继代增殖周期，每I个继代增殖周期由I个芽可增殖形成3 4个芽；3、丛生芽诱导将继代培养得到的不定芽接种于下列诱导培养基中进行丛生芽诱导1/2MS培养基、赤霉素O. 05mg/L、萘乙酸O. 05mg/L、蔗糖30_40g/L、活性炭Img/ L、琼脂7-8g/L ;培养条件为:控制PH为6. 5，温度18-22°C，11-12小时的光周期，光照强度 1300LX，经10天培养便可得以诱导丛生芽；4、生根培养将丛生芽诱导得到的不定芽接种于下列诱导培养基中进行生根诱导1/2MS培养基、吲哚丁酸O. 5mg/L、萘乙酸O. 05mg/L、蔗糖30-40g/L、活性炭lmg/L、琼脂7-8g/L ;培养条件为:控制PH为6. 5，温度18-20°C，16-18 小时的光周期，光照强度1400-1600LX，经20天培养便可生出根毛，生根率可达93%，每个分化芽有根4 5条；5、试管苗移栽当不定根长至I. O厘米时，打开瓶口的封口膜，在光照培养室内炼苗3-4天，然后用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入装有基质的容器内，所述基质由体积比珍珠岩30% :蛭石20% :腐殖土 50%组成。
具体实施方式
三该具体实施方式
包括如下步骤1、外植体诱导材料消毒的方法在生长季节选取生长旺盛红皮云杉的3 4厘米长的顶芽或带侧芽的茎段为外植体， 将嫩芽依次在75%的酒精、O. 15%的HgCl2U. 5%的次氯酸钠溶液中进行消毒灭菌处理，其时间依次是消毒20-40秒，灭菌30分钟，再消毒10-20分钟，最后用无菌水漂洗至少2次；
2、不定芽诱导和继代增殖将经过消毒灭菌后的上述嫩芽在无菌工作环境中接种于下列诱导培养基中3/4MS培养基、6-BA 2. Omg/L,O. 3mg/L玉米素ZT、蔗糖30_40g/L、活性炭lmg/ L、琼脂7-8g/L ;培养条件为控制PH为6. 5，温度20_25°C，15小时的光周期，光照强度 1200LX，经15天培养便可得以诱导芽分化；将诱导出的不定芽切割后再继代培养在相同的培养基中在相同的条件下增殖，30天为I个继代增殖周期，每I个继代增殖周期由I个芽可增殖形成3 4个芽；3、丛生芽诱导将继代培养得到的不定芽接种于下列诱导培养基中进行丛生芽诱导1/2MS培养基、赤霉素O. lmg/L、萘乙酸O. 01mg/L、蔗糖30_40g/L、活性炭lmg/L、琼脂7-8g/L ;培养条件为控制PH为6. 5，温度18-22 °C，11-12小时的光周期，光照强度1500LX，经12天培养便可得以诱导丛生芽；4、生根培养将丛生芽诱导得到的不定芽接种于下列诱导培养基中进行生根诱导1/2MS培养基、吲哚丁酸O. lmg/L、萘乙酸O. 01mg/L、蔗糖30-40g/L、活性炭lmg/L、琼脂7_8g/L ;培养条件为控制PH为6. 5，温度 18-200C，16-18小时的光周期，光照强度1400-1600LX，经23天培养便可生出根毛，生根率可达95 %，每个分化芽有根4 5条；5、试管苗移栽当不定根长至I. O厘米时，打开瓶口的封口膜，在光照培养室内炼苗3-4天，然后用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入装有基质的容器内，所述基质由体积比珍珠岩23-30% :蛭石20-30% :腐殖土 47-55% 组成。本实施方式中，红皮云杉顶芽或带侧芽的茎段经10-20天培养便可得以诱导芽分化，20-30天为I个继代增殖周期，经10-15天培养便可得以诱导丛生芽，经20-25天培养便可生出根毛，生根率最高达到了 95%，整个繁殖周期最短达到了 40天，相对于现有技术缩短了繁殖周期，提高了繁殖效率，增加了经济效益。
权利要求
1.一种红皮云杉离体快速繁殖的方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)、外植体诱导材料消毒的方法在生长季节选取生长旺盛红皮云杉的3 4厘米长的顶芽或带侧芽的茎段为外植体，将嫩芽依次在75%的酒精、O. 15%的HgCl2U. 5%的次氯酸钠溶液中进行消毒灭菌处理，其时间依次是消毒20-40秒，灭菌10-30分钟，再消毒10-20 分钟，最后用无菌水漂洗至少2次；2)、不定芽诱导和继代增殖将经过消毒灭菌后的上述嫩芽在无菌工作环境中接种于下列诱导培养基中3/4MS培养基、6-BA O. 0-2. 0mg/L、0. 3-1. Omg/L玉米素ZT、蔗糖 30-40g/L、活性炭lmg/L、琼脂7-8g/L ;培养条件为:控制PH为6. 5，温度20_25°C，13-15小时的光周期，光照强度1200-1800LX，经10-20天培养便可得以诱导芽分化；将诱导出的不定芽切割后再继代培养在相同的培养基中在相同的条件下增殖，20-30天为I个继代增殖周期，每I个继代增殖周期由I个芽可增殖形成3 4个芽；3)、丛生芽诱导将继代培养得到的不定芽接种于下列诱导培养基中进行丛生芽诱导 1/2MS 培养基、赤霉素 O. 01-0. lmg/L、萘乙酸 O. 01-0. lmg/L、蔗糖 30_40g/L、活性炭 lmg/L、 琼脂7-8g/L ;培养条件为控制PH为6. 5，温度18-220C，11-12小时的光周期，光照强度 1000-1500LX，经10-15天培养便可得以诱导丛生芽；4)、生根培养将丛生芽诱导得到的不定芽接种于下列诱导培养基中进行生根诱导 1/2MS 培养基、吲哚丁酸 O. 1-1. Omg/L、萘乙酸 O. 01-0. lmg/L、蔗糖 30_40g/L、活性炭 Img/ L、琼脂7-8g/L ;培养条件为控制PH为6. 5，温度18_20°C，16-18小时的光周期，光照强度 1400-1600LX，经20-25天培养便可生出根毛，生根率可达90-95 %，每个分化芽有根4 5 条;5)、试管苗移栽当不定根长至I.O厘米时，打开瓶口的封口膜，在光照培养室内炼苗 3-4天，然后用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入装有基质的容器内。
2.根据权利要求I所述的方法，步骤2中所述丛生芽诱导培养基为3/4MS培养基、6-BA 2. 0mg/L>0. 6-1. Omg/L 玉米素 ZT、鹿糖 30_40g/L、活性炭 lmg/L、琼脂 7_8g/L。
3.根据权利要求I所述的方法，步骤4中所述生根培养基为1/2MS培养基、吲哚丁酸O.5mg/L、萘乙酸 O. 05mg/L、鹿糖 30_40g/L、活性炭 lmg/L、琼脂 7_8g/L。
4.根据权利要求I所述的方法，步骤5中所述基质由体积比珍珠岩23-30%:蛭石 20-30% :腐殖土 47-55% 组成。
全文摘要
一种红皮云杉离体快速繁殖的方法，该方法包括如下步骤1)外植体诱导材料消毒的方法；2)不定芽诱导和继代增殖；3)丛生芽诱导；4)生根培养；5)试管苗移栽。利用本方法，经10-20天培养便可得以诱导芽分化，20-30天为1个继代增殖周期，经10-15天培养便可得以诱导丛生芽，经20-25天培养便可生出根毛，生根率最高达到了95%，整个繁殖周期最短达到了40天，相对于现有技术缩短了繁殖周期，提高了繁殖效率，增加了经济效益。
文档编号A01H4/00GK102577964SQ20121005002
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者王振芳 申请人:常熟市方园纺织器材厂