水稻雌性不育基因及其在杂交水稻制种中的应用的制作方法

专利名称：水稻雌性不育基因及其在杂交水稻制种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻杂交制种，特别涉及一种导致水稻麦状叶与雌性完全不育表型的蛋白质及其基因，本发明还涉及利用该基因构建的恢复系及对恢复系后代进行检测筛选的方法，以及该恢复系在杂交水稻机械混播制种中的应用。
背景技术：
有性生殖是植物传种接代的主要方式，也是培育作物新品种的重要途径，由此而产生的种子和果实是人类赖以生存的主要粮食来源。作物杂交具有旺盛的杂种优势和巨大的增产潜力，杂种优势的利用是发展粮食生产的必然趋势。过去几十年来，以有性生殖为基础的杂交育种为农作物产量提高做出了巨大贡献。水稻作为我国第一大粮食作物，约占粮食总产量的40%。稻米是我国人民赖以生存的主食，水稻生产不仅担负确保我国粮食安全 的重任，并肩负实现种粮增效、稻农增收和全面推进新农村建设的重大使命，也是新阶段我国农业和农村经济发展的中心任务之一。人口增加和耕地减少是我国的基本国情，预计到2030年，我国人口将达到16亿，我国农作物的单产需在现有的基础上提高50%以上才能满足粮食的安全供给。然而，自花授粉作物杂种优势的利用难度极大，只能通过“三系”或“两系”的配套进行种子生产。袁隆平院士发明的“三系”杂交稻是指雄性不育系、保持系和恢复系三系配套育种(袁隆平.杂交水稻超高产育种.杂交水稻，1997，12 ￠) :126.)。雄性不育系即一种雄性退化(主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花粉无生活力，不能自花授粉结实；再用保持系使这种不育系能不断繁殖，不至于绝种；再育成恢复系，使不育系育性得到恢复，自交结实并产生杂种优势。后来提出的“两系”杂交稻即没有保持系，其育性转换与日照长短和温度高低有密切关系，分为光敏和温敏两种类型。袁隆平院士对此有一个形象的比喻三系法像包办婚姻，两系法是自由恋爱。目前两系杂交稻占杂交稻种植的20%左右，三系杂交稻占70% 80%。一般情况下，为了增强杂种优势，每个杂交组合的父母本性状差异都很大。进行杂交种子生产(由不育系与恢复系杂交，俗称制种)时需按各个组合父母本的生育特性，植株高矮及抽穗季节的风向，确定合理的父母本株行比例。制、繁种时父母本必须按行或分条块种植，加上自花授粉作物花粉量少、传粉距离短、开花时间集中，导致了异交结实率低、种子成本高，一定程度上限制了自花授粉作物杂种优势利用的发展速度。其次，无论是繁种(不育系种子繁殖，由不育系与保持系杂交，俗称繁种)，还是制种，父本自交产生的种子均不能混入母本所产的异交种子中，否则就会造成重大的种子纯度问题。因此，到目前为止，杂交稻种子的生产很难完全适应机械化作业，杂交种子的成本居高不下(朱启升，王安东，杨前进，等.水稻除草剂敏感基因的研究与利用[J].安徽农业科学，2000，28 (2) :141-142;朱启升.杂交水稻混播制种技术研究进展.作物研究，2004，4 :204-207 ;朱启升，王安东，杨前进，等.水稻除草剂敏感基因导入恢复系的研究[J].安徽农业科学，2000，15 (3) :5-6.)。如何解决“三系” “两系”杂交稻种子纯度问题一直是一个世界难题，既是科研人员攻关的难点，也是种子企业关心的焦点、农民担心的疑点。袁隆平院士领导的研究小组运用白化标记育种的新技术尝试解决这个难题，他们将白化标记基因导入水稻不育系与保持系，可在苗期识别白化的不育系与保持系杂株，简化杂交水稻种子纯度鉴定工作，使杂交水稻种子纯度风险下降为零。但该方法并不能够在制种源头上保证种子的纯度，只有在杂交种子卖给农民，播种后才能够发现并去除杂苗，还是增加了人力成本，也降低了种子的可靠性和信誉，目前该方法并没有在实际生产中大规模应用。水稻“三系” “两系”杂交稻种子制种技术性强，人工成本高，劳动效益降低，制种面积逐年萎缩。水稻制种不仅对生产条件要求较高，而且对整地播种、水肥管理、化学调控、赶花授粉、育秧收晒等技术要求较高。由于农村劳动力大量转移，适于水稻制种的青壮劳动力逐步减少，一般的老人、妇女、儿童难以较好地承担，一旦生产条件不适合、技术措施不到位或遭遇不利天气，就会影响制种产量和种子质量，给制种农户和种子企业造成很大损失。另一方面，制种基地难上规模，难以连片，难以管理，而且伴随着基地整体素质偏低、生产成本被动提升、制种比较效益低等负面因素，导致水稻制种成本增高，劳动收益率降低。近几年全国范围内杂交稻制种面积减少30多万亩。农业部预测，杂交稻种子市场供应将由充足有余向供应偏紧状况转变，并且各地制种规模将出现逐年下降趋势。 水稻“三系” “两系”杂交稻种子制种难以实现机械化。我国现行杂交水稻制种技术，自播种至收获完全依靠人工操作，父母本分期播种，先栽父本，后栽母本，工序繁杂，整个制种过程需要足够的劳动力做保证，只适宜在劳动密集型的农村推广应用，大型农场因缺少足够的劳动力而不能制种。安徽省农科院绿色食品所报道过“混播制种”杂交水稻育种方法(张德文，杨前进，王士梅，汪婉琳，朱启升.混制I号机械化混播制种生产技术.农业生物技术，2008，24 (10) 66-69 ;张德文，陈多璞，杨前进，等.不同时期喷施苯达松对“混制I号”制种产量的影响 安徽农业科学，2007，35 (11) :3212-3213. 3215.)。经过安徽省农业专家测评，由于混播使得花粉利用率高，该技术培育出的杂交一代，亩产达到了 400多公斤，比中国现行的制种技术增产40%以上。而安徽省农科院绿色食品工程研究所改变了此种传统的杂交水稻种子生产方法，在我国首次提出选育能进行混播制种且可以进行机械收割的强优势杂交水稻组合，创立了崭新的杂交水稻种子生产技术。通过生物技术首次发明了携带苯达松敏感基因的水稻父本(恢复系)。在生产种子时,改变过去父母本分开播种栽插的繁琐方法，采用父母本一次混合播种，或抛秧、或机插、或直播，简化栽插工序，在完成授粉后通过改变环境条件(喷施苯达松)使父本死亡，而未携带该基因的母本则可正常生长，最后进行机械化收割。然而该方法中苯达松喷施时间和剂量很容易受到外界环境的影响，很容易发生恢复系“杀不彻底”，引起种子纯度问题，而且苯达松本身对环境有一定的污染，同时也增加制种成本。由于以上原因，目前还没有企业或农场大规模应用该方法。Maruyama提出了选育具有恢复力的雌性不育系来解决上述问题(Maruyama, K.,RKato and H. Araki. Mechanized production of Fl seeds in rice by mixed planting.JARQ 1991. 24 :243-252.)，在文中Maruyama提出杂交制种时，将母本和父本混播提高授粉率，然后通过种子颜色、大小或者其他特征来分离Fl杂交种子和父本可育后代。同时也设想用雌雄全不育的父本来混播制种的思路。但限于当时的技术水平和实验材料，这个想法没有实现。农业是整个国家的基础，种子是农业的基础，种子供种安全是国家农业安全的重中之重。粳稻“三系” “两系”杂交稻种子制种技术急需突破。我们国家杂交水稻面积占水稻总面积的57%，主要在南方。北方种的是粳稻，南方种的是籼稻，籼稻是大头，4亿多亩里面有3亿多亩种的是籼稻，占四分之三。现在杂交水稻里面，主要是杂交籼稻。现在在北方，杂交水稻还很少。如果杂交粳稻突破了，很可能杂交稻的面积会达到80%。

发明内容
本发明的一个目的是为杂交水稻制 种提供雌性完全不育的水稻突变体育种材料，同时以该材料为亲本改造杂交水稻恢复系，并利用改造好的恢复系进行混播杂交制种。本发明发现了一种具有叶片下垂、雌性完全不育表型的水稻突变体，命名为sfsl，其雌性不育是由于外珠被异常增生细胞堵塞珠孔而不能完成受精引起。遗传分析表明该突变是一个单基因控制的隐性突变，申请者通过图位克隆方法确定了突变基因，是0s03g0215200基因第二个外显子(exon)的第8位胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T)突变为胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(C)，使得该基因编码的DROOPING LEAF蛋白的第26位氨基酸残基从野生型的缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)。本发明导致水稻叶片下垂(麦状叶)、雌性完全不育表型的基因编码序列表中SEQID NO :1所示氨基酸序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO: I氨基酸序列由194个氨基酸残基组成，其第26位氨基酸残基从野生型的缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)。编码上述蛋白质的基因可以是所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列。所述基因的cDNA序列如序列表中SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，第77位碱基由野生型的胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)。本发明的另一个目的是提供一种构建新型杂交水稻恢复系的方法，该方法包括以具有麦叶状和雌性完全不育表型的水稻突变体sfsl为原始父本亲本，与现有高产、高抗、优质、广适型恢复系(例如籼稻明恢63,粳稻嘉恢30、嘉恢52和嘉恢69)杂交,通过轮回杂交，高代纯合，筛选具有高产、高抗、优质、广适型、雌性完全不育的新型恢复系。本发明的又一个目的是提供一种对所获得的新型恢复系进行检测的方法。可以利用水稻基因组DNA提取技术和PCR、酶切、电泳技术快速检测带有sfsl突变位点植株，具体是首先提取水稻基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，通过下述引物进行PCR扩增DL-HinfI-F :5' -GACAGTGCCATGCAACAA-3'DL-HinfI-R :5' -GGCCACATTTCACGGTCA-3'扩增产物用内切酶HinfI酶切后进行电泳检测，全长PCR产物是149bp，野生型的PCR产物会被切成129bp和20bp两个条带。通过电泳检测结果对恢复系基因型进行鉴定被切为129bp和20bp两个条带的为野生型；只有149bp单一条带的为sfsl突变体；具有149bp、129bp和20bp三个条带的为杂合体。本发明的又一个目的是提供一种杂交水稻的制种方法，通过sfsl杂交改造所获得的高产、高抗、优质、广适型、雌性完全不育的新型恢复系(具有SfSl突变位点的恢复系)作为父本，可以利用其与雄性不育系母本进行混播杂交制种，提高杂交制种产量，降低生产成本。本发明的雄性完全可育、雌性完全不育突变体sfsl，其雌性完全不育表型是由于子房珠被增生一层细胞，产生物理屏障堵塞珠孔引起。该表型为隐性遗传，通过配种繁育，获得雌性完全不育的恢复系，将雌性不育特性用在杂交水稻制种上。在杂交种子生产时实行混播，以缩小父母本的传粉距离，提高异交结实率，降低种子成本并可确保极高纯度的种子质量。这不仅提高制、繁种产量、降低种子生产成本和确保所产杂交种子的纯度，而且完全实现杂交水稻种子的机械化生产和轻型栽培。另一方面突变体在表现雌性不育的同时，中上部叶片在叶环处弯曲倒挂的“麦状叶”特征，是杂交水稻工作者多年寻求的目标，这种上层叶片自然弯下又表现为隐性遗传的性状，转到杂交稻亲本上，就可减少制、繁种时传粉的阻挡，提高制种产量，并降低劳动成本。因此，本发明所述突变基因和雌性不育恢复系将在杂交水稻改良中发挥巨大作用。


图I是sfsl突变体和野生型植株的表型比较图，其中A显示的是抽穗前外观表型；B显示的是成熟后外观表型；C-F显示的是雌蕊扫描电镜外观表型；G-J显示的是水稻花粉管萌发实验结果。图2是sfsl突变体和野生型的胚珠发育过程的组织切片图，其中左边为野生型， 右边为sfsl突变体。图3A是sfsl突变体的突变位点在染色体上的位置模式图；图3B是具有麦状叶、雌性不育表型植株和野生型植株的共分离电泳图(内切酶为HinfI)，其中泳道I是以野生型植株DNA为模板扩增产物的酶切电泳图；泳道2是以人工杂合体(野生型和麦状叶DNA I I混合)为模板扩增产物的酶切电泳图；泳道3是以麦状叶植株DNA为模板扩增产物的酶切电泳图。图4是本发明突变株的恢复系和正常恢复系的植株照片，其中A为带有sfsl突变位点的恢复系为正常的恢复系。图5显示了以本发明恢复系为父本的混播制种方式，其中A是混播制种示意图；B是混播制种实际操作图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明做进一步详细描述，但不因此限制本发明的范围。实施例一、sfsl突变体的表型分析I.突变体的获得2005年我们在海南省陵水县嘉兴市农科院水稻南繁育种基地早籼稻(Oryzasativa. L. Indica)杂交选种圃第308号(早籼X早籼F5)株系中发现的一例水稻雌性不育突变体(初步命名为fs308)。该突变体是早籼常规品种杂交后代中自然产生的雌性不育突变体,经过多次杂合体自交纯化后保存种质(后改命名为sfsl)。2.突变体的表型sfsl突变体具有3个显著特点1)中上部叶片在叶环处弯曲、倒挂，呈现出“麦状叶”特征(图1A)。2)雌蕊彻底败育，自交或人工辅助授粉均不结实，不育率100% (图1B);3)雌蕊柱头乳突状组织减少、花柱中部融合(图1C，D);进一步的花粉管萌发实验表明，突变体中花粉管伸长受到抑制(图II，J)。sfsl突变体雄蕊发育正常，6个花药齐全，花粉生活力良好，与其他雌性正常的水稻杂交，均可结实(图1H)。通过切片观察胚珠的发育过程，发现外珠被异常增厚(图2，D，F，H，G);此外，该突变体的雌性不育和雄性可育性均不受环境条件影响，浙江、海南不同地域、不同季节等生态条件，都表现非常稳定。二、sfsl突变体表型的遗传学行为在嘉兴、海南两地将sfsl突变体与籼亚种“嘉育293”、“明恢63”，与粳亚种“嘉991”、恢复系“嘉恢32”杂交，配制的不同籼粳杂交组合，观察杂交后代F1 F3的表型，发现sfsl突变体麦状叶和雌性全不育表型完全连锁，属于同一个基因突变引起的不同表型(表I)。而且F1代中没有麦状叶和不育表型，说明突变是由一个隐性基因控制(表I)。F2代中直立叶可育植株和麦状叶不育植株比符合经典的3 I分离比，说明突变是由单个核基因控制的隐性突变(表I)。表I. sfsl麦状叶和育性遗传学分析
卒補入植株数量2a
__可育直立叶j不育麦状叶 X
Fi 嘉优 293(籼稻)$ xsfsJ^__64__0__
Bi 嘉优 293$__200__0__
Bi Y x^sfsl $__101__99__
F2 嘉优 293$xsfsl$__1504__496__0.033
Fi明恢 63(indica)S><sfsliS640BiF1 X 矽鮮对__200__0__
Bi__100__100__
F2明恢 63$xsfsl<S__1503__497__0.017
F1嘉 991(粳稻y^sfsl$__64__0__
BiFig__200__0__
BiS__100__100__
F2M 99 l^xsfsl S__1502__498__0.06
F1 嘉恢 32(粳稻)$ Xsfsl^__64__0__
Bi 秘 \Jiahui323__200__0__
Bi Figx^y^__101__99__
F2 嘉恢 32$xsfsl$__1499__501__0.001
X2检测按直立叶麦状叶为3:1期望值。_三、突变基因的图位克隆遗传分析表明该突变是一个单基因控制的隐性突变，申请者通过图位克隆方法来确定突变基因。由于Sfsl是籼稻背景，首先构建了 “sfsl突变体”和粳稻背景的“嘉991”杂交组合，F2代植株出现表型分离，表现出正常叶片和麦状叶3 I的分离比。利用CTAB法提取F2代植株中具有麦状叶表型单株叶片基因组DNA，利用实验室已经建立的图位克隆方法进行初定位分析，发现突变位点定在水稻第三号染色体长臂中上部，5452kb到6757kb范围内。根据籼粳稻序列多态性，继续在interval内设计新的引物，经过几轮精细定位，将突变位点缩小在5993kb到6025kb约32kb的范围内，里面仅包括3个基因(图3A)。对这3个基因进行测序，发现在基因0s03g0215200的第二个外元(exon)第8位碱基由胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)，导致0s03g0215200编码蛋白DROOPING LEAF第26位缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)(图3A)。因为该突变刚好破坏了一个HinfI酶切位点，所以，设计DL-HinfI-F/DL-HinfI-R引物跨过该突变位点，对PCR产物用HinfI酶切电泳。发现野生型能切出两条带，凡是具有麦状叶、雌性不育表型植株只有一条带，而杂合体具有三条带(图3B)。说明该突变和表型完全连锁，说明的确是由于该突变引起了突变体表型。已有报道表明DROOPING LEAF蛋白的多种突变都能导致叶片下垂，出现麦状叶表型，但麦状叶表型与雌性不育的相关性尚未见报道(Nagasawa，N. et a I. SUPERWOMAN I andDROOPING LEAF genes control floral organ identity in rice.Development,2003,130,705-18 ；Yamaguchi, T. et al. The YABBY gene DROOPING LEAF regulates carpelspecification and midrib development in Oryza sativa. Plant Cell,2004,16,500-9 ;Ohmori, Y. , Abiko, M. ,Horibata,A. &Hirano,H. Y. Atransposon,Ping,is integrated int ointron 4 of the DROOPING LEAF gene of rice, weakly reducing its expression andcausing a mild drooping leaf phenotype.Plant Cell Physiol,2008,49,1176-84.)。I) 0s03g0215200 基因相关信息基因组DNA全长7440bp，CDS全长585bp，蛋白序列全长194氨基酸。CDS第77bp胸腺嘧啶⑴突变为胞嘧啶(C)(见SEQ ID No :2)，相应的蛋白序列第26位缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)(见SEQ ID No :1)。2)共分离CAPS弓丨物信息如下DL-HinfI-F :5' -GACAGTGCCATGCAACAA-3'DL-HinfI-R :5' -GGCCACATTTCACGGTCA-3'全长PCR产物是149bp，用内切酶Hinf I酶切后，野生型被切出129bp和20bp的条带，突变体不能被酶切仍然是149bp，杂合体就具有三条带，见图3B。四、基于sfsl突变体改造恢复系以sfsl突变体为父本，与目前生产应用的高产、高抗、优质、广适应性籼稻/粳稻恢复系进行杂交，在F2代中筛选具有麦状叶表型单株，接着与已有恢复系进行回交，筛选。回交6代后，得到具有麦状叶、雌性完全不育、高产、高抗、优质、广适应性新型籼稻/粳稻恢复系(图4)。在此基础上，再与已有恢复系回交一代，收集回交7代(B7)的杂交种子，作为新型籼稻/粳稻恢复系种质保存。将B7代种下去，提取叶片直立植株的DNA，通过PCR鉴定，筛选杂合体种质并保存。五、新型恢复系混播制种将雄性不育系种子通过直播方式，散播在平整好的稻垄上。同时，对新型籼稻/粳稻恢复系杂合体种子在抛秧盘上按行点播，待长出3片真叶，对小苗编号，提取叶片DNA，PCR鉴定带有sfsl位点的纯合体。将确定好的新型恢复系纯合体以抛秧方式按I : 6的比例种植于雄性不育系中(图5A右图)。以传统父本、母本分行播种(图5A左图)制种方式为对照一，同时以已有恢复系采用抛秧混播(图5A右图)制种为对照二。待水稻长到幼穗分化期，新型恢复系的“麦状叶”表型出现(图5B)。水稻扬花期，进行简单的人工辅助赶粉。种子成熟后，收割烤干称重，统计最终结果。结果表明，以新型恢复系(改良嘉兴优04-1)为父本的组合(表2第4行)比传统分行制种(表2第I行)增产约25%。尽管已有恢复系组合也有约18%的增产(见表2第3行)，但是由于已有恢复系本身种子可育，混播收种后，杂交种子混有大量的恢复系种子，因而不能使用(表2)。表2.新型恢复系混播制种结果

权利要求
1.一种导致水稻麦状叶与雌性完全不育表型的蛋白质，其特征在于，它是序列表中SEQID NO 1所不氣基酸序列的蛋白质。
2.权利要求I所述蛋白质的编码基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo 2所示。
4.一种构建杂交水稻恢复系的方法，以具有麦状叶与雌性完全不育表型的水稻突变体sfsl为原始亲本父本，与现有恢复系杂交，通过轮回杂交、高代纯合，筛选出雌性完全不育的新型恢复系，其中所述水稻突变体sfsl的0s03g0215200基因编码的蛋白质序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。
5.如权利要求4所述的构建杂交水稻恢复系的方法，其特征在干，所述水稻突变体sfsl的0s03g0215200基因的CDS序列如序列表中SEQ ID No 2所示。
6.如权利要求4所述的构建杂交水稻恢复系的方法，其特征在干，所述现有恢复系选自籼稻明恢63，粳稻嘉恢30、嘉恢52和嘉恢69中的ー种。
7.一种对通过权利要求4所述方法构建的杂交水稻恢复系进行基因型检测的方法，包括提取水稻基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，通过以下引物进行PCR扩增DL-HinfI-F :5' -GACAGTGCCATGCAACAA-3'DL-HinfI-R :5' -GGCCACATTTCACGGTCA-3' 扩增产物全长149bp，用内切酶HinfI酶切后进行电泳检测PCR扩增产物被切为129bp和20bp两个条带的为野生型；只有149bp单一条带的为sfsl突变体；具有149bp、129bp和20bp三个条带的为杂合体。
8.一种杂交水稻制种方法，以具有sfsl突变位点的恢复系为父本，雄性不育系为母本，父本和母本混播制种，其中所述具有sfsl突变位点的恢复系的0s03g0215200基因编码的蛋白质序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，呈麦状叶与雌性完全不育表型。
9.如权利要求8所述的杂交水稻制种方法，其特征在于，所述具有sfsl突变位点的恢复系的0s03g0215200基因的CDS序列如序列表中SEQ ID No 2所示。
10.如权利要求8所述的杂交水稻制种方法，其特征在于，所述父本和母本的混播种植比例为I : 6。
全文摘要
本发明公开了一种水稻雌性不育基因及其在杂交水稻制种中的应用。水稻Os03g0215200基因第二个外显子的第8位核苷酸残基由T突变为C，获得叶片下垂、雌性完全不育表型的水稻突变体，命名为sfs1，其雌性不育是由于外珠被异常增生细胞堵塞珠孔而不能完成受精引起。利用该水稻突变体为父本，与现有恢复系杂交，通过轮回杂交、高代纯合，筛选出雌性完全不育的新型恢复系。基于该恢复系与雄性不育系母本混播制种，不仅可以提高制、繁种产量、降低种子生产成本和确保所产杂交种子的纯度，而且可完全实现杂交水稻种子的机械化生产和轻型栽培。
文档编号A01H1/02GK102731635SQ201210096970
公开日2012年10月17日 申请日期2012年4月1日 优先权日2011年4月8日
发明者刘敬婧, 李林川, 李金军, 瞿礼嘉, 高荣村 申请人:北京大学