专利名称：一种获自大豆的根特异性兼伤害诱导型启动子的制作方法
技术领域：
该发明涉及植物基因启动子及其应用，提供了一种获自大豆的根特异性兼伤害诱导型启动子。属于生物技术领域，尤其涉及农作物抗病虫害、抗逆、高产或品质改良等基因工程领域。
背景技术：
大豆(Glycine max L. Merrill)是重要的油料作物和经济作物,在我国农业生产乃至整个国民经济中均具有重要地位。大豆生产中，长期以来一直存在多种病虫害，其中以大豆灰斑病、疫霉根腐病、霜霉病、大豆根结线虫病等最为严重,真菌病及虫害是导致大豆品质和产量下降的重要原因。通过基因工程技术将相关抗性基因导入大豆，是当今提高大豆抗病性及生产力的有效策略。目前，大量优良新基因被分离克隆，但植物基因工程中较为广泛使用的启动子有来自花椰菜花叶病毒的CaMV 35S启动子，来自植物本身的Actl、Ubil等启动子(Sanderset al. , 1987 ；McElroy et al. ,1990)。这些均是组成型启动子。由于组成型启动子驱动的基因在植物不同组织器官中均有不同程度的表达，应用中逐渐暴露出一些问题。在多数情况下，人们并不希望外源基因在转基因植物整个植株、整个生育期中广泛表达，因为一方面会增加植株的代谢负担，另一方面，有些外源蛋白对植物并非必须甚至有毒，不利于植物正常生长(Kasuga et al.，1999)。因此，研究和利用组织器官特异型启动子和诱导型启动子显得尤为重要，不仅可以实现对外源基因表达施行时、空、量的三维调控，同时具有经济、环保及生物安全等多方面的潜在价值(Venter，2007)。组织特异性或诱导表达启动子一直以来都是植物基因工程研究的重点和难点。组织特异性启动子可以使外源基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性。目前，大多数组织特异启动子的研究主要集中在植物的地上部分，根特异启动子的研究和应用还很少(Potenza et al. ,2004)。然而,植物的根部是唯一生长于地下部的器官，它不仅具有吸收、运输、贮存养分的重要作用，也是与土壤中病原物最先接触的部分，还是在某些逆境条件下植物自身防卫系统的一部分，因此根部特异启动子在植物抗病以及抗逆性改良和植物品质改良中有良好的应用价值。随着研究的深入，相继报道了一些植物根特异的启动子(Xu et al. , 1995 ；Schiinmann et al. , 2004 ；delCampillo,2004 ；Koyama et al.，2005 ;Nitz et al. ,2001 ；Vijaybhaskar et al. ,2008 ；Liu et al.，2003 ;Winicov et al.，2004)。然而，能够在基因工程遗传改良和农业生产中应用的仍然很少。诱导型启动子可以使外源基因对某些信号产生响应，只在特殊信号刺激下表达。植物伤害或病原菌诱导型启动子的研究很多，是植物生物技术领域的一个研究热点。植物受病原菌侵染会诱导产生多种防卫反应，尤其是产生病程相关蛋白(PR蛋白Pathogenesis-Related Proteins),几丁质酶是主要的植物PR蛋白之一，通过对真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解，抑制真菌的生长增殖，从而提高植物的抗真菌能力，在植物抵御真菌病害的防卫反应中发挥着重要作用(Boiler et al.，1983)。几丁质酶广泛存在于各种植物中，参与植物的发育调控，如开花、结实等；还参与植物的抗病以及抗虫等过程(Kasprzewska, 2003)。研究表明几丁质酶在植物正常生长情况下表达量极低或不表达，但在受到病原菌、伤害及信号分子诱导时表达量迅速增加(Xu et al. ,2007 ；Whipps et al.，2008)，快速而强烈的诱导反应特性暗示其启动子在植物基因工程中具有重要的实用价值。目前已从拟南芥等几种植物中获得了几丁质酶基因的启动子序列，并对其诱导调控特性进行了鉴定如拟南芥酸性几丁质酶基因启动子是一种真菌病原物诱导启动子，可受立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)诱导；在转基因番爺中，受番爺早疫病菌 (Alternaria solani)诱导表达(Samac and Shah, 1991)。山葡萄 ClassIII 几丁质酶基因VCH3启动子受外源施加SA诱导在维管组织中特异性的高效表达，并且表达量的大小与VCH3启动子中含有的SA顺式作用元件的数量成正比(Li et al.，2005)。吴雪峰等发现芥菜Class I几丁质酶基因启动子BjCHIl能驱动⑶S基因在转基因烟草和拟南芥中响应伤害、MeJA, NaCl和PEG等生物和非生物因素的强烈诱导，并首次证明其中的T/G-box (AACGTG)序列赋予 BjCHIl 启动子的 MeJA 诱导特性(Wu et al. ,2009) 辣椒 classII几丁质酶基因CAChi2启动子驱动的⑶S基因受病菌侵染、渗透胁迫和SA的诱导强烈表达(Hong and Hwang, 2011)。但上述启动子序列间同源程度低,启动子内存在的对外界环境条件应答反应的调控元件有所区别，各启动子存在着诱导启动活性差异。到目前为止，对几丁质酶基因启动子的调控机理所进行的遗传转化研究仅局限在少数模式植物上，对农作物的实用性研究却很少，更未见其在大豆中进行遗传转化的报道。植物基因工程技术的成功应用不仅需要大量调控不同水平的启动子，而且需要适合于不同植物背景、不同的器官、组织、转基因类型的启动子以避免在转基因过程中的不利影响。在大豆的高产、品质改良及抗病虫害基因工程遗传载体构建中能够选用的植物内源的组织特异或诱导型启动子仍然很少，因此，从大豆中发掘更多的根特异和/或伤害诱导型启动子对基础研究和生产应用具有重要的意义。大豆生产过程中深受各种真菌病虫害的危害，大豆几丁质酶同样也受到病原菌、伤害及激发子等的诱导表达(Liubas，2001 ;Gijzen et al.，2001)，因此，发明者深感调控大豆几丁质酶基因的启动子极具研究价值。通过发明者的努力，成功的分离到大豆几丁质酶基因启动子(GmChilp)，并且通过实验证明本发明的启动子具有根组织特异性，且可受伤害强烈诱导表达，能作为植物源的根特异性兼伤害诱导型表达载体，在农作物品质改良及抗病虫害基因工程中有很好的应用前景。文中所用的参考文献具体如下I. Boiler T，Gehri A，Mauch F，et al. Chintinase in bean leaves !inductionby ethylene, purification,properties, and possible function[J] · Planta，1983，157 :22-31.2. del Campillo E, Abdel-Aziz A, Crawford D，et al. Root cap specificexpression of an endo-β -1，4-D-glucanase(cellulase) a new marker to study rootdevelopment in Arabidopsis, Plant Molecular Biology，2004，56 :309_3233.Gijzen M，Kuflu K，Qutob D，et al. A class I chitinase from soybean seedcoat. J Exp Bot.，2001，52 :2283_2289
4. Hong JK and Hwang BK. Promoter activation of pepper class II basicchitinase gene， CAChi2, and enhanced bacterial disease resistance and osmoticstress tolerance in the CAChi2-overexpressing Arabidopsis. Planta,2011,10. 1007/s00425-005-0099-6 (on line)
5.Kasprzewska A. . Plant chitinases-regulation and function. Cell MolBiol Lett. ，2003，8 :809-8246. Kasuga M，Liu Q，Miura S，Yamaguchi-Schinozaki K，and ShinozakiK.Improving plant drought， salt， and freezing tolerance by gene transfer of asingle stress-induciable transcription factor. Nat Biotechnol，1999，17 :287-2917. Koyama T，Ono T，Shimizu M，et al. Promoter of Arabidopsis thalianaphosphate transporter gene drive root-specific expression of transgene in rice.J Biosci Bioeng，2005，99 :38-428. Li HY,Qi J,Shu HR,et al. Isolation and Characterization of a ChitinaseGene VCH3 Promoter from Grapevine (Vitis amurensis)Journal of Plant Physiologyand Molecular Biology 2005,31(5) :485-4919. Liu JJ，EkramoddoulIah AK. Root-specific expression of a western whitepine PRlO gene is mediated by different promoter regions in transgenic tobacco.Plant Mol Biol，2003，52 :103-12010. Liubas KS.The influence of fusarium oxysporum infection and lowtemperatures on the activity of soybean esterase and PR proteins[J]. Icel AgrSci，2001，14 :67-73.11. McElroy D，Zhao W，Cao J，et al. Isolation of an efficient actinpromoter for use in rice transformation. Plant Cell，1990，2 :163-17112. Nitz LBerkefeld H，Puzio PS, et al.PyklO，a seedling and root specificgene and promoter form Arabidopsis thaliana. Plant Sci.，2001，161 :337-34613. Potenza C，Aleman L，Sengupta-Gopalan C. Targeting transgeneexpression in research， agricultural， and environmental applications !promotersused in plant transformation. In Vitro Cell Dev Biol.，2004，40 :1-2214. Samac DA and Shah DM. Developmental and pathogen-induced activationof the Arabidopsis acidic chitinase promoter[J]. Plant Cell，1991，3 :1063-107215.Sanders PR，Winter JA，Barnason AR，et al. Comparison of cauliflowermosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants. NucleicAcids Res，1987，15 :1543-1558 ；16. Schiinmann PHD，Richardson AE, Smith FW, et al. Characterization ofpromoter expression patterns derived from the Phtl phosphae transporter genesof barley(Hordeum vulgare L.). J Exp Bot.，2004，55 :855-86517. Venter M. Synthetic promoters genetic control through cisengineering. Trends Plant Sci，2007，12 :118-12418. Vijaybhaskar V，Subbiah V，Kaur J，et al. Identification of aroot-specific glycosyItransferase from Arabidopsis and characterization of itspromoter. J. Biosci.，2008，33 :1852-19319. Whipps JM, Hand P，Pink D，et al. Phyllosphere microbiology withspecial reference to diversity and plant genotype. J Appl Microbiol.，2008，105 :1744-1755.20. Winicov I, Valliyodan B，Xue L，et al.The MsPRP2 promoter enablesstrong heterologous gene expression in a root-specific manner and is enhancedby overexpression of Alfin I. Planta，2004，219 :925_93521. Wu XFiWang CL，Xie EB,et al. Molecular cloning and characterization ofthe promoter for the multiple stress—inducible gene BjCHIl from Brassicajuncea.Planta,2009,229 :1231_124222. Xu FH, Fan CM，He YQ, et al. Chitinases in Oryza sativa ssp. japonicaand Arabidopsis thaliana[J]· J. Genet. Genomics，2007，34(2) :138_15023. Xu Y，Buchholz WG, DeRose RT, et al. Characterization of a rice genefamily encoding root-specific proteins. Plant Mol Biol.，1995，27 :237_248
发明内容
本发明的目的旨在克服已有技术的不足，一是提供一种获自大豆的根特异性兼伤害诱导型启动子，二是提供一种该启动子的重组载体，三是提供用该重组载体制备的转化子，四是提供该根特异性兼伤害诱导型启动子、重组载体及转化子的应用。本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现本发明提供一种新的根特异性兼伤害诱导型启动子，由具有SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的DNA。此处的诱导是指伤害诱导(如虫害)。本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现该重组载体其中含有上述目的之一的获自大豆的根特异性兼伤害诱导型启动子，包含用于作物品质改良的结构基因和/或调控基因、或者抗真菌病虫害的结构基因和/或调控基因从而使其在根特异性兼伤害诱导型启动子下发挥作用。本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现该转化子是将权力要求2中所述载体导入宿主制得。本发明的目的之三还可通过如下技术措施来实现所述的宿主为植物体。本发明的目的之四可通过如下技术措施来实现该获自大豆的根特异性兼伤害诱导型启动子、重组载体和转化子应用于植物品质改良、抗病虫害基因工程的产业制备。它可以驱动外源基因在转基因植物根系特异表达或在转基因植物中受伤害诱导表达，可以替代35S启动子应用于农业生物技术育种，以提高作物抗病、抗虫性状、抗非生物逆境及作物高产、品质改良。本发明以烟草为例作进一步说明本发明获得了一种在双子叶植物如烟草中有效发挥作用的根特异性兼伤害诱导型启动子，实现了该启动子驱动外源基因在烟草根系的组织特异表达，并且在烟草叶片、花、花柄中均具有高效的伤害诱导表达特性。通过将本发明的根特异性兼伤害诱导型启动子与GUS报告基因融合并跟踪GUS酶在有无诱导处理下烟草植株内的表达情况，就可以确定该启动子在烟草植株中的根特异兼伤害诱导表达模式。本发明的根特异性兼伤害诱导型启动子是由以下方法获得的根据GenBank 中已报道的 大Class I 几丁质酶基因(chitinase, GmChil)(GenBank AF202731. I)序列，在大豆数据库中(http://soybase.org/SequenceIntro.Php)搜索并确定GmChil基因5’上游启动子区，设计特异引物，提取大豆基因组进行PCR扩增，得到的片段进行序列测定，结果表明与大豆数据库中的序列相似度达99.8%，从而克隆出GmChil基因起始密码子上游1641bp的上游调控序列，包含部分5’ UTR区。将克隆的I. 64Kb调控区构建入植物表达载体PCAMBIA1391Z中，得到由GmChil基因启动子驱动⑶S基因表达的pCAM1391Z-GmChilp重组表达载体。然后将pCAM1391Z-GmChilp重组质粒用冻融法转化农杆菌EHA105，利用叶圆盘法对烟草进行遗传转化。对转基因植株进行GUS组织化学染色，证明该启动子是根组织特异启动子；对伤害处理的转基因植株进行GUS组织化学染色，证明该启动子为伤害诱导型启动子。该发明的优点在于获得了一种新型的根特异性兼伤害诱导型启动子，该启动子可以驱动外源基因在转基因植物根系中高效特异表达，而且也被伤害高效诱导表达，适合构建植物表达载体用于作物抗病虫或抗逆性改良和作物高产、品质改良。
图I :GmChiIp启动子克隆和载体构建酶切验证；泳道M ffide Range DNAMarker (500-12，000);泳道I :pMD18-T_GmChilp质粒酶切验证；泳道2 :大豆基因组GmChilp PCR扩增结果；泳道3 :pCAM1391Z_GmChilp质粒酶切验证。图2 :植物表达载体pCAM1391Z和pCAM1391Z_GmChilp构建示意图。图3、pCAM1391Z-GmChilp 转基因烟草 Ttl 代植株的 PCR 鉴定；泳道 M DNA Marker2000 ；泳道CK+ :质粒pCAM1391Z-GmChilp为模板的PCR阳性对照；泳道CIT ddH20为模板的空白对照；泳道0 :未转基因烟草基因组DNA为模板的负对照；泳道I 33 :pCAM1391Z-GmChilp转基因烟草Ttl代植株的基因组DNA为模板的PCR产物；559bp为Hyg基因的PCR结果；706bp为Gus基因的PCR结果。图4、GmChilp启动子的生物信息学分析图5、pCAM1391Z-GmChilp转基因烟草植株中的⑶S组织化学染色结果；其中A为无处理的Ttl代转基因烟草植株(生根小苗)的染色结果，B为取整花先染色后再切开观察的染色结果。图6、pCAM1391Z-GmChilp转基因烟草植株中GmChilp启动子的伤害诱导表达结果；其中A为未转基因烟草叶片用牙签扎孔损伤I小时后染色结果，B为叶片用刀片切开或用牙签扎孔损伤I小时后染色结果，C为整花用刀片纵向切开后马上染色结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用引物序列由上海生工生物技术有限公司合成。实施例I :大豆几丁质酶基因启动子-GmChilp的克隆和序列分析根据GenBank中已报道的大 Class I几丁质酶基因(Chitinase, GmChil)(GenBank AF202731. I)序列，在大豆数据库中(http://soybase.org/SequenceIntro.Php)搜索并确定GmChil基因5’上游启动子区，设计特异引物。上游引物5， CCCTAACTAGGAATTTAGCCACTCA3，下游引物5，GAAAGAAACGGTGTATGATGTGAAT3’以大豆“Jungery”基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备GmChil基因启动子片段。PCR反应体系
权利要求
1.一种获自大豆的根特异性兼伤害诱导型启动子GmChilp，是下述核苷酸序列之一 1)序列表中SEQID NO. I所示的DNA序列； 2)在严格条件下，可与序列表中SEQID NO. I限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的启动子，其特征在于，该启动子能够使目的基因在植物根部特异高效表达。
3.根据权利要求I所述的启动子，其特征在于，该启动子能被伤害诱导表达。
4.含有权利要求I 3之一所述启动子的重组表达载体。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在PCAMBIA1391Z的多克隆位点插入权利要求I所述DNA片段得到重组质粒。
6.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为将SEQIDNO. I所示DNA片段插入pCAMBIA1391Z的Hind III和EcoR I酶切位点间得到的重组质粒。
7.权利要求I 3所述启动子在植物抗病虫害或抗逆性改良和植物品质改良中的应用。
8.一种转化子，该转化子是将权利要求4 6中所述载体导入宿主制得。
9.根据权利要求7所述的转化子，其特征在于所述的宿主为植物体。
全文摘要
本发明提供一种自大豆中分离的根特异性兼伤害诱导型启动子GmChi1p，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。它是用独特设计的引物，以大豆“Jungery”基因组DNA为模板，克隆了大豆chitinase 1基因启动子GmChi1p并构建植物表达载体，命名为pCAM1391Z-GmChi1p，采用农杆菌介导的烟草遗传转化及表达GUS基因的方式进行功能验证该启动子可以驱动GUS基因在转基因烟草的根系中特异表达，并在转基因烟草中被伤害高效诱导表达。该启动子可以代替35S启动子应用于转基因植物的研究，尤其是转基因作物的抗病虫害、抗逆、高产或品质改良的研究。
文档编号A01H5/00GK102618543SQ201210071088
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者吴秀芸, 蔡春梅, 薛仁镐, 赵春梅 申请人:青岛农业大学