专利名称：苏云金芽胞杆菌基因cry8like、与cry8G组合及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术防治领域，特别是涉及ー种新的苏云金芽胞杆菌基因cry81ike与cry8G组合、及应用。
背景技术：
蛴螬是金龟总科(Scarabaeoidea)幼虫的总称，属于鞘翅目，鳃金龟科，是地下害虫中种类最多，也是危害最大，造成植物损失最大的种类。金龟子总科种类繁多，世界上记载的有3万多种，目前我国已记录1800多种，这类害虫食性杂、分布广、生活隐蔽、适应性强、生活史长短不一，其中为害农林牧草的有100多种，防治十分困难。最主要的有暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)、华北大黑觸金龟(Holotrichia obeita)和铜绿丽金龟(Anomala carpulenta)等(徐建国，范惠，张明考,杨恩华，and郭琳.(2002)暗黑觸金龟生活习性观察及防治技术研究，植保技术与推广，9-10 ;李恩才，陈金焕.(1998)农田蛴螬种群分布及防治技术，陕西农业科学，48-49 ;姜常松，姜福军，and包信平.(2008)花生蛴螬播种期一次用药全生育期控制技术，现代农业科技，121-123)。蛴螬生活习性复杂多样，危害虫态也各异，有的以成虫危害，有的以幼虫危害(胡琼波，2004)。蛴螬成虫喜食作物，林果木(杨，榆，柳，苹果，梨等)叶片、嫩茎和花蕾，果穗等，造成危害。蛴螬幼虫危害更为严重，幼虫栖居地下，取食萌发的种子咬断幼苗的根茎，蛀食根块茎等，造成轻则缺苗断垄，重则毁种绝收。幼虫不仅危害范围广，而且为害时间长，从春季到秋季，从播种到收获都有较大危害。蛴螬啃食地下块根、块茎，使作物生长衰弱，直接影响产量和品质，如花生、红薯、马铃薯、萝卜类春秋受害严重。蛴螬啃食后不仅影响产品的外观品质，还易招致病菌从伤ロ入侵，对冬菜贮藏带来很大不便。近年来随着城市发展，草皮緑化面积逐年加大，对绿化植被的维护已经成为城市发展中的ー项重要工作。蛴螬幼虫咬食草皮根茎，以及进一歩引起的病害入侵成为城市緑化草皮的主要危害之一(谢木发.(1999)草坪地下害虫蛴螬及防治，广东园林,46-47.)。此外，蛴螬还是危害猪群的寄生虫病(猪巨吻棘头虫)中间宿主和传播媒介，棘头虫寄生于猪的小肠，粪肥施于田间，蛴螬是其中间寄主。因此，蛴螬是危害农业、林业、城市绿化的重要害虫。蛴螬是国内外公认的难以防治的地下害虫，作物地下部分损失的86%是由蛴螬造成的，据统计常年全国蛴螬发生面积约700万公顷，一般减产20% 30%。严重年份全国蛴螬发生面积曾达2000万公顷，减产达到50%以上(姜常松，姜福军，and包信平.(2008)花生蛴螬播种期一次用药全生育期控制技木，现代农业科技，121-123)，甚至绝产，成为目前最重要的地下害虫。花生因蛴螬为害一般情况造成减产20% 40%，严重时可减产70% 80%，甚至绝产，并使花生品质下降大大挫伤了群众种植花生的积极性(刘树森，李克斌，尹姣，曹雅忠(2008)蛴螬生物防治研究进展.中国生物防治，168-173 ;许婷婷，江晨，宫清轩，陈金凤，and曲明静.(2010)青岛市花生田蛴螬发生与无公害防治研究，花生学报，42-44 ;王振军，郭志刚，雷晓天，and茹德平.(2010)花生田蛴螬发生原因与防治技术，农业科技通讯，198-200，2010 ;)。2007年8月中下旬在山东省菏泽地区挖查，蛴螬虫ロ密度平均为8.7头/m2，最高达22头/m2 (王爱东.(2008)农田蛴螬发生及综合防治技术，现代农业科技)。2003 2007年，在无棣县采取黑光灯诱集与春、夏、秋3季挖土调查相结合的方法。对大田作物进行了随机调查，大豆田、玉米田金龟子分别达5. 63和3. 00头/m2。大豆田金龟子发生的种类最多，为7种。其中中华弧丽金龟最多，占50. 2%，铜绿丽金龟次之，占25. 1%。华北大黑鳃金龟第3，占13. 0%，其他种类较少。玉米田华北大黑鳃金龟最多，占38. 7%，铜绿丽金龟次之，占29. 5%，暗黒鳃金龟第3，占14.6%，其他种类较少(田方文，彭彦明，张伟华，and崔少英.(2008)山东省无棣县农田金龟子种类调查及发生规律研究，安徽农业科学，12322-12323)。目前，由于机械化作业的推广，农业生产的耕作制度的改变，比如免耕耕作制度、秸杆还田等技术的推广，给蛴螬带来了舒适的生存环境与丰富的食物，増加了単位面积的虫口数，使得蛴螬危害日益加重，特别是东北、华北和华中地区，给蛴螬的防治带来了困难(裴桂英，马赛飞，刘健，刘保才.(2010)大豆田不同耕作模式对蛴螬发生及产量的影响，科学种养)。筛选具有特异性杀虫谱的新Bt菌株始终是Bt研究最活跃的领域。90年代以来，人们在总结回顾Bt杀虫剂防治害虫的历史时发现，现有的Bt杀虫剂主要是用于防治地上 的敏感性鳞翅目害虫，用于防治鞘翅目叶甲类害虫的很少。但是起主要杀虫活性作用的伴孢晶体蛋白和芽孢在阳光中的紫外线照射下很容易失活，丧失杀虫活性(初立良，郑桂玲，周洪旭，李长友，李国勋.两株杀鞘翅目害虫Bt菌株的生物活性及杀虫蛋白基因鉴定，华北农学报，2010 (3))。应用Bt制剂防治蛴螬具有一定的优势，因为蛴螬生活环境隐蔽，避免了伴胞晶体和芽孢受紫外线的照射，能延长杀虫持效期，提高杀虫效果。因此，ー些Bt研究者将研究重点转向筛选对主要地下害虫——金龟子类幼虫具有杀虫活性的菌株上，并取得突破性进展。目前，已有不少报道关于对蛴螬有效的菌株与基因，1992年，Ohba等在世界上首次筛选出对铜绿丽金龟、日本弧丽金龟幼虫有特异杀虫活性的一株Bt新菌株(Bt. subsp.japonensis BuiBui),这是Bt首次用于对挤赠的防治研究。Sato等于1994年从该菌株中克隆得到新的杀虫基因_cry8Cal。1994年，美国Mycogen公司从Bt菌株PS50C分离的cry8Aal 和 cry8Bal 对花金龟 Cotinis sp 有明显的杀虫活性。Shin-ichiro Asano 等 2003年发现的含有cry8Da的Bt菌株SDS-502对铜绿异丽金龟有高活性。我国的相关基因发掘是2002年以后开始的。河北省农科院植保所筛选出多株对黄褐丽金龟(Anomala. exoleta)和铜绿丽金龟(Anomala. . corpulenta)幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株。2004年，本实验室从菌株HBF-I中克隆得到对铜绿丽金龟高效的cry8Ca2基因，随后进行了突变研究，提高了对铜绿丽金龟的杀虫活性。2006年，本实验室又发现Bt菌株Btl85对暗黑鳃金龟具有较好杀虫活性，这是发现的第一株对暗黑鳃金龟有杀虫活性的基因，2008年从该菌株中克隆得到了模式基因cry8Fal和对暗黑鳃金龟高活力的模式基因cry8Eal。2009年，本实验室又发现了同时对暗黒鳃金龟和大黑鳃金龟高杀虫活性的Bt菌株HBF-18，从该菌株中分离到对大黒鳃金龟与暗黒鳃金龟都有效的第二分类等级的新基因crySGal。研究结果表明自然界中存在对蛴螬具有特异杀虫活性的菌株与基因，通过筛选高效杀虫菌株与基因，可以利用Bt来蛴螬进行有效的生物防治。目前发现对蛴螬有杀虫活性的Bt基因有cry3、cry8、cry23、cryl8、cry37、cry43等类基因。研究较多的是cry8类基因，cry8类基因由1160-1210个氨基酸组成，分子量在128-137kDa之间。这些菌株与基因的克隆为我国的蛴螬防治提供了优质菌株资源，也为进一歩开发抗蛴螬转基因作物提供了基因资源。20世纪90年代以后，随着化学农药的大規模应用而产生的问题越来越突出，我国逐渐限制了相关高毒农药的使用，从2007年I月I日起，已全面禁止了甲胺磷等高毒化学农药在农业生产中的应用。高毒化学农药的逐渐退场无疑给生物农药腾出了巨大的市场空间。依照我国农药行业确定的“十二五”规划，农药产业将继续深化高毒农药的替代工作，预计到2015年，高毒农药所占比重将由目前的20%降低到5%左右，而生物农药占所有农药的份额将由现在的不足10%増加到30%以上。为了获得最佳的社会、经济和生态效益，改善农业生态环境，实现我国农业经济的可持续发展，保障粮食、食品安全生产，增强我国农产品国际竞争力，研发和推广以生物防治为核心的蛴螬综合防治技术是目前主流趋势。菌株HBF-18对大黑鳃金龟与暗黒鳃金龟有较好杀虫活性，本项目组从中分离到对暗黑鳃金龟与大黒鳃金龟都有活性的cry8Gal基因。cry8Ga基因也是目前唯一报导的对大暗黑鳃金龟有活性的cry基因类型。然而，cry8Ga基因的表达产物与出发菌株(HBF-18)相比，有较大的差別，结果显示含有crySGa基因的无晶体突变株对大黒鳃金龟与暗鳃金龟的活性比出发菌株要低，其LC5tl分别高出50倍与70倍(Shu et al. 2009)(表1-1)。在本课题组克隆的其他对蛴螬有活性的基因则没有这种现象。在转入cry8Ca、cry8Ea、cry8Ha与cry8Ia等基因的Bt无晶体突变株具与其出发菌株HBF-I、Bt 185以及BtSU4有相当的杀虫效果(表1-2，1-3)。这些现象表明，菌株HBF-18中除了含有cry8Ga基因外，还含有一些其他新的杀虫基因。表1-1菌株HBF-18与HD8G (只有cry8Ga基因的表达表达菌株)对大黑鳃金龟与暗黑鳃金龟的杀虫活性比较
权利要求
1.Cry 81ikel蛋白，其具有SEQ ID N03所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述蛋白，为Cry81ike2蛋白，其氨基酸序列如SEQID N04所示的。
3.编码权利要求I所述的Cry81ikel蛋白的基因，其具有如SEQ ID NOl所示核苷酸序列。
4.编码权利要求2所述的Cry81ike2蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID N02所示。
5.ー种载体，含有权利要求3或4所述的基因。
6.根据权利要求5所述载体，为pSTK81ike2，其结构如
图13中所示。
7.—种蛋白组合物，由Cry81ike2蛋白和Cry8Gal蛋白组成。
8.权利要求2所述蛋白或权利要求7所述的蛋白组合物在抗鞘翅目害虫中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，是将蛋白或蛋白组合物制成杀虫剂用于杀灭鞘翅目害虫。
10.根据权利要求8所述应用所述应用，是将编码蛋白的基因转入植物或微生物中，使其表达抗鞘翅目害虫的特性。
11.根据权利要求8-10任一所述应用，所述鞘翅目害虫为蛴螬。
全文摘要
本发明涉及苏云金芽胞杆菌基因cry8like2、与cry8G组合及其应用，属于生物防治技术领域。本发明从HBF-18中分离得到cry 8lik1e基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，与cry 8E连接后得到cry8like2合成基因，其核苷酸序列如EQ ID NO2所示。该基因对鞘翅目害虫高毒力，特别是对蛴螬有高毒力。同时本发明提供一种蛋白组合，Cry8like2与Cry8G在鞘翅目害虫上有协同作用，对主要地下害虫蛴螬的生物防治以及我国农业绿色可持续发展都有极其重要的意义，进一步为开发抗蛴螬的Bt工程菌株、转基因作物提供基因来源。
文档编号A01N43/50GK102659933SQ20121011983
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月21日 优先权日2012年4月21日
发明者宋福平, 张彦蕊, 张 杰, 彭琦, 束长龙, 耿丽丽 申请人:中国农业科学院植物保护研究所