专利名称：利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法
技术领域：
本发明属于线虫病防治技术领域，尤其涉及一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法。
背景技术：
松材线虫病(Pine wild disease)是世界林木头号病害,可引起松林成片枯萎死亡。自1982年传入我国后，该病害在我国大江南北疯狂肆虐。所到之处，松林一片枯黄。据不完全统计，我国每年病害发生面积约4000hm2，造成松树死亡约15万株以上，损失木材约5000m3，每年全国用于病害的防治经费亦达2. 2亿元。我国对于松材线虫病的研究尽管已持续了几十年，但到目前为止仍然没有找到能应用于生产，切实有效控制病害发展的防治方法。所以病害仍然在扩展，松林仍然在减少。目前世界上对松材线虫病的防治还没有有效的方法。目前使用的防治方法主要有①冬季砍除病死株，以减少初侵染来源。该方法缺点是砍伐不彻底，年年砍年年有发生，②树干注射杀线虫剂，以保护珍贵松树。该方法的缺点是使用烦琐，对树木伤害较大。③用寄生昆虫寄生传媒昆虫天牛，该方法的缺点是寄生昆虫的饲养烦琐，效果也一般。④利用天牛引诱剂引诱天牛，该方法效果一般。总之，这些方法虽然有一定效果，但都不能彻底解决松材线虫病问题。
发明内容
本发明针对目前世界上对松材线虫病的防治方法中存在的缺陷，如①冬季砍除病死株，以减少初侵染来源。该方法缺点是砍伐不彻底，年年砍年年有发生，②树干注射杀线虫剂，以保护珍贵松树。该方法的缺点是使用烦琐，对树木伤害较大。③用寄生昆虫寄生传媒昆虫天牛，该方法的缺点是寄生昆虫的饲养烦琐，效果也一般。④利用天牛引诱剂引诱天牛，该方法效果一般等，提出一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法。本发明实施例是这样实现的，一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，该方法包括把美国细菌悬浮液喷洒到林间，5月份喷雾一次，连续2年，共2次喷雾；在两三年内美国细菌替代松材线虫体表的致病菌，控制我国林间松材线虫病的流行。 进一步，该方法进一步包括选择供试木块和线虫虫株；分离线虫和细菌；制备细菌无细胞培养液；培养无菌组培苗；制备细菌与无菌线虫悬浮液；测定细菌无细胞培养液毒力；
测定细菌与无菌线虫混合悬浮液对松苗致病性；细菌野外控制释放和野外替代能力检测；对细菌液进行喷洒应用。进一步，所述选择供试木块和线虫虫株的方法为由美国进口的2个批次的木材包装箱的供试木块，供试无菌松材线虫为中国浙江松材线虫虫株，参比细菌菌株为为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌；进一步，所述分离线虫和细菌的方法为
采用贝尔曼漏斗法分离木块中的线虫，采用稀释分离法分离线虫体表的细菌。进一步，所述细菌无细胞培养液制备方法为细菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，进行恒温摇床振荡培养，然后将细菌培养液装入离心管内，进行高速冷冻离心机离心，取上清液用微孔滤膜的细菌过滤器过滤，得到细菌滤液。用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基检验是否带菌，如带菌，重复上述操作，直到得到细菌的无细胞培养液为止，置于冰箱中保存备用。进一步，所述无菌组培苗的培养实现方法为选取饱满黑松种子，温水处理，浸泡，使种子充分吸涨，去除不饱满种子，然后用高锰酸钾处理，流水冲洗。剥去外种皮，无菌条件下用乙醇浸泡，升汞处理，然后用灭菌水冲洗3遍，挑于1/2琼脂的PDA培养基上，置于恒温培养箱，暗培养催芽，最后把无菌发芽的种子移植到MS基本培养基上，光照条件下培养I 2个月备用。进一步，所述细菌与无菌线虫悬浮液的制备方法为用划线法纯化细菌，挑细菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基里，恒温摇床上震荡培养，用牛肉膏蛋白胨液体培养基稀释菌液，调制细菌悬浮液；用灭菌水洗下预先培养好的无菌线虫，调整为10000条/mL线虫悬浮液，并用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基检验线虫研磨液是否带菌。将线虫悬浮液分别用灭过菌的离心管分装，每管3mL，每个离心管中加入50 μ L任一细菌悬浮液，混合处理，中间不断翻倒，使线虫与细菌充分结合后，离心，除去上清，用灭菌水定容到3mL制成悬浮液，备用。进一步，所述细菌无细胞培养液毒力测定方法为在大广口瓶内放入3个小青霉素瓶，周围加水少量保湿，封口膜封口灭菌。在无菌条件下往每个小青霉素瓶内加入3mL细菌无细胞培养液，以灭菌水和牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照。然后插入无菌黑松切根苗，每个小青霉素瓶一棵无菌苗，封口膜封瓶口，平放于光照培养箱内，光照条件下培养，观察记录萎蔫情况和萎蔫时间。进一步，所述细菌与无菌线虫混合悬浮液对松苗致病性测定方法为在广口瓶内放3个小青霉素瓶，每个小青霉素瓶加3ml水，封口膜封口灭菌。在无菌条件下往每个小青霉素瓶插一株切根组培苗，然后用无菌细针在无菌苗顶芽下两片叶子处刺个伤口，并在伤口处附上一团无菌的脱脂小棉球，再往脱脂棉球上滴200 μ L细菌与线虫混合悬浮液，并保证小棉球在24h内保持湿润，每处理设3个重复，以单独接种无菌线虫、野生线虫、灭菌水为对照，接种后将广口瓶封口，培养箱内光照条件下培养，观察记录萎蔫情况，参照病害分级方法进行分级。进一步，所述生防菌野外控制释放和野外替代能力检测方法为从病区砍伐有天牛蛀洞的带皮病死木，用纱网包裹并分成不同的处理。分别在树皮表面喷洒美国细菌培养液。待天牛爬出洞7天后，收集纱网内的天牛，再分离天牛携带的松材线虫。另外，采集松树新鲜松枝，在针叶表面同样喷洒美国细菌悬浮液。把林间收集的天牛放到针叶上喂食7天，收集天牛并分离天牛携带的线虫。从天牛上分离的松材线虫，灰葡萄孢培养繁殖后接种松苗，待I个月后观察记录松苗萎蔫情况。并分离松苗内的线虫，再分离线虫携带的细菌，根据各细菌菌落形态和后续的生化鉴定确定菌落种类，统计各目标菌株所占的比率。本发明提出的利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，原理是利用松材线虫体表细菌生态位的替换，利用从美国松材线虫体壁上分离和筛选的细菌菌株进行生物防治。该方法是把生防细菌喷洒到林间，因为该细菌具有致病力低，繁殖和替代能力强等特点，可快速替代我国松林内松材线虫体表的强致病细菌，使松材线虫失去致病能力，从而 达到控制松材线虫病流行的目的。该方法具有简单易行，易于推广应用，成本较低，效果好，作用彻底等优点。
图I是本发明实施例提供的利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法的实现流程图；图2是本发明实施例I的具体实现流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。图I示出了本发明实施例提供的利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法的实现流程。该方法主要包括以下步骤把美国细菌悬浮液喷洒到林间，5月份喷雾一次，连续2年，共2次喷雾；在两三年内美国细菌替代松材线虫体表的致病菌，控制我国林间松材线虫病的流行。实施例I :本发明实施例提供的利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法的实现流程如图2所示。具体详述如下S201 :选择材料。由美国进口的2个批次的木材包装箱的供试木块,供试无菌松材线虫为中国浙江松材线虫虫株,参比细菌菌株为为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，由本实验
室提供；S202:线虫和细菌分离。采用贝尔曼漏斗法分离木块中的线虫，采用稀释分离法分离线虫体表的细菌。S203 :细菌无细胞培养液制备。细菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，进行恒温摇床振荡培养，然后将细菌培养液装入离心管内，进行高速冷冻离心机离心，取上清液用微孔滤膜的细菌过滤器过滤，得到细菌滤液。用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基检验是否带菌，如带菌，重复上述操作，直到得到细菌的无细胞培养液为止，置于冰箱中保存备用；S204 :无菌组培苗的培养。选取饱满黑松种子，温水处理，浸泡，使种子充分吸涨，去除不饱满种子，然后用高锰酸钾处理，流水冲洗。剥去外种皮，无菌条件下用乙醇浸泡，升汞处理，然后用灭菌水冲洗3遍，挑于1/2琼脂的PDA培养基上，置于恒温培养箱，暗培养催芽，最后把无菌发芽的种子移植到MS基本培养基上，光照条件下培养I 2个月备用；S205 :细菌与无菌线虫悬浮液的制备。用划线法纯化细菌，挑细菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基里，恒温摇床上震荡培养，用牛肉膏蛋白胨液体培养基稀释菌液，调制细菌悬浮液；用灭菌水洗下预先培养好的无菌线虫，调整为10000条/mL线虫悬浮液，并用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基检验线虫研磨液是否带菌。将线虫悬浮液分别用灭过菌的离心管分 装，每管3mL，每个离心管中加入50 μ L任一细菌悬浮液，混合处理，中间不断翻倒，使线虫与细菌充分结合后，离心，除去上清，用灭菌水定容到3mL制成悬浮液，备用；S206 :细菌无细胞培养液毒力测定。在大广口瓶内放入3个小青霉素瓶，周围加水少量保湿，封口膜封口灭菌。在无菌条件下往每个小青霉素瓶内加入3mL细菌无细胞培养液，以灭菌水和牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照。然后插入无菌黑松切根苗，每个小青霉素瓶一棵无菌苗，封口膜封瓶口，平放于光照培养箱内，光照条件下培养，观察记录萎蔫情况和萎蔫时间。S207 :细菌与无菌线虫混合悬浮液对松苗致病性测定。在广口瓶内放3个小青霉素瓶，每个小青霉素瓶加3ml水，封口膜封口灭菌。在无菌条件下往每个小青霉素瓶插一株切根组培苗，然后用无菌细针在无菌苗顶芽下两片叶子处刺个伤口，并在伤口处附上一团无菌的脱脂小棉球(能吸附200 300 μ L悬浮液)，再往脱脂棉球上滴200 μ L细菌与线虫混合悬浮液，并保证小棉球在24h内保持湿润，每处理设3个重复，以单独接种无菌线虫、野生线虫、灭菌水为对照，接种后将广口瓶封口，培养箱内光照条件下培养，观察记录萎蔫情况，参照病害分级方法进行分级。S208 :细菌野外控制释放和野外替代能力检测。从病区砍伐有天牛蛀洞的带皮病死木，用纱网包裹并分成不同的处理。分别在树皮表面喷洒美国细菌培养液。待天牛爬出洞7天后，收集纱网内的天牛，再分离天牛携带的松材线虫。另外，采集松树新鲜松枝，在针叶表面同样喷洒美国细菌悬浮液。把林间收集的天牛放到针叶上喂食7天，收集天牛并分离天牛携带的线虫。从天牛上分离的松材线虫，灰葡萄孢培养繁殖后接种松苗，待I个月后观察记录松苗萎蔫情况。并分离松苗内的线虫，再分离线虫携带的细菌，根据各细菌菌落形态和后续的生化鉴定确定菌落种类，统计各目标菌株所占的比率。S209 :细菌液喷洒应用。把生防细菌喷洒到林间，因为该细菌具有致病力低，繁殖和替代能力强等特点，可快速替代我国松林内松材线虫体表的强致病细菌，使松材线虫失去致病能力，从而达到控制松材线虫病流行的目的。本发明实施例提出的利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，原理是利用松材线虫体表细菌生态位的替换，利用从美国松材线虫体壁上分离和筛选的细菌菌株进行生物防治。该方法是把生防细菌喷洒到林间，因为该细菌具有致病力低，繁殖和替代能力强等特点，可快速替代我国松林内松材线虫体表的强致病细菌，使松材线虫失去致病能力，从而达到控制松材线虫病流行的目的。该方法具有简单易行，易于推广应用，成本较低，效果好，作用彻底等 优点。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法，其特征在于，该方法包括 把美国细菌悬浮液喷洒到林间，5月份喷雾一次，连续2年，共2次喷雾； 在两三年内美国细菌替代松材线虫体表的致病菌，控制我国林间松材线虫病的流行。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括 选择供试木块和线虫虫株； 分离线虫和细菌； 制备细菌无细胞培养液； 培养无菌组培苗； 制备细菌与无菌线虫悬浮液； 测定细菌无细胞培养液毒力； 测定细菌与无菌线虫混合悬浮液对松苗致病性； 细菌野外控制释放和野外替代能力检测； 对细菌液进行喷洒应用。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述选择供试木块和线虫虫株的方法为 由美国进口的2个批次的木材包装箱的供试木块，供试无菌松材线虫为中国浙江松材线虫虫株，参比细菌菌株为为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离线虫和细菌的方法为 采用贝尔曼漏斗法分离木块中的线虫，采用稀释分离法分离线虫体表的细菌。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细菌无细胞培养液制备方法为 细菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，进行恒温摇床振荡培养，然后将细菌培养液装入离心管内，进行高速冷冻离心机离心，取上清液用微孔滤膜的细菌过滤器过滤，得到细菌滤液。用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基检验是否带菌，如带菌，重复上述操作，直到得到细菌的无细胞培养液为止，置于冰箱中保存备用。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述无菌组培苗的培养实现方法为 选取饱满黑松种子，温水处理，浸泡，使种子充分吸涨，去除不饱满种子，然后用高锰酸钾处理，流水冲洗。剥去外种皮，无菌条件下用乙醇浸泡，升汞处理，然后用灭菌水冲洗3遍，挑于1/2琼脂的PDA培养基上，置于恒温培养箱，暗培养催芽，最后把无菌发芽的种子移植到MS基本培养基上，光照条件下培养I 2个月备用。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细菌与无菌线虫悬浮液的制备方法为 用划线法纯化细菌，挑细菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基里，恒温摇床上震荡培养，用牛肉膏蛋白胨液体培养基稀释菌液，调制细菌悬浮液； 用灭菌水洗下预先培养好的无菌线虫，调整为10000条/mL线虫悬浮液，并用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基检验线虫研磨液是否带菌。将线虫悬浮液分别用灭过菌的离心管分装，每管3mL，每个离心管中加入50 μ L任一细菌悬浮液，混合处理，中间不断翻倒，使线虫与细菌充分结合后，离心，除去上清，用灭菌水定容到3mL制成悬浮液，备用。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细菌无细胞培养液毒力测定方法为 在大广口瓶内放入3个小青霉素瓶，周围加水少量保湿，封口膜封口灭菌。在无菌条件下往每个小青霉素瓶内加入3mL细菌无细胞培养液，以灭菌水和牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照。然后插入无菌黑松切根苗，每个小青霉素瓶一棵无菌苗，封口膜封瓶口，平放于光照培养箱内，光照条件下培养，观察记录萎蔫情况和萎蔫时间。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细菌与无菌线虫混合悬浮液对松苗致病性测定方法为 在广口瓶内放3个小青霉素瓶，每个小青霉素瓶加3ml水，封口膜封口灭菌。在无菌条件下往每个小青霉素瓶插一株切根组培苗，然后用无菌细针在无菌苗顶芽下两片叶子处刺个伤口，并在伤口处附上一团无菌的脱脂小棉球，再往脱脂棉球上滴200 μ L细菌与线虫混合悬浮液，并保证小棉球在24h内保持湿润，每处理设3个重复，以单独接种无菌线虫、野生线虫、灭菌水为对照，接种后将广口瓶封口，培养箱内光照条件下培养，观察记录萎蔫情况，参照病害分级方法进行分级。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细菌野外控制释放和野外替代能力检测方法为 从病区砍伐有天牛蛀洞的带皮病死木，用纱网包裹并分成不同的处理。分别在树皮表面喷洒美国细菌培养液；待天牛爬出洞7天后，收集纱网内的天牛，再分离天牛携带的松材线虫；另外，采集松树新鲜松枝，在针叶表面同样喷洒美国细菌悬浮液，把林间收集的天牛放到针叶上喂食7天，收集天牛并分离天牛携带的线虫；从天牛上分离的松材线虫，灰葡萄孢培养繁殖后接种松苗，待I个月后观察记录松苗萎蔫情况，并分离松苗内的线虫，再分离线虫携带的细菌，根据各细菌菌落形态和后续的生化鉴定确定菌落种类，统计各目标菌株所占的比率。
全文摘要
本发明适用于线虫病防治领域，本发明提供了一种利用美国松材线虫体表细菌防治松材线虫病的方法。该方法包括把美国细菌悬浮液喷洒到林间，5月份喷雾一次，连续2年，共2次喷雾；在两三年内美国细菌替代松材线虫体表的致病菌，以控制我国林间松材线虫病的流行。本发明利用松材线虫体表细菌生态位的替换，利用从美国松材线虫体壁上分离和筛选的细菌菌株进行生物防治。该方法是把生防细菌喷洒到林间，因为该细菌具有致病力低，繁殖和替代能力强等特点，可快速替代我国松林内松材线虫体表的强致病细菌，使松材线虫失去致病能力，从而达到控制松材线虫病流行的目的。该方法具有简单易行，易于推广应用，成本较低，效果好，作用彻底等优点。
文档编号A01G13/00GK102630534SQ20121012081
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者乔雪娟, 傅军, 刘侃诚, 孙京天, 曾腓力, 朋金和, 贲爱玲, 韩正敏 申请人:南京林业大学