水稻种胚特异表达的基因OsESG1、克隆方法及应用的制作方法

专利名称：水稻种胚特异表达的基因OsESG1、克隆方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及水稻种胚特异表达的基因OsESGl、克隆方法及应用。
背景技术：
植物作为真核生物中一大类群，其中有部分植物作为植物界最高等的类群，在生长发育及繁衍后代的过程中能够产生种子，被称之为种子植物。种子在发育过程中主要包括胚胎发生和种子成熟两个重要的过程，种子成熟后经脱水进入休眠。植物的生命史中，种子胚在植物传宗接代以及植物形态发生和发育中都具有非常重要的作用，胚的发生及发育 直接影响着植物体的繁殖和发育。胚的发育主要包括胚胎的形成和胚的成熟。植物的胚胎发育过程在分子水平上受到一系列基因的精确调控，从受精卵被激活开始，胚的发育经过细胞分裂与分化、细胞命运的决定、胚体发育模式的形成、器官的发生等过程，最终形成成熟胚。研究表明，FACl、GRP23、RSH、YODA等基因都参与了早期胚胎发育的调控过程。在种胚基因表达调控网络研究中，对基因及其所编码蛋白产物的研究构成了其中一个必要组份。国内外相关研究结果显示，目前大约有四十多个与胚发育相关的种胚特异表达基因被克隆，它们涉及了胚发育过程中细胞有丝分裂和胞质分裂、器官发生、信号转导和代谢以及表观遗传调控等方面，这些基因的克隆及相关研究大大促进了人们对植物胚形成机理的了解。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，已分离和鉴定了一些影响胚胎形成的基因,例如LEC2 (Leafy Cotyledon 2)、GN0M、M0N0PTER0 和 FACKE 等。LEC2 编码一个含 B3 区域(植物特有的一种DNA结合基序)的转录调控因子，它控制胚发育的正确启动，在胚发育早期和后期均大量表达。GNOM基因编码鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)，它作用于ADP核糖基化因子(ARF)-G型蛋白，影响合子第一次分裂。与正常合子第一次不对称分裂相反，GNOM基因突变体的受精卵第一次分离是对称的，表现出顶端-基部极性(apical-basal polarity)缺陷型，没有根和下胚轴。MONOPTEROS(MP)基因编码一种含DNA结合域的蛋白质，它影响胚中维管组织和胚体模式的建立。FACKEL基因的产物是参与脂类生物合成的一种固醇还原酶(sterol C_14reductase),它影响发育中胚细胞的分裂、扩展和有序排列。FACKEL基因突变特异地减少了下胚轴形成，使得胚根几乎贴到子叶上。然而，至今在水稻中有关种胚特异性基因功能研究仍较少。本发明在水稻中成功克隆到一个表达特异的基因，其仅在水稻种胚中表达，而在其他组织中未检测到其表达，故将该水稻种胚特异表达基因命名为OsESGl (Oryzo Sativa Embryo Specific Genel),该基因的克隆为进一步解析胚特异基因在水稻生长及种子发育过程中的作用提供了良好的材料。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，亚洲近3/4的人口以日常食用稻米为主。而研究调控种胚发育的特异基因是开展稻米品质分子改良工作的基础。对水稻种胚特异性基因的分离及功能研究与鉴定，将有利于揭示水稻种子发育调控机理，最终通过控制胚特异基因的表达影响种子的发育，对水稻的生长发育进行设计育种，为培养高品质的水稻品种、开展水稻品质分子改良提供了重要手段。而且对水稻种胚特异基因的研究对指导农作物生产、改造农作物的品质和抗逆性以及农产品的贮存和运输都具有重要的指导作用
发明内容
本发明提供了一种在水稻种胚中特异表达的基因，命名为OsESGl，并通过分子生物学研究它在水稻种子胚发育过程中的功能。本发明的技术方案是一种在水稻种胚中特异表达的基因OsESGl，它是具有SEQIDN0. I中所示核苷酸序列的基因片段。本发明以水稻基因组DNA为模板，该基因组DNA可使用常规手段获得，以通过基因序列设计的带有酶切位点Kpnl、BamH I的序列为引物，经过PCR获得基因OsESGl ;所述引物序列为OsESGl-F(SEQ ID NO. 2) :5’ -GGGGTACCGCAATGATACTCAACGTGATC-3’ ；OsESGl-R(SEQ ID NO. 3) :5’ -CGGGATCCAACTTCCACGGAATATATATCAC-3’ ；PCR 反应体系=Taq 酶缓冲液(含有 Mg2+) 5u I, dNTP (2. 5mM)3u I, OsESGl-F 引物(IOuM)Iu I, OsESGl-R 引物(10iiM)liiljjagDNA4ia，Taq 酶 0. 5 yl，加灭菌双蒸水至50ul ；PCR 反应程序98 0C IOmin, 94 °C Imin, 56 °C 30s, 72 °C 2. 5min，35 个循环，720C IOmin。本发明以水稻为材料，通过RT-PCR的方法验证了基因OsESGl在水稻各组织中的表达情况，结果显示，基因OsESGl仅在水稻种胚中表达，而在其他组织中不表达；同时对基因OsESGl在种子发育各阶段种胚中表达强度分析发现，该基因随着种子的成熟在种胚中表达量逐渐升高。本发明以商业化的载体pCambial301为骨架，经EcoR I、KpnI双酶切后，与经EcoR
I、KpnI双酶切的CaMV 35S启动子片段连接，改造后的载体命名为pCambial301P。本发明还提供了含有SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的基因OsESGl正义、反义表达载体，其中基因OsESGl以5’到3’方向构建入表达载体pCambial301P获得正义表达载体，命名为为pCambial301P: :0sESGl、基因OsESGl以3’到5’方向构建入表达载体pCambial301P 获得反义表达载体，命名为 pCambial301P: :A0sESGl。本发明以水稻为材料，克隆得到水稻种胚特异表达基因OsESGl，将该基因与载体pCambial301P连接构建正反义植物表达载体，转化水稻并获得转基因植株，经潮霉素抗性筛选结合分子鉴定，获得阳性转基因植株。本发明对获得的转基因植株进行表型分析，结果显示=OsESGl正义表达载体的转基因植株命名为OsESGl，其种子在萌发时，其胚芽及胚根的萌出及生长均晚于野生型对照的种子，且在进一步生长的过程中，子叶及根的长度均短于对照，且主根上几乎没有侧根伸出，显示OsESGl在调控水稻生长及种胚发育中具有作用；本发明进一步对根部延伸区进行切片观察显示，转基因植株的侧根原基较对照的有所减少，且相同部位的转基因水稻幼苗的根部细胞虽然排列比较规则，但细胞列数比对照多，且细胞体积较小，显示基因可参与胚中细胞分裂过程，通过影响细胞的体积及大小，进而影响植物组织器官发生、发育。而OsESGl反义表达载体的转基因植株命名为AOsESGl，其种子在萌发时，其胚芽及胚根的萌出早于野生型对照的种子，且后期根及子叶生长发育好于野生型对照，植株整体发育良好。该方面的功能可进一步应用于水稻或其它植物生长及发育调控的相关研究。本发明的有益效果是本发明分离并克隆了一水稻种胚特异性基因OsESGl。该基因位于水稻一号染色体上。同时通过研究发现基因OsESGl仅在水稻种胚中表达，且该基因随着种子的成熟在种胚中表达量逐渐升高。本发明对获得的OsESGl正义及反义表达载体的转基因植株进行表型分析，结果显示该基因可参与胚中细胞分裂过程，通过影响细胞的体积及大小，进而影响植物组织器官发生、发育。该方面的功能可进一步应用于水稻或其它植物胚发生及根部发育调控相关研究。不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且该基因可应用于调控种子根部发育，对改变种子生长特性及品质具有一定的应用价值。


图I :PCR获得片段OsESGl电泳图，其中M :分子量，泳道I是OsESGl片段，泳道2是阴性对照。图2 RT-基因OsESGl在水稻各组织的表达特性研究图示。其中I :根；2 :茎；3 叶；4 :胚乳；5 :胚。图3 =RT-PCR对基因OsESGl在种子发育各阶段种胚中表达强度分析图。其中I :乳熟期；2 :蜡熟期；3 :完熟期；4 :枯熟期。图4 :植物表达载体 pCambial301P: :OsESGl 和 pCambial301P: :AOsESGl 的构建过程不意图。图5 :通过PCR分子检测法，对OsESGl正义、反义转基因水稻的鉴定结果图。其中M :分子量；1-3 =T0代OsESGl植株；4-5 =T0代AOsESGl植株；6 :阳性对照；7 :阴性对照。图6 :对获得的T1代水稻种子进行40ug/ml潮霉素抗性筛选，以野生型水稻种子为对照。其中I :对照种子经40ug/ml潮霉素处理；2 :未经处理的对照种子；3 :经40ug/ml潮霉素处理的OsESGl的T1代种子(株系I) ；4 :经40ug/ml潮霉素处理的AOsESGl的T1代种子(株系2)。图7 :对OsESGIT1代种子萌发性试验显示，转基因种子胚芽及胚根的萌出及生长均晚于野生型对照的种子，且在萌发后生长4-6天后，转基因种子子叶及根的长度均短于对照，且转基因种子主根上几乎没有侧根伸出。图8 :根部延伸区进行切片观察，OsESGl植株的侧根原基较对照的有所减少。I :对照；2 :转基因材料。箭头所示为侧根原基。图9 :相同部位的OsESGl水稻幼苗的根部细胞虽然排列比较规则，但细胞列数比对照多，且细胞体积较小。I :对照；2 =OsESGl植株。图10 JtAOsESGl植株T1代种子萌发性试验显示，转基因种子胚芽及胚根的萌出早于野生型对照及OsESGl种子。图11 :萌发后生长4天后，AOsESGl种子子叶及根的生长均好于对照及OsESGl种子。图12 :萌发后生长6天后，AOsESGl种子子叶及根的生长均好于对照及OsESGl种
子。 图13 :相同部位的AOsESGl水稻幼苗的根部细胞虽然排列比较规则，但细胞体积较大。I :对照；2 =AOsESGI材料。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步阐述，以下实验步骤及涉及的培养基均为本领域常规技术，试剂均为市售产品。实施例I :水稻一号染色体上特异表达的基因序列OsESGl的克隆。通过水稻数据库结合相关基因信息，检索到水稻一号染色体上基因序列，命名为OsESGl0以水稻“中花11”为材料，提取基因组DNA，以此为模板，利用特异性引物通过PCR获得 OsESGl。
I、水稻基因组DNA的提取(I)参照CTAB法，称取0. 2g新鲜组织或_70°C保存的样品，在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻。(2)将研好的组织迅速转移至预热(65°C )的含有600 U I CTAB提取液的EP管中，在65°C中保温15分钟，中间混匀2-3次。(3)取出离心管，冷至室温，IOOOOrpm离心lOmin。(4)用剪好的枪头吸取上清至一新的EP管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(氯仿甲醇=24 : I (V/V)，下同)，轻轻颠倒混匀，静置lOmin，重复操作2_3次。(5)上清移入另一 EP管中，加入2/3体积异戊醇，轻轻颠倒混匀，IOOOOrpm离心IOmin,弃上清。(6) 75%乙醇洗涤沉淀2-3次，干燥后溶于50_100uldd H2O02、以水稻中提取的基因组DNA为模板，通过基因的序列设计带有合适酶切位点(KpnU BamH I)的引物0sESGl_F、OsESGl-R，通过PCR获得用于构建正义载体的基因5’至3’方向的片段，命名为OsESGl。同时设计带有合适酶切位点(KpnUBamH I)的引物AOsESGl-F、AOsESGl-R，通过PCR获得用于构建反义载体的基因3’至5’方向的片段，命名为 AOsESGl。(I)引物序列为0sESGl-F(SEQ ID NO. 2) 5，-GGGGTACCGCAATGATACTCMCGTGATC-3’(下划线Kpn I 识别序列)；0sESGl-R(SEQ ID NO. 3) 5，-CGGGATCCAACTTCCACGGAATATATATCAC-3’ (下划线BamH I 识别序列)。AOsESGl-F (SEQ ID NO. 4) 5，-GGGGATCCGCAATGATACTCAACGTGATC-3’(下划线BamH I 识别序列)；A0sESGl_R(SEQ ID NO. 5) :5，-CGGGTACCAACTTCCACGGAATATATATCAC-3’(下划线Kpnl 识别序列)。(2) PCR 反应体系:Taq 酶缓冲液(含有 Mg2+)5iil，dNTP (2. 5mM)3u I, OsESGl-F/AOsESGl-F 引物(IOiiM)Iii I、0sESGl-R/A0sESGl-R 引物(10 y M) I y 1，水稻 DNA 4u I, Taq酶(博大泰克公司产)0. 5 iil，加灭菌双蒸水至50iU。(3) PCR 反应程序98 °C I Omin, 94 °C lmin，56°C 30s, 72 °C 2. 5min，35 个循环，72 °C 10min，4°C保存。取5 进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一 2200bp左右的条带，结果如图I所示。3、PCR扩增基因片段的回收。电泳后用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收PCR产物片段，步骤如下
(I)将凝胶放在紫外灯下用干净的刀片将条带切下，装入灭菌的离心管中，称取胶的重量,每个管中胶的重量不能超过300mg。(2)按IOOmg胶加700 U I溶胶液的比例，室温溶胶(或55°C溶胶)，其间偶尔摇动；装柱，9000rpm,离心30s ;去掉废液。(3) 500 V- I漂洗液(wash buffer)漂洗，12000rpm离心30s。重复漂洗一次。倒掉废液以后，再于12000rpm离心2min ；(4)将柱子放入一个新的I. 5ml离心管中，在柱子膜中央加入合适体积的洗脱缓 冲液(Eloution buffer,通常用 30 u 1-50 U I),室温放置 2_5min, 12000rpm离心 Imin,离心管中的液体即为回收的DNA片段。实施例2 :基因OsESGl在水稻不同组织的表达模式分析及在种子不同发育时期的表达模式分析。一、基因OsESGl在水稻不同组织的表达模式分析I、植物中RNA的提取(I)参照CTAB-LiCl法，称取0. 2g新鲜组织或_70°C保存的样品，在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻。(2)将研好的组织迅速转移至预热(65°C )的含有600 U I CTAB提取液的EP管中，立即剧烈涡旋振荡30s，使其混匀。(3) 65°C水浴2-5min，期间剧烈涡旋振荡3_5次。(4)稍微冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡lmin，混匀，4°C，12000rpm离心 15min。(5)将上清转移到另一新的EP管中，加入2微升的DNase I，37°C水浴15min。(6)在加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡Imin，混匀，4 °C，12，OOOrpm离心15min。(7)将上清转移到另一新的EP管中，加入1/3体积的8M LiCl，使其终浓度为2M，4 °C过夜沉淀。(8) 4°C, 12000rpm 离心 20min,弃上清。(9)分别用70%乙醇，无水乙醇洗沉淀，晾干，加30-50微升DEPC-H2O,溶解沉淀。2、单链cDNA的获得及表达模式分析以水稻的根、莖、叶、胚乳、胚的RNA为材料,利用PrimeScript 1st Strand cDNASynthesis Kit (TaKaRa)试剂盒反转录成单链cDNA,用于之后的RT-PCR。以Actin 为体系内标，引物序列为LP1 :5' -GAACTGGTATGGTCAAGGCTG-3 ' (SEQID NO. 6) ;LP2:5' -ACACGGAGCTCGTTGTAGAAG-3' (SEQ ID NO. 7)。用于OsESGl 半定量的引物为 OsESGI-RTF :5’ -TACTACTAGATGCAGAGITCTGC-3’ (SEQ ID NO. 8)、0sESGl-RTR :5’-AACTTCCACGGAATATATATCAC-3’ (SEQ ID NO. 9) ;PCR 反应条件为94°C 4min ;之后 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 45s，共进行 35 个循环；最后 72°C lOmin,反应结束后，对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示=OsESGl仅在水稻的胚中表达，而在水稻的根、茎、叶、胚乳中没有表达。(如图2所示)。二、基因OsESGl在水稻种子不同发育时期的表达模式分析I、植物中RNA的提取
水稻种子成熟过程又分为乳熟期，蜡熟期，完熟期，枯熟期，分别取这四个时期的水稻种胚，按照与实施例2( — )相同的方法提取不同时期种胚的总RNA。2、表达模式分析以Actin为体系内标，分析OsESGl在种子成熟四个时期中的表达模式。用于OsESGl 进行RT-PCR 的引物同实施例 2 (—)2 中(SEQ ID N0.8 和 SEQ ID NO. 9)，RT-PCR 反应条件为94°C 4min、之后 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 45s，共进行 35 个循环；最后 72°C IOmin0反应结束后，对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果显示基因OsESGl在各个时期的表达量逐步升高，在种子成熟的后期达到最高，推测该基因在种子成熟的过程中起重要作用。(如图3所示)。 实施例3 =OsESGl正义、反义植物表达载体的构建(图4)。l、EcoR I、KpnI 双酶切商业化的载体 pCambial301,37°C酶切3h。双酶切体系为
pCambial301 质粒 15|il EcoR I2|il
Kpn I2|il
IxK缓冲液5|il
加水至50 |il2、EcoR I、KpnI 双酶切 CaMV 35S 启动子片段，37°C酶切3h。双酶切体系为
CaMV35S启动子片段 15|il EcoR I2|il
Kpn I2|il
IxK缓冲液5|il
加水至50 |il3、经EcoR I、KpnI双酶切的pCambial301载体片段与CaMV 35S启动子片段用T4连接酶连接，构建表达载体pCambial301P。连接体系如下a、回收的 pCambial301 载体片段 I U Ib、CaMV 35S 启动子片段7C、T4DNA 连接酶Iyld、T4DNA连接酶缓冲液I U I将上述a、b、C、d反应物混匀，16°C反应过夜，用于转化大肠杆菌DH5 a。4、Kpn I、BamHI 双酶切 pCambial301P 质粒。37°C酶切3h。双酶切体系为
pCambial301P 质粒 15|il BamHl2|il
Kpn I2|il
IxK缓冲液5|il
加水至50 |il 5、Kpn I、BamH I分别酶切PCR获得的基因5’至3’方向片段OsESGl及基因3’至5’方向片段AOsESGl，双酶切体系同实施例3. I。6、将基因与载体的回收片段用T4连接酶连接，构建成OsESGl的正义表达载体pCambial301P: :0sESGl、反义表达载体 pCambial301P: :A0sESGl。连接体系如下a、回收的 OsESGl/AOsESGlDNA 片段 I U Ib、pCambial301P 载体片段IulC、T4DNA 连接酶Iyld、T4DNA连接酶缓冲液I U I将上述a、b、C、d反应物混匀，16°C反应过夜，用于转化大肠杆菌DH5 a。7、大肠杆菌感受态细胞的制备。(I)挑取E. coil DH5 a单菌落接种到5ml的LB液体培养基，于37°C，250rpm震荡培养过夜。(2)次日将此菌液以I %的接种量转移至IOOml的液体培养基中，继续培养至吸光度(OD)600 = 0 . 4_0. 6。(3)将此菌液冰浴lOmin，在无菌条件下转移至预先冰冷的50ml离心管中，4°C，5000rpm离心lOmin,收集菌体。(4)重悬于 IOml 预冷的 0. lmol/L 的 CaCl2 中，冰浴 lOmin, 4 °C, 5000rpm 离心IOmin,收集菌体。(5)重悬于2ml (含15%甘油)的预冷的0. lmol/L的CaCl2中，分装成100 yl/管，-70°C保存备用。8、转化。(I)从_70°C冰箱取出感受态细胞置于冰上溶解。(2)将OsESGl/AOsESGl与载体pCambial301P的连接产物5 U I加至感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min。(3) 42°C热激90s，在此过程中不要晃动离心管。(4)热激完毕后立即取出放于冰上2min。(5)加入 800 ill 的 LB 液体培养基，37 V，200rpm 孵育 Ih0(6)将菌液涂布在卡那(Kan)抗性的LB固体平板上，37°C培养12h。(7)将平板放入4°C保存。9、阳性克隆的菌液PCR检测。(I)从转化的平板上挑取白色菌落接种到LB液体培养基中，37°C，250rpm震荡培养 3-4h。(2) PCR 反应体系=Taq 酶缓冲液(含有 Mg2+) 2. 5u I, dNTP (2. 5mM)lu I, OsESGl-F/AOsESGl-F 引物(IOuM)Iu l、0sESGl_R/A OsESGl-R 引物(IOuM)Iu 1，菌液2^1 I, Taq 酶(博大泰克公司产)0.3 iil，加灭菌双蒸水至25iU。(3) PCR 反应程序98 °C I Omin, 94 °C lmin，56 °C 30s，72 °C 2. 5min，35 个循环，72 °C 10min，4°C保存。取5 进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一 2200bp左右的条带。10、质粒的提取。(1)将菌液PCR阳性的菌液于37°C，250rpm震荡培养过夜。(2)将菌液转移到离心管中，室温8000rpm离心2min，收集菌体。(3)倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，使残余的液体流出。(4)加入IOOiU预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈震荡重悬菌体，其中所述溶液I配方为50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris-Cl (pH8. 0)、10mmol/L EDTA (pH8. O)。(5)加入200 u I新鲜配制的溶液II，快速颠倒混匀10次，冰浴5min，其中所述溶液II配方为0. 2mol/L NaOH, I % SDS (十二烷基硫酸钠)。(6)加入150 V- I预冷的溶液III，温和地颠倒10次,冰浴5min,4°C 12000rpm离心lOmin,其中所述溶液III配方为5mol/L乙酸钟60ml、3mol/L冰乙酸11. 5ml、H20 28. 5ml、pH 5. 20(7)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的酚氯仿异戊醇(体积比为 25 24 1)，反复混匀，4°C 12000rpm 离心 lOmin。(8)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇(体积比为24 : I),反复混勻，4°C 12000rpm 离心 lOmin。(9)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积预冷(_20°C )的异丙醇，混匀后-20°C沉淀 lh, 4°C 12000rpm 离心 IOmin0(10)倒掉上清，加入500 U I 70%的乙醇洗涤沉淀两次，空气中干燥。(11)加入适当体积的TE溶液和2 U I RNaseA, 37°C消化0. 5h。ll、pCambial301P: :OsESGl、pCambial301P: :AOsESGl 双元表达载体的酶切检测。(I) KpnI、BamHI对质粒进行双酶切检测，反应体系如下
质粒3|il
BamHl0.5|il
Kpn I0.5|il
IxK缓冲液 1.5|il 加水至15 |il(2)37°C酶切2h，取IOiU进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得一条1500bp左右的条带。
12、序列测定。
以上步骤中获得的阳性克隆pCambial301P: :OsESGU pCambial301P: :AOsESGl 由山东省农科院闻新技术研究中心测序，序列如SEQ ID NO. I所不。实施例4 pCambial301P: :OsESGl、pCambial301P: :AOsESGl 植物表达载体转化农杆菌。I、农杆菌感受态细胞的制备。(I)挑取单菌落(EHA105)接种到3ml的YEB液体培养基中，于28°C，220rpm震荡培养至 OD6tltl = 0. 5。(2)吸取I. 5ml菌液于离心管中，冰浴lOmin。(3)5000rpm离心30S,弃去上清液。(4)沉淀用 I. 5ml 0. 5M NaCl 悬浮，冰浴 20min。(5)5000rpm离心30S,弃去上清液。(6)每管用100 ill 20mM CaCl2悬浮，用于转化，_70°C保存备用。2、DNA直接转化农杆菌。(I) 50 ill 农杆菌感受态细胞中加入 pCambial301P: : OsESGl/pCambial301P: : AOsESGl 表达载体质粒 DNA0. 1-1 u g (5-10 U I)，之后冰浴 30min。(2)放入液氮中5min(或lmin)然后立即放入37 °C水浴锅中水浴5min。(3)取出离心管，加入0.5ml的YEB，于28°C，220rpm震荡培养3至5小时。(4)取出菌液涂布于含有相应抗生素的YEB平板上，28°C下倒置培养2天左右菌落可见。3、阳性农杆菌鉴定。(I)挑取农杆菌单菌落，接种于含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28°C震荡培养过夜。(2)菌液PCR鉴定步骤同实施例3-6。实施例5 :农杆菌介导水稻遗传转化。一、以水稻成熟胚为材料诱导愈伤组织。I.消毒取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒I)将种子放入IOOml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒I分钟；2)倒去酒精，加入IOOml 30%次氯酸钠(NaClO)溶液，浸泡30分钟；3)倒去次氯酸钠溶液,用无菌蒸懼水清洗种子4-5遍,最后一遍浸泡30分钟。2.诱导与继代培养(以下步骤需无菌操作)I)种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基(培养基成分见表I)中，每皿12-14颗；2)操作完毕用封口膜(Micropore Surgical Tape)封好培养皿,在30°C光照培养箱，培养4周；3)在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织(淡黄色，致密呈球状)，置入继代培养基(培养基成分见表2)中，在30°C光照培养箱，继代培养1-2周。(没有脱落的可在原培养基上继续培养)。
二、农杆菌培养。挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌(EHA105)菌液100 于4ml YEP (含50mg/LSpec 和 50mg/L Str)培养液中，28 °C，250rpm 振荡培养 20_36h 至菌液 OD6tltl 为
0.8—I. 0o三、感菌与共培养。I)取培养好的菌液Iml于I. 5ml离心管中,4°C, 5000rmp,离心lmin,去上清。用含200 u mo I/LAs的30ml AAM感菌液(培养基成分见表3)制成悬浮液。2)将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟，愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可。3)将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上浙干30-40分钟；4)将愈伤组织置于共培养基(培养基成分见表4)上(上面垫上一层9cm无菌滤纸)。250C (组培室)暗培养2. 5天。四、抗性愈伤组织的筛选。将愈伤组织取出，用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l羧苄青霉素(Car)的无菌水浸泡lh。最后置于无菌滤纸上浙干2小时。第一轮筛选将晾干的愈伤转入含250mg/L羧节青霉素(Car)和50mg/L潮霉素的选择培养基(培养基成分见表5)上进行第一轮选择，30°C,光照培养箱中培养14天；将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含250mg/l羧苄青霉素(Car)和50mg/ 了潮霉素的培养基(同培养基成分见表5)上进行第二轮选择，30°C,光照培养箱中培养10天,然后转移到组培室中培养4天。将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含250mg/l羧苄青霉素(Car)和50mg/l潮霉素的培养基(同培养基成分见表5)上进行第三轮选择，30°C，光照培养箱中培养21天。五、抗性愈伤组织的诱导分化和生根。挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基(培养基成分见表6)的培养皿或塑料广口瓶中，用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗(30天左右)。待苗长至Icm左右，放入生根培养基(培养基成分见表7)中壮苗。六、转基因苗的锻炼和移栽。转基因苗从分化到移栽最短时间为两至两个半月。将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水，炼苗3天至一周，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。表I水稻成熟胚愈伤组织诱导培养基(每升含量)
权利要求
1.一种水稻种胚中特异表达的基因，它是具有SEQ ID NO. I中所示核苷酸序列的片段。
2.—种含有权利要求I的基因的表达载体。
3.一种含有权利要求I的基因的正义表达载体pCambial301P::0sESGl，其特征是，它是将基因OsESGl以5’到3’方向构建入表达载体pCambial301P ;所述pCambial301P的获取方法为以载体pCambial301为骨架，经EcoR I、KpnI双酶切后，与经EcoR I、KpnI双酶切的CaMV 35S启动子片段连接。
4.一种含有权利要求I的基因的反义表达载体pCambial301P: :A0sESGl，其特征是，它是将基因OsESGl以3’到5’方向构建入表达载体pCambial301P ;所述pCambial301P的获取方法为以载体pCambial301为骨架，经EcoR I、KpnI双酶切后，与经EcoR I、KpnI双酶切的CaMV 35S启动子片段连接。
5.—种转基因植株的获取方法，其特征是，将权利要求4的反义表达载体pCambial301P: :AOsESGI农杆菌介导水稻遗传转化，获得转基因植株。
6.权利要求I所述的基因的克隆方法，其特征是，以水稻基因组DNA为模板，以通过基因序列设计的带有酶切位点Kpnl、BamH I的序列为引物，经过PCR获得。
7.如权利要求6所述的基因的克隆方法，其特征是，所述引物序列为OsESGl-F :5’ -GGGGTACCGCAATGATACTCAACGTGATC-3’ ；OsESGl-R :5’ -CGGGATCCAACTTCCACGGAATATATATCAC-3’ ； PCR 反应体系含有 Mg2+ 的 Taq 酶缓冲液 5 yl，2. 5mM 的 dNTP3 u I, IOu M ^ OsESGl-F引物I yl、IOii M的OsESGl-R引物liil，水稻DNA 4u I, Taq酶0. 5 yl，加灭菌双蒸水至50u I ；PCR 反应程序98°C 10min,94°C lmin,56°C 30s, 72°C 2. 5min，35 个循环，72°C IOmin0
8.权利要求I所述的基因在调控种子根部发育方面的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征是，通过参与胚中细胞分裂过程，通过影响细胞的体积及大小调控种子根部发育。
全文摘要
本发明公开了水稻种胚特异表达的基因OsESG1、克隆方法及应用，属于基因工程技术领域。OsESG1基因位于水稻一号染色体上，序列如SEQ NO.1所述。本发明以水稻基因组DNA为模板，以通过基因序列设计的带有酶切位点Kpn1、BamH 1的序列为引物，经过PCR获得基因OsESG1。本发明进一步利用遗传学、分子生物学的方法进一步对该基因序列进行深入、细致的分析，对其表达模式做进一步的验证，对其功能研究显示基因OsESG1仅在种胚中特异性表达，并调控水稻种子胚芽及胚根的发育，为利用基因工程开展水稻品质改良及分子育种提供重要手段。
文档编号A01H5/00GK102628050SQ20121007899
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者侯蕾, 刘炜, 房孝良, 李臻, 王庆国 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心