制备癫痫发作动物模型的方法【专利摘要】本发明提供了一种制备癫痫发作动物模型的方法，该方法包括采用立体定向技术向灵长类动物的海马施用海人酸。本发明制备的癫痫模型的优点在于：1、采用局部注射给药，剂量小；2、致痫剂量与动物性别、年龄先关不大；3、可重复性好；4、致痫过程清晰；5、药物安全性好。【专利说明】制备癫痫发作动物模型的方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种制备癫痫发作动物模型的方法以及使用该方法制备的癫痫发作动物模型。具体地，本发明涉及一种通过向灵长类动物的海马微量注射海人酸来制备癫痫发作动物模型的方法，以及通过该方法制备的灵长类动物癫痫发作模型。【
背景技术：
】[0002]癫痫发作是大脑神经元异常放电引起的癫痫发作性脑功能异常。发作大多短暂并且有自限性，由于异常放电的脑功能区不同，临床可有多种发作表现，包括部分性发作或全面性发作，具体表现为运动、感觉异常，或是行为认知、植物神经功能障碍。全面性发作和复杂部分性发作，往往伴有不同程度的意识障碍。[0003]癫痫是神经元的过渡同步异常放电，其发生机制主要是由于脑内兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸的失衡引起，即一方面脑内兴奋性机制增强，一方面抑制性减弱。前者通过脑内兴奋性氨基酸介导，主要是谷氨酸和天冬氨酸，它们通过与神经元上的谷氨酸受体结合，介导G蛋白耦联的离子通道，获者与兴奋性氨基酸受体(N-甲基-D-天门冬氨酸盐受体)结合，导致大量钙离子和钠离子内流，而钾离子、镁离子则外流，产生去极化。后者通过抑制性氨基酸Y-氨基丁酸(GABA)介导，GABA释放出来与其受体结合后，氯离子通道打开，氯离子内流使突触后膜超极化。[0004]目前的癫痫动物模型按照发作表现分为:急性单纯部分性发作，慢性单纯性部分性发作，复发部分性发作，全面强直阵挛发作，失神发作，癫痫持续状态，难治性癫痫；按照发生机制分为:遗传性癫痫，癫痫免疫模型，外伤性癫痫模型，皮质发育障碍动物模型；按照制备方法分为:化学药物模型，金属植入，电刺激等。难治性癫痫的病因和发作机制复杂，发作无预见性，发作程度难以控制。Loscher(Loscherff.Animalmodelsofintractableepilepsy.ProgNeurobiol,1997,53:239-258.)提出的在实验研究中，判断癫痫动物模型是否适合人类癫痫的标准有三条:①模型的生物电发放和发作形式必须与人类癫痫一致。②如若无发作症状，EEG须显示有生物电异常发放，称为癫痫样放电。③抗癫痫药不能控制其满意发作。目前国际上唯一被认可的耐药性癫痫模型是由Loscher等建立的大鼠苯妥英钠杏仁核电点燃癫痫模型，但是该模型的缺点是，动物不易饲养，点燃率低，容易死亡，而且大鼠与人的种属差异，其解剖结构、生理功能及生化代谢与人差别较大，分子生物学研究生物可信度不高。[0005]至今国内外研究者用海人酸作为致痫剂，已经采用不同的给药途径和方式在多种动物身上建立急性癫痫模型、慢性点燃模型，并广泛用于癫痫发生机制的研究，结果表明海人酸所致癫痫与临床颞叶癫痫发作类型相似，具有建立过程可重复性强，剂量小，点燃率高等优点，是一种较好的癫痫模型。[0006]灵长类动物与人的亲缘关系最近，国内外至今仍无恒河猴海人酸癫痫模型的相关报道。【
发明内容】[0007]为解决现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种制备癫痫发作动物模型的方法。[0008]因此，在第一个方面，本发明提供了一种制备灵长类动物癫痫发作模型的方法，该方法包括将剂量为6.0-9.0μI的2.0μg/μI海人酸施用于灵长类动物的右侧海马来诱发癫痫发作。[0009]在第二个方面，本发明提供了通过本发明的方法制备的癫痫发作动物模型。[0010]在本发明中，灵长类动物包括但不限于，猴科、猩猩科(包括大猩猩、黑猩猩等)、猿类(包括长臂猿、类人猿等)，优选恒河猴。[0011]在一个优选的实施方案中，海人酸通过立体定向方法微量注射给药。[0012]本发明选择了与人类亲缘关系最近的恒河猴作为受试对象，初步建立恒河猴癫痫发作模型，观察行为学及脑电图改变。实验结果表明，实验组的4只恒河猴通过立体定向技术向海马微量注射海人酸后8-12分钟内，均发生了由部分性发作到全面强直-阵乱发作即1-5级痫性发作，且用脑电图记录到了不同时期的癫痫放电，证实了海人酸在灵长类动物中的致痫作用。本次试验，恒河猴经历了伴咀嚼的吞咽动作及呼吸加快，并出现恶心呕吐胃内容物等自主神经系统症状，逐渐发展到单侧肢体的不自主抽搐，继而发展到双侧肢体的不自主抽搐，湿狗样抖动以及全身强直-阵挛等即部分性发作继发全面强直阵挛性发作的全过程，发作形式与人类的颞叶癫痫极为相似。[0013]脑电图记录采用参考电极置`Al，左侧皮层电极:Fpl、F3、C3、P3、01、F7，左侧海马深部电极:Τ3，左侧颞叶深部电极:Τ5右侧皮层电极:Fp2、F4、C4、P4、02、F8，右侧海马深部电极:T4，右侧颞叶深部电极:Τ6。基础脑电图表现:可见频率3-8Ηζ，波幅为200-500uV，Θ波多见，以及10-14ΗΖ，波幅100-20uV，低幅快节律(图1)。实验组注射海人酸后3_5分钟，右侧皮层可见脑电频率增快，频率为16-20ΗΖ，波幅为100-200uV，波形逐渐变尖(图2)，7分钟后波幅逐渐增高，达200-400uV，波形更尖，逐渐出现类似尖波节律(图3)。15分钟后出现散发棘波，棘慢波，频率为16-18ΗΖ，波幅为300-500uV，此时行为学无明显变化(图4)。30-40分钟左右出现单个肢体的阵挛，此时脑电图表现为右侧02导联出现频率逐渐增快，波幅逐渐增高，波形变尖的低幅快节律，随后右侧颞区导联出现节律性棘波，棘慢波，左侧C3导联出现棘波节律，随后扩展到全导(图5-7)。此时行为学表现为四肢屈曲阵挛发作，2-3分钟后逐渐恢复，脑电图主要以慢波为主，全导出现频率为2-4Ηζ，波幅为200-400uV的闻幅慢波(图8)。[0014]相对于其他颞叶癫痫模型，本发明的癫痫发作动物模型具有以下优点:1、采用局部注射给药，剂量小；2、致痫剂量与动物性别、年龄先关不大；3、可重复性好；4、致痫过程清晰；5、药物安全性好。【专利附图】【附图说明】[0015]图1为恒河猴的基础脑电图。[0016]图2为注射后5分钟脑电图:行为学无明显变化。[0017]图3为注射后7分钟脑电图:行为学无明显变化。[0018]图4为注射后30分钟脑电图:单个肢体阵挛。[0019]图5为注射后31-32分钟脑电图:四肢阵挛。[0020]图6为注射后31-32分钟脑电图:四肢强直、抽搐。[0021]图7为注射后31-32分钟脑电图:四肢强直、抽搐。[0022]图8为癫痫发作后脑电图。【具体实施方式】[0023]本发明的恒河猴癫痫模型的建立[0024]1、实验材料[0025]1.1实验动物[0026]健康恒河猴5只，购于中国医学科学院动物所，年龄3岁，体重分别为7.9kg，7.8kg，8.0kg,8.1kg，8.2kg，均单独饲养于90cmX100cmX110cm猴笼中，每日饲养3次，辅以蔬菜、水果，室内平均温度(20±12.4)°C，相对湿度87.5±12.5，实验前均有4周的适应时间，均进行神经系统检查和脑电图检查以排除异常者。[0027]1.2实验药物[0028]海人酸:购于Sigma公司。[0029]麻醉药:盐酸氯胺酮江苏恒瑞医药股份有限公司规格0.lg/2ml[0030]速眠新[0031]阿托品[0032]2、主要仪器、器械[0033]中科新拓NT9200系列便携式数字脑电图仪[0034]20导联放大器[0035]EEG记录软件N92OO[0036]自制猴固定架[0037]3、动物饲养管理[0038]恒河猴饲养于北京市神经外科研究所普通动物房，实验前动物适应环境并进行驱虫治疗，选择健康雌性恒河猴，不锈钢猴笼分笼饲养，自来水瓶装自由饮用，每日喂饲水果。动物挂颈牌和笼上贴标签作为动物识别标记。[0039]4实验方法[0040]4.1癫痫模型制作[0041]将5只恒河猴分为2组:实验组4只，对照组I只。[0042]4.2行为学观察分级[0043]分别给实验组4只猴注射6.0μ1,7.0μl、8.0μl、9.0μl的海人酸，给对照组注射相同单位剂量生理盐水。于猴笼中观察恒河猴癫痫发作模型的发作表现形式，观察癫痫发作的潜伏期，发作的表现形式，发作级别，持续时间以及发作高峰时间和发作停止时间、发作后表现，发作分级参照Racine的标准，依据惊厥程度将行为分为5级，I级:头面部抽搐，咀嚼；2级:节律性点头或全身惊动；3级:一侧前肢阵挛；4级:具有后肢站立的全身阵挛性惊厥常伴双侧前肢阵挛；5级:具有站立伴跌倒或全身强直-阵挛发作。[0044]4.3电极安置[0045]用盐酸氯胺酮注射液按肌肉注射0.2ml/kg,速眠新110.15ml/kg,阿托品0.5mg,分别麻醉实验组和对照组的5只猴，将猴固定于立体定向头架，脱去头部毛发，脱脂后，开颅放置皮层电极，左侧皮层电极:Fpl、F3、C3、P3、01、F7，左侧海马深部电极:T3，左侧颞叶深部电极:Τ5右侧皮层电极:Fp2、F4、C4、P4、02、F8，右侧海马深部电极:T4，右侧颞叶深部电极:Τ6,以Al为参考电极。[0046]4.4脑电活动的观察[0047]将恒河猴固定于立体定向头架，安置好电极，基础脑电图表现:可见频率3-8ΗΖ，波幅为200-500uV，Θ波多见，以及10-14ΗΖ，波幅100-20uV，低幅快节律。实验组注射海人酸后3-5分钟，右侧皮层可见脑电频率增快，频率为16-20ΗΖ，波幅为100-200uV，波形逐渐变尖，7分钟后波幅逐渐增高，达200-400uV，波形更尖，逐渐出现类似尖波节律。15分钟后出现散发棘波，棘慢波，频率为16-18ΗΖ，波幅为300-500uV，此时行为学无明显变化。30-40分钟左右出现单个肢体的阵挛，此时脑电图表现为右侧02导联出现频率逐渐增快，波幅逐渐增高，波形变尖的低幅快节律，随后右侧颞区导联出现节律性棘波，棘慢波，左侧C3导联出现棘波节律，随后扩展到全导。此时行为学表现为四肢屈曲阵挛发作，2-3分钟后逐渐恢复，脑电图主要以慢波为主，全导出现频率为2-4Ηζ，波幅为200-400uV的高幅慢波。[0048]5、试验结果[0049]5.1行为学表现[0050]实验组恒河猴均发生5级癫痫发作，行为学表现为，向海马内注射海人酸3-5分钟后，首先出现脑电图变化，右侧皮层可见脑电频率增快，10分钟左右出现伴咀嚼的吞咽动作及呼吸加快，并出现恶心呕吐胃内容物等自主神经系统症状，30分钟后出现单个肢体的不自主抽搐，继而发展到双侧肢体的不自主抽搐，湿狗样抖动以及全身强直-阵挛等即部分性发作继发全面强直阵挛性发作。对照猴未见痫性发作。[0051]5.2脑电图表现[0052]基础脑电图表现:可见频率3-8Ηζ，波幅为200-500uV，Θ波多见，以及10_14Ηζ，波幅100-20uV，低幅快节律。实验组注射海人酸后3-5分钟，右侧皮层可见脑电频率增快，频率为16-20ΗΖ，波幅为100-200uV，波形逐渐变尖，7分钟后波幅逐渐增高，达200-400uV，波形更尖，逐渐出现类似尖波节律。15分钟后出现散发棘波，棘慢波，频率为16-18ΗΖ，波幅为300-500uV，此时行为学无明显变化(图3)。30-40分钟左右出现单个肢体的阵挛，此时脑电图表现为右侧02导联出现频率逐渐增快，波幅逐渐增高，波形变尖的低幅快节律，随后右侧颞区导联出现节律性棘波，棘慢波，左侧C3导联出现棘波节律，随后扩展到全导。此时行为学表现为四肢屈曲阵挛发作，2-3分钟后逐渐恢复，脑电图主要以慢波为主，全导出现频率为2-4Ηζ，波幅为200-400uV的高幅慢波。(见图1_8)。[0053]上述结果说明，本实验首次成功建立了灵长类动物-恒河猴的海人酸癫痫发作模型，并从行为学和电生理两方面予以评价，该模型表现为部分继发全面性发作，很好的模拟人类颞叶癫痫的发作形式；且该方法具有局部注射，剂量小；可重复性强；致痫剂量与动物性别、年龄先关不大；可重复性好；致痫过程清晰；药物安全性好；致痫时间短等优点。【权利要求】1.一种制备癫痫发作动物模型的方法，该方法包括将6.0-9.0μI的2.0μg/μI的海人酸施用于灵长类动物的海马。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述灵长类动物选自猴科，猩猩科，包括大猩猩、黑猩猩，或猿类，包括长臂猿、类人猿；优选恒河猴。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于海人酸通过立体定向方法微量注射给药。4.通过权利要求1-3中任一项所述的方法制备的癫痫发作动物模型。【文档编号】A01K67/027GK103505455SQ201210228629【公开日】2014年1月15日申请日期:2012年6月24日优先权日:2012年6月24日【发明者】孟凡刚,张建国,陈宁,杨岸超,刘焕光,葛燕,刘崇,胡文瀚,张凯申请人:孟凡刚