专利名称：一种复合型抗蒸腾剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属抗蒸腾制剂领域，涉及一种基于酵母菌和成膜物质的复合型植物抗蒸腾剂及其制备方法。
背景技术：
随着全球气候变化和人类活动的影响，水资源已逐渐成为制约经济社会发展的主要因子之一。在我国，农业作为国民经济的基础产业，向来是用水大户。但是由于水资源时空分布不均，基础水利设施落后，农业灌溉水分利用率只有40%左右，大大低于美国，以色列等西方发达国家，由于严重缺水每年约减产50亿公斤。植物叶片上的气孔，是植物丧失水分的主要通道。据估算，总面积只占叶片面积5%的气孔，参与了 70%的叶片水分蒸腾。而农业生产中消耗的水80%通过蒸腾作用损失，所以通过使用植物抗蒸腾剂来抑制蒸腾作用带来的水分耗散，对于发展节水型农业具有重要意义和显著效果。到目前为止，商品化的抗蒸腾剂多种多样，就其原理而言，目前主要有三种类型I)代谢型抗蒸腾剂主要作用于植物光合代谢途径，诱发气孔关闭，增大气孔阻力，从而减少植物体通过气孔呼吸蒸腾而散失到环境中的水分。这一类型的抗蒸腾剂主要成分有PMA，ABA，黄腐酸等；2)薄膜型抗蒸腾剂通过外源喷施，在植物叶片表面形成一层薄膜，阻碍途经气孔的水分散失，这类抗蒸腾剂主要有高岭土等；3)反射型抗蒸腾剂此类物质用以喷施到叶片的上表面后，能够反射部分太阳辐射能，减少叶片吸收的太阳辐射，从而降低叶片温度，减少蒸腾。上述类型抗蒸腾剂已经大量应用于生产实践，但同时也暴露出了一系列问题如毒性过大，对环境造成污染(如醋酸汞苯)，造价昂贵(ABA)，水溶性差，黏附力低(如黄腐酸)影响光合同化作用(薄膜型)等等。综上所述，研制生态安全，造价低廉，适用性广和作用明显的新型微生物抗蒸腾剂，具有迫切的需要。本发明合理地结合了薄膜型抗蒸腾剂和微生物型抗蒸腾剂，在保留其各自优势的同时发挥了更高效更可靠的效果。其中薄膜型抗蒸腾剂通过使用海藻酸盐类物质在叶片表面形成可食性的覆膜，在阻碍蒸腾作用的同时，也提供了利于微生物生长的局部环境。而成膜物质与微生物在叶片表面混合形成生物膜(Bio-film)后，既保证了微环境的相对稳定，又有助微生物的生存、运动和增殖，从时间和空间尺度上都提高了微生物的效用。微生物型抗蒸腾剂利用了植物免疫应答原理，气孔作为阻挡微生物入侵的门户(Melotto etal. 2006)，能识别微生物细胞膜上特有的激发子(elicitor)，通过一系列信号通路引发保卫细胞水势变化，进而诱导气孔关闭以防御微生物入侵(Schroeder et al. 2002)。酵母菌同样可以诱发植物免疫反应，促进气孔关闭，而且其本身又可以通过多种作用形式促进植物生长，提高作物产量(Shalaby，2008)，是理想的微生物抗蒸腾剂。但是单纯使用微生物制剂喷施方法，由于微生物在自然环境中受温度、湿度、营养条件等影响，生效时间会显著减少，因此其实际作用效果相对理论期望会下降很多(Yan Fan, 2009)，本发明通过将菌剂与成膜剂混合的处理方法，利用成膜物质提供较理想的存活条件，延长微生物在自然环境下的生效时间，从而提高了使用效率，以更少的用量取得更理想的节水效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种生态安全、价格低廉、有效期长、适宜大规模生产的基于酵母菌和成膜物质的复合型植物抗蒸腾剂。其成分为活性干酵母粉5g/L、海藻酸钠2g/L、氯化韩2g/L、葡萄糖6g/L、氯化钠0. 9g/L和水。本发明所公开抗蒸腾剂的作用机理为通过将微生物抗蒸腾剂酵母菌活体与海藻酸钠、氯化钙等成膜物质相混合，在保留了成膜型抗蒸腾剂特点的同时，也保持了酵母菌的活性，能够有效地抑制气孔开度，降低植物蒸腾作用，同时通过提供利于酵母菌存活的微环境，延长作用时间，提高节水效果。
本发明的另一个目的是提供一种基于酵母菌和成膜物质的复合型植物抗蒸腾剂的制备方法，包括如下步骤
1.菌剂A的制备
将活性干酵母粉，按5g/L的比例，于温度为30°C的生理盐水中活化30-60分钟，再加A 2g/L海藻酸钠，搅拌均匀后制得菌剂A ;其中活性干酵母粉为市售安琪牌耐高糖高活性干酵母粉，总细胞数> 200亿cfu/g ；
2.成膜剂B的制备
用2g/L CaCl2和6g/L葡萄糖用蒸馏水配制成成膜剂B ；
3.复合型抗蒸腾剂的制备
先将菌剂A喷施在植物叶表面，然后将成膜剂B喷施在植物叶表面，即可形成由成膜剂包裹着菌剂的复合型抗蒸腾剂。本发明的再一个目的是提供上述方法制备的复合型植物抗蒸腾剂在抑制干旱和半干旱地区农林植物蒸腾中的应用。本复合型抗蒸腾剂经过在表皮条气孔开度试验和活体喷施气体交换试验上的实验结果都一致证明可以有效地且持续性抑制气孔开张，降低气孔导度，从而使植物蒸腾速率下降，减少因呼吸蒸腾而丧失的水分，在一定时期内可显著提高植物的水分利用效率。本发明具有的创新性和有益效果是
I)本发明提出复合型抗蒸腾剂的概念，合理综合了薄膜型抗蒸腾剂和微生物型抗蒸腾剂的特点，利用成膜型物质提供适宜微生物生存的叶片表面环境，在保留其自身优点的同时，也有效提高了微生物的存活时间，从而显著提高此复合型抗蒸腾剂的作用效果和持续时间。2)基于自然界微生物-植物免疫应答反应机理，使用研究成熟的商业化可食用型酵母菌株，简单高效，采用研究广泛的成膜型物质海藻酸钠，安全可食，制得的复合型抗蒸腾剂对环境基本不造成污染，符合生态安全要求。3)利用现代生物技术手段，便于进行大规模生产，成本低，产量高，适用范围广。本发明研究发现活体酵母本身也可以降低植物叶片气孔开度，即可作为一种抗蒸腾剂。本发明在此发现基础上对制备方法、配方等进行了优化。对于已经公布的《一种基于大肠杆菌的植物抗蒸腾剂的制备方法》(CN200710066799. 4)，因大肠杆菌本身对人，动物等存在潜在的致病性，因此并不完全符合生态安全这一要求。而与已授权的《基于酿酒酵母菌的植物抗蒸腾剂的制备方法》(CN100519734)相比，本发明的区别特征在于(1)活性成分酵母菌主要为活细胞；(2)叶片喷施后结合形成薄膜；(3)制备方法；(4)成分。基于以上不同，本发明所公布的技术方案与《基于酿酒酵母菌的植物抗蒸腾剂的制备方法》(CN100519734)相比，具有(I)材料易得，制备便捷，更适宜于大规模推广；(2)能耗低，去除了高压灭菌等高耗能过程；(3)作用时间更长，效果更显著等优点。
图I :本复合型抗蒸腾剂(处理组2)可显著减低气孔开度，且效果优于单一成膜剂(处理组I);
图2 :本复合型抗蒸腾剂(处理组2)可持续降低植物蒸腾速率，且效果优于单一酵母菌齐IJ(处理组I)；
图3 :本复合型抗蒸腾剂(处理组)可有效提高水分利用效率。注图例中标注有不同字母的处理组互相之间有显著差异(即t检验得p〈0. 05)。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例I
1.单一成膜剂的制备
用蒸馏水配制成膜剂，配方为2g/L海藻酸钠，2g/L CaCl2,6g/L葡萄糖；
2.复合型抗蒸腾剂的制备
(1)菌剂A的制备将活性干酵母粉，按5g/L的比例，于温度为30°C的生理盐水中活化30-60分钟，再加入2g/L海藻酸钠，搅拌均匀后制得菌剂A ；
(2)成膜剂B的制备用蒸懼水配制成膜剂B,配方为2g/LCaCl2,6g/L葡萄糖；
(3)复合型抗蒸腾剂制备使用时混合菌剂A和成膜剂B，先将菌剂A喷施在植物叶表面，然后将成膜剂B喷施在植物叶表面，即可形成由成膜剂包裹着菌剂的复合型抗蒸腾剂。3.处理方法
将预处理至气孔完全张开的蚕豆表皮条分别用成膜剂(处理组I)和复合型抗蒸腾剂(处理组2)浸泡处理2小时后，在显微镜下观察并随机测量50个气孔的开度，结果用平均值+标准差表示，并用学生t检验方法比较处理组I、处理组2与对照组之间的统计差异值，参见图I。由图I可知(1)与空白处理相比，本发明所公开的新型抗蒸腾剂可有效抑制气孔开张；(2)与单一的成膜剂相比较，本发明所公开的新型抗蒸腾剂对气孔开度的抑制效果
更显著。实施例2
I.单一酵母菌剂的制备
参照已公开的发明专利《基于酿酒酵母菌的植物抗蒸腾剂的制备方法》(CN100519734)中实施例2中所提供的方法，配制单一酵母菌剂。具体如下
(I)菌剂a的配制
将酿酒酵母菌株(菌种来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC2. I)接种于灭菌后的培养液后，进行摇床培养，培养条件为28°C、150转/分钟,培养24小时。然后将培养物在121°C，0. 12兆帕压力下灭活90分钟。待冷却后，6000转离心40分钟，去上清，沉淀物经无水乙醇脱水后得菌剂a，并于-20°C冻存。(2)辅剂b的配制
用无菌水配制辅剂b,辅剂b的配方为2. Og/L CaCl2 ,0. 01g/L脱乙酰几丁质；
(3)抗蒸腾剂的配制
将0. 3g上述菌剂a加入到IL辅剂b中，搅拌混匀即可得单一酵母菌剂抗蒸腾剂。2.复合型抗蒸腾剂的制备
(1)菌剂A的制备
将活性干酵母粉，按5g/L的比例，于温度为30°C的生理盐水中活化30-60分钟，再加A 2g/L海藻酸钠，搅拌均匀后制得菌剂A ；
(2)成膜剂B的制备
用蒸懼水配制成膜剂B,配方为2g/L CaCl2,6g/L葡萄糖；
(3)复合型抗蒸腾剂的制备
先将菌剂A喷施在植物叶表面，然后将成膜剂B喷施在植物叶表面，即可形成由成膜剂包裹着菌剂的复合型抗蒸腾剂。3.处理方法
选取四周龄蚕豆植株三组各6株，分别在每株叶片表面均匀喷施IOml按上述方法制得的单一酵母菌剂抗蒸腾剂(处理组I)和复合型抗蒸腾剂(处理组2)，每隔24小时用Cl -340光合仪(美国CID公司)测量叶龄为3 - 4的完全展开叶片的蒸腾速率。每株选取一个叶片测定，每组共测定6个叶片，结果用平均值+标准差表示，并用学生t检验方法比较处理组I、处理组2与对照组之间的统计差异值，参见图2。注蚕豆种植方法将蚕豆(Kicia faba L.)种子用75 %乙醇表面消毒5min,蒸馏水冲洗3遍，播种于培养土(营养土与蛭石等比例混合)中。蚕豆生长的光/暗周期为14h/10h，光照强度约为300iimol .nT2 昼夜温度分别为27°C和23°C，相对湿度70%左右，生长期间无任何胁迫。由图2可知(I)与已公开的发明专利《基于酿酒酵母菌的植物抗蒸腾剂的制备方法》(CN100519734)所制作的抗蒸腾剂比较得本发明所公开的新型抗蒸腾剂对植物蒸腾速率的抑制效果更显著；(2)本发明所公开的抗蒸腾剂作用效果更持久，作用时间提高30%以上，在四天后仍有效果。说明酵母菌在成膜物质的包裹下存活时间延长，从而发挥了更久的抗蒸腾效果。实施例3
I.复合型抗蒸腾剂的制备
1)菌剂A的制备
将活性干酵母粉，按5g/L的比例，于温度为30°C的生理盐水中活化30-60分钟，再加A 2g/L海藻酸钠，搅拌均匀后制得菌剂A ；
2)成膜剂B的制备
用蒸懼水配制成膜剂B,配方为2g/L CaCl2,6g/L葡萄糖；
3)复合型抗蒸腾剂的制备先将菌剂A喷施在植物叶表面，然后将成膜剂B喷施在植物叶表面，即可形成由成膜剂包裹着菌剂的复合型抗蒸腾剂。2.处理方法
将复合型抗蒸腾剂均匀喷施于蚕豆叶片表 面，用Cl - 340光合仪(美国CID公司)测量其气体交换数据，持续时间2小时，结果用平均值+标准差表示，并用学生t检验方法比较处理组与对照组之间的统计差异值，参见图3。注蚕豆种植方法将蚕豆(Kicia faba L.)种子用75 %乙醇浸泡消毒5min,蒸馏水冲洗3遍，播种于培养土(营养土与蛭石等比例混合)中。蚕豆生长的光/暗周期为14h/10h，光照强度约为300iimol .nT2 昼夜温度分别为27°C和23°C，相对湿度70%左右，生长期间无任何胁迫。由图3可知与空白处理结果相比，本发明所公开的新型抗蒸腾剂显著提高了植物的水分利用效率，提升效果可达约30%。
权利要求
1.一种复合型抗蒸腾剂，其组成成分为活性干酵母粉5g/L、海藻酸钠2g/L、氯化钙2g/L、葡萄糖6g/L、氯化钠O. 9g/L和水。
2.根据权利要求I所述的一种复合型抗蒸腾剂的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现 (1)菌剂A的制备将活性干酵母粉，按5g/L的比例，于温度为30°C的生理盐水中活化30-60分钟，再加入2g/L海藻酸钠，搅拌均匀后制得菌剂A ;其中活性干酵母粉为市售安琪牌耐高糖高活性干酵母粉，总细胞数> 200亿cfu/g ； (2)成膜剂B的制备配方为2g/LCaCl2和6g/L葡萄糖用蒸懼水配制成膜剂B ； (3)复合型抗蒸腾剂的制备先将菌剂A喷施在植物叶表面，然后将成膜剂B喷施在植物叶表面，即形成由成膜剂包裹着菌剂的复合型抗蒸腾剂。
3.根据权利要求I所述的一种复合型抗蒸腾剂在抑制植物蒸腾中的应用。
全文摘要
本发明提供一种复合型抗蒸腾剂，由活性干酵母粉、海藻酸钠、氯化钙、葡萄糖、氯化钠和水组成。由先将活性干酵母粉经活化后再加入海藻酸钠，搅拌均匀后制得菌剂A，再用CaCl2和葡萄糖配置成膜剂B。将菌剂A喷施在植物叶表面，再将等体积成膜剂B喷施在植物叶表面，即形成由成膜剂包裹着菌剂的复合型抗蒸腾剂。本发明在保留了成膜型抗蒸腾剂特点的同时，也保持了酵母菌的活性，能够有效地抑制气孔开度，降低植物蒸腾作用，同时通过提供利于酵母菌存活的微环境，延长作用时间，提高节水效果。具有安全环保，制备成本低廉，适宜大规模生产，适用性广，抗蒸腾效果显著，有效时间长等优点。可在抑制干旱和半干旱地区农林植物蒸腾中应用。
文档编号A01G7/06GK102626112SQ20121007986
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者欧晓彬, 沈仲佶, 王根轩 申请人:浙江大学