专利名称：一种蛇足石杉内生菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物工程技术领域，特别是涉及一种蛇足石杉内生菌及其应用。
背景技术：
随着世界老龄人口的迅速增加，早老性痴呆症(AD)患者日益增多，已成为继心血管疾病、肿瘤病后威胁老年人生命的第三大疾病。我国科学家刘嘉森等于1986年从民间草药千层塔Huperzinaserrata (Thumb.)中
分离得到的一种新型石松类生物碱有效单体-石杉碱甲(Huperzine A)。近年来，国内大
量临床研究已证实，石杉碱甲是一种高效、高选择性、可逆性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，具有促进记忆再现和增强记忆保持的作用，对AD、血管性痴呆、智力低下、精神分裂症等患者的学习、记忆障碍以及神经退行性疾病有很好的治疗作用。目前，石杉碱甲主要来源于野生蛇足石杉全草，该植物对环境要求苛刻，分布星散，生长缓慢，资源更新周期长。据调查，中国作为蛇足石杉野生资源主要分布区，天然生物量为4656. 6t，理论可采量为1604t，商业可采量不超过200t，而目前每年约需要至少2000t蛇足石杉干品，有限的自然资源，远不能满足市场对药源的需求，可持续利用蛇足石杉资源是一个急待解决的问题，也是制约石杉碱甲开发的瓶颈。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够通过微生物发酵产生石杉碱甲类似物。本发明提供一种蛇足石杉内生真菌分类学命名为裂裙菌(SchizophylIumcommune),命名为 XQYS。本发明所述的蛇足石杉内生真菌是从石杉科植物蛇足石杉植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得。经微生物分类学鉴定为裂裙菌(Schizophyllum commune);该菌株己保藏，于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5510。保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。本发明所述菌株固体培养特征在PDA琼脂培养基上菌落生长较快，25°C黑暗条件下培养7天，菌落直径45-50 mm,白色，絮状，隆起，背面浅褐色，无水溶性色素；本发明所述菌株液体培养特征挑取少许菌丝接种于ro培养基，摇瓶培养，培养温度28±1°C;培养第1-2天，有少许白色菌丝出现；培养第3-4天，形成直径l_3mm白色菌丝球；培养第5-6天，形成直径5-8mm白色菌丝球；培养第7天菌球直径增大到12-18mm ;培养5-6天后发酵液有浓郁酒香味。本发明所述菌株显微特征菌丝壁平滑或稍粗糙，分枝较少，具分隔，2. 0-5. O μ m宽，无锁状联合现象。未见无性型产孢结构及孢子。本发明所述菌株rRNA基因序列(包括18S rRNA片段，ITS1、5. 8S rRNA、ITS2的全序列及28S rRNA序列片断)为GTCAAAAGTTAGCGCACAAGTCGCTAGTCTCGGTCAAGAGACGGTTAGAAGCAGACTCCTATTGAAACTGACTAGGTCAGCCCCGAGATGGTCAACGACGTAGAAATTATCACATCGGAGACGCGATCCCGCAAGGGAAATCCGCTAATACATTTAAGAGGAGCTGGCTCCGTTAGGCTCCAGCAGACCTCCACTTCCAAGCCACTCTCGAGACCGAAGTCAAAAGAGGGTTGATGGTATTTAATGACACTCAAACAGGCATGCCCCTCGGAATACCAAAGGGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGTCGAAAGTTGTATTAACTTTTTAGGGTCTGTCAAGACCATGATTACATTCGTTAACATACTTTAAGGTGTGAGGTAGACGTAGTCAACCGCCGCCCGTGAAGGCTTTGGGACTACATAAGGTGCACAGGATCAGAACAAGATGAACTTGTTTGATTCGTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCA CCTACGGAAACCTTGTTAC本发明的另一目的是提供了蛇足石杉内生真菌的应用。本发明所述菌株，经发酵可得石杉碱甲类似化合物，其工艺包括菌种活化、种子培养、发酵培养、总生物碱的提取、HPLC分析、石杉碱甲类似化合物步骤。各工艺步骤参数如下(I)菌种活化培养基为PDA培养基，平板活化培养72小时，温度为28±1°C ;(2)种子培养培养基为H)培养基，摇瓶培养72小时，温度为28±1°C ；(3)发酵培养培养基为改良H)培养基，摇床培养14天，温度为28±1°C ；(4)总生物碱的提取发酵完毕，超声处理发酵液，用常规提取方法提取总生物碱；(5) HPLC分析提取总生物碱后，对总提取物进行HPLC分析，色谱条件——色谱tt Kromasi 1C18 反相柱，柱温 25°C，流动相 CH3CN =KH2PO4 (O. 02mol/L)=15:85，流速 I. OmL/min,检测波长310nm。(6)石杉碱甲类似化合物HPLC分析后，获得石杉碱甲类似化合物。本发明从石杉科植物蛇足石杉植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得一株生长快、产石杉碱甲稳定的裂裙菌(Schizophyllum commune) XQYS0该菌株液体发酵能够产生石杉碱甲类似化合物，提供了石杉碱甲的微生物发酵生产的新方式，为寻找治疗早老性痴呆活性成分石杉碱甲资源提供了新途径，具有良好的应用前景。
图I为本发明所述裂褶菌菌落形态及显微特征；图2为本发明所述裂褶菌液态发酵菌球形态；图3为本发明所述裂褶菌发酵液HPLC检测结果
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。实施例I:本发明裂褶菌株的富集和筛选( I)采集蛇足石杉全草若干，包括茎段、叶片、不定根等，用保鲜膜包裹，保持其鲜活状态。(2)将采集的新鲜蛇足石杉用自来水洗净，去除泥垢，再用流水冲洗30min。滤纸吸干外植体表面水溃后，将外植体放入干燥广口瓶中，移入无菌操作间进行操作。在无菌操作间,用70%乙醇浸泡外植体10-15S，无菌水冲洗3-4次，无菌滤纸吸干外植体表面水溃，再用O. I %升萊溶液浸泡外植体15 min,无菌水冲洗3_4次,无菌滤纸吸干外植体表面水溃。处理完后，将外植体置于无菌广口瓶中备用。(3)接种培养。茎段剪去茎段两端裸露截面少许，再将茎段切成有2-3个节间的小段，接入培养基中。叶片选取完整无损叶片，剪去叶片外缘，接入培养基中。不定根剪去不定根两端裸露截面少许，再将不定根切成约I. 5cm的小段，接入培养基中。将接种后的外植体转入培养室内进行培养，培养温度28 ± I °C。(4)菌种分离。在外植体培养过程中选取长菌外植体，采用平板划线法进行内生菌的分离。将划好的培养皿置于25°C下恒温培养，3-5天后挑取单菌落菌种，采用划线法重复分离纯化3次，得到纯化菌种。将纯化菌种转入PDA试管斜面中保存备用。 (5)取从蛇足石杉植株中富集分离到的内生真菌，无菌条件下，转接入已灭菌的液体H)培养基中，28°C下IOOrpm摇床培养14天；(6)发酵完毕，发酵液超声处理30min后，取发酵液过O. 45 μ m滤膜进行HPLC检测，色谱条件色谱柱Kromasi 1C18反相柱，柱温25°C，流动相CH3CN =KH2PO4 (O. 02mol/L)=15:85,流速I. OmL/min,检测波长310nm。检查结果与石杉碱甲标准品图谱进行对比分析，表明本发明的蛇足石杉内生真菌菌种液体发酵能够产生石杉碱甲类似化合物。实施例2 :本发明裂褶菌株发酵可得石杉碱甲类似化合物(I)取本发明的裂裙菌(Schizophyllum commune) XQYS,在无菌条件下,用接种针挑取少量菌丝，接入PDA平板，活化培养72小时，培养温度为28± 1°C ;(2)活化培养72小时后，转接入H)培养基，摇瓶培养72小时，培养温度为28±1°C ；(3)将种子发酵72小时后的菌种，转接入改良H)培养基，摇床培养14天，培养温度为 28 士 1°C ；(4)发酵完毕，超声处理发酵液30min后，用常规提取方法提取发酵液中总生物碱；(5)提取总生物碱后，对总提取物进行HPLC分析。色谱条件色谱柱KromasilC18反相柱，流动相CH3CN :KH2P04=15:85,流速I. OmL/min,检测波长310nm。检查结果与石杉碱甲标准品图谱进行对比分析。(6)通过HPLC检测，检查结果与石杉碱甲标准品图谱进行对比分析，表明本发明的蛇足石杉内生真菌菌种液体发酵能够产生石杉碱甲类似化合物。
权利要求
1.一种蛇足石杉内生菌，其特征在于从蛇足石杉活体中分离的产石杉碱甲真菌，该菌分类学命名为裂裙菌(Schizophyllum commune),命名为XQYS,于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5510;所述的产石杉碱甲真菌的rRNA基因序列包括18S rRNA片段，ITSU5. 8S rRNA、ITS2的全序列及28SrRNA序列片断为GTCAAAAGTTAGCGCACAAGTCGCTAGTCTCGGTCAAGAGACGGTTAGAAGCAGACTCCTATTGAAACTGACTAGGTCAGCCCCGAGATGGTCAACGACGTAGAAATTATCACATCGGAGACGCGATCCCGCAAGGGAAATCCGCTAATACATTTAAGAGGAGCTGGCTCCGTTAGGCTCCAGCAGACCTCCACTTCCAAGCCACTCTCGAGACCGAAGTCAAAAGAGGGTTGATGGTATTTAATGACACTCAAACAGGCATGCCCCTCGGAATACCAAAGGGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGTCGAAAGTTGTATTAACTTTTTAGGGTCTGTCAAGACCATGATTACATTCGTTAACATACTTTAAGGTGTGAGGTAGACGTAGTCAACCGCCGCCCGTGAAGGCTTTGGGACTACATAAGGTGCACAGGATCAGAACAAGATGAACTTGTTTGATTCGTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTAC 。
2.按照权利要求I所述的一种蛇足石杉内生菌在制备石杉碱甲中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种蛇足石杉内生菌及其应用，其特征在于，该菌分类学命名为裂褶菌 (Schizophyllum commune)，命名为XQYS，于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5510；所述的产石杉碱甲真菌的rRNA基因序列包括18S rRNA 片段，ITS1、5.8S rRNA、ITS2的全序列及28S rRNA序列片断。一种蛇足石杉内生菌在制备石杉碱甲中的应用。
文档编号A01G1/04GK102907253SQ20121022463
公开日2013年2月6日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者向极钎, 帅超群, 龙澜, 杨永康, 覃大吉, 殷红清, 李红英, 程新华, 李亚杰 申请人:恩施清江生物工程有限公司