专利名称：一种调节茄科类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成的基因片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一种调节茄科类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成的基因片段及其具体应用方法，该片段的基因序列物SEQ ID NO :1所示，可以赋予植物积累类黄酮包括芦丁、山奈酚芸香苷和柚皮素查尔酮等，以及咖啡酰奎尼酸能力。
背景技术：
类黄酮(Flavonoids),又称维生素P,常与维生素C伴随存在,指具有α或β-苯基苯稠吡喃酮的一大类物质(张甘良等，2005)。自然界分布广泛，常以游离态或糖苷的形式存在于高等植物及羊齿植物的根、茎、叶、花、果实，是许多中草药的有效成分(Graf etal. , 2005;Hertog et a I.，1995)。类黄酮类化合物由于生理活性多样,近年来引起了国内外的广泛关注，研究进展很快。类黄酮是一类天然的植物次生代谢产物，具有抗氧化和抗病毒病等重要功能。生物类黄酮具有多种生物活性，可用于延缓衰老，治疗和预防癌症、心血管病等疾病，也可用于作物体外喷施，获得对病原物的抵抗能力(Simona et al. , 2010; Zhen et al.，2010),具有很大应用价值(Pamela et al. , 2007;Butellil et al.，2008)。类黄酮可以作为抗氧化剂、自由基清除剂和二价阳离子鳌合剂，也可以抑菌、抗病毒、消炎、吸引授粉者、保护植物免受病虫害和紫外线损伤，以及作为信号分子、植物抗毒素和化感物质在植物与微生物相互作用中发挥作用(Mol et al. , 1998; Harborne et al. , 2000; Pietta, 2000; Winkel-Shirley, 2001),还能对脂类过氧化、血小板聚合、毛细管渗透性和易脆性、环加氧酶和脂肪氧化酶活性进行抑制，花青素类物质还影响着植物的颜色(唐传核，2005)等。类黄酮的生物活性大体概括为以下几个方面(I)抗氧化和清除自由基作用；
(2)抑菌和抗病毒作用；(3)抗炎和抗过敏作用。咖啡酰奎尼酸(Caffeoyl quinic acid)是一类由奎尼酸和不同数目咖啡酸通过酯化反应综合而成的酚酸类天然化合物，广泛存在于植物界。近20年来，国内外学者就咖啡酰奎尼酸的植物化学和药理学进行了深入研究，发现这类化合物具有一些重要的生物活性，极具临床价值。绿原酸(Chlorogenicacid),是由咖啡酸(Caffeic acid)与奎尼酸(Quinicacid，I-羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。根据咖啡酰在奎尼酸上的结合部位和数目不同，从理论上讲，单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸所组成的绿原酸异构体共有10种，分别为1_咖啡酰奎尼酸、3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸、I，3- 二咖啡酰奎尼酸、I，5- 二咖啡酰奎尼酸、1，6- 二咖啡酰奎尼酸、3，4- 二咖啡酰奎尼酸、3，5- 二咖啡酰奎尼酸、4，5- 二咖啡酰奎尼酸。到目前为止，从植物中发现的绿原酸异构体有如下绿原酸(3-咖啡酰奎尼酸)、隐绿原酸(Band510 (4-咖啡酰奎尼酸)、新绿原酸(5-咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸A (4，
5-二咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸B (3，4- 二咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸C (3，5- 二咖啡酰奎尼酸)、莱蓟素(1，3- 二咖啡酰奎尼酸)。绿原酸的生物活性绿原酸被认为是众多药材和中成药抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分，通常被作为定性甚至定量的指标。据报道，绿原酸的主要生物活性有(I)对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用；(2)对自由基的清除及抗脂质过氧化作用；(3)抗诱变作用；(4)保肝利胆作用；(5)抗菌、抗病毒及解痉等作用。目前主要通过常规手段利用天然材料(银杏叶、洋葱、柠檬、各种中药材等)为基础的化学方法获得，受到原材料来源不足、含量偏低、初提物成份复杂及相关药理毒性不清等因素的严重限制，由少数公司控制下游产品的生产和销售，价格居高不下。目前广泛种植的番茄仅含有少量的类黄酮和咖啡酰奎尼酸。利用番茄作为生物反应器生产植物疫苗、化合物等正成为番茄基因工程研究的一个热点。番茄是重要的转基因受体植物，农杆菌介导的番茄叶盘转化法自1986年McCormick等报道以来得到了迅速发展。但是如何能够提高番茄内类黄酮和咖啡酰奎尼酸的含量一直是现有常规技术无法解决 的问题。
发明内容
本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种可以赋予茄科植物积累类黄酮包括芦丁、山奈酚芸香苷和柚皮素查尔酮等，以及咖啡酰奎尼酸能力的DNA片段，其基因序列如SEQ ID NO: I所示，该片段从番茄中获得，包含番茄类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成调控基因S1MFB12，发明人提供了该片段的分离克隆、功能验证和应用的具体方法；本发明利用番茄果实特异性表达启动子E8，驱动番茄内源基因S1MYB12在番茄果实中特异表达，大大提高了番茄果实中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量，验证了番茄内源S1MYB12基因具有调节类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成的功能；同时建立在此基础上，以栽培型小果番茄作为生物反应器生产类黄酮和咖啡酰奎尼酸生物制品，实行产业化；也可以此获得番茄的工程细胞，通过细胞培养方式生产类黄酮和咖啡酰奎尼酸。同时本发明中用的转化载体可以通过雌二醇的诱导作用剔除筛选标记，得到具有食用安全性的番茄品种，进行品种培育。发明人首先提供了一种包含S1MYB12基因的DNA片段，其S1MYB12基因的基因序列如SEQID NO 1所示，除此之外，本发明还保护了基于上述基因片段的基本上相当于SEQID NO :1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO :1所示序列的亚片段，上述DNA片段均具有赋予茄科植物积累类黄酮(如芦丁、山奈酚芸香苷和柚皮素查尔酮等)和咖啡酰奎尼酸的能力。本发明的发明人首先通过特异引物S1MYB12F1，其基因序列如SEQ ID N0:2所示，和SIMYB12R1，其基因序列如SEQ ID NO : 3所示，采用现有技术高保真扩增全长SIMYB12基因，获得基因序列如SEQ ID NO :1所示的基因片段。之后发明人通过特异引物E8PF1，其基因序列如SEQ ID NO :4所示，和E8PR1，其基因序列如SEQ ID NO 5所示，以番茄品种中蔬4号基因组DNA为模版，组合扩增出编码E8启动子的DNA序列，其基因序列如SEQ ID NO: 6所不。在获得上述两段基因片段之后，采用Xho I-Spe I双酶切后去掉GFP片段并用上述两段基因片段替换掉常用植物表达载体PX6-GFP中的GFP基因，最终即可获得植物表达载体 pX6-E8: :S1MYB12。
最终获得的植物表达载体pX6-E8: :S1MYB12，导入农杆菌工程菌株AGL1。通过叶盘法转化番茄品种Micro-Tom、CS109-03、圣女果，分别获得PCR阳性转基因植株。利用HPLC对转基因株系的番茄果实进行了类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量检测，三个番茄转基因材料的果实中以上物质的含量都有明显的提高。在上述技术的基础上，根据已经克隆的S1MYB12基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选可得到本发明的基因或同源基因。同样，米用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的S1MYB12基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含S1MYB12基因的序列包括基因片段的基本上相当于SEQ ID NO :1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO:I所示序列的亚片段，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。综上所述，本发明的发明人在国际上首次提供了一种可以赋予茄科植物积累类黄酮包括芦丁、山奈酚芸香苷和柚皮素查尔酮等，以及咖啡酰奎尼酸能力的DNA片段，该片段 从番茄中获得，包含番茄类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成调控基因S1MYB12，发明人提供了该片段的分离克隆、功能验证和应用的具体方法；本发明利用番茄果实特异性表达启动子ES，驱动番茄内源基因S1MYB12在番茄果实中特异表达，大大提高了番茄果实中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量，验证了番茄内源S1MYB12基因具有调节类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成的功能；同时建立在此基础上，以栽培型小果番茄作为生物反应器生产类黄酮和咖啡酰奎尼酸生物制品，实行产业化；也可以此获得番茄的工程细胞，通过细胞培养方式生产类黄酮和咖啡酰奎尼酸。同时本发明中用的转化载体可以通过雌二醇的诱导作用剔除筛选标记，得到具有食用安全性的番茄品种，进行品种培育。
图I为本发明的全过程流程图；图2为E8启动子和S1MYB12基因PCR扩增后电泳图，图中 M 为 TaKaRa DNA Marker DL2, 000,1 为 E8 启动子，2 为 S1MYB12 基因；图3为E8启动子TA克隆经EcoR I酶切后电泳图，图中M为Trans2K DNA Marker, I和2为E8启动子阳性克隆；图4为过渡载体pX6-E8经Xho I-Spe I酶切后电泳图，图中M为rans2K DNA Marker, 2、5和6为pX6_E8阳性克隆，1、3和4为构建错误的克隆；图5为pX6-E8: :S1MYB12重组质粒Spe I酶切鉴定电泳图，图中M为DNA Marker，3为pX6_E8: : S1MYB12阳性克隆，剩余为构建错误的克隆；图6为番茄遗传转化不同时期的示意图；图中A为愈伤组织诱导后示意图；B为分化产生不定芽时示意图；C为再生苗生根不意图；D为转基因苗移栽大田后植株不意图；E为TO代转基因果实不意图；图7为转基因植株中目的基因S1MYB12的PCR检测结果示意图，图中M为TaKaRa λ-EcoT14 I digest，Pl为阳性对照，Ρ2为阴性对照，3-8为转基因植株；图8为野生型(Micro-Tom，CD07T-CK)和转基因果实果肉(CD07T-2)提取液HPLC分析结果示意图，图9为转基因番茄果实(⑶09T-11)果皮与果肉提取液HPLC分析结果示意图，图中SI为绿原酸；S2为芦丁 ；S3为山奈酚芸香苷；S4为3，4，5-三咖啡酰奎尼酸；S5为柚皮素查尔酮；图10为野生型(圣女果)和转基因果实果皮(⑶09T-11)提取液HPLC分析结果示意图，图中SI为绿原酸；S2为芦丁 ；S3为山奈酚芸香苷；S4为3，4，5-三咖啡酰奎尼酸；S5为柚皮素查尔酮；图11为果实成熟不同时期芦丁含量变化(⑶08T-1)示意图。
具体实施方式
以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；本发明中所涉及的多种培养基具体如下MS 培养基100mL10XMSmax，IOmLlOOXMSmin, 10mL100XFe2-EDTA，IOmLlOO X Tomato Vitamin, 30g鹿糖,氢氧化钾或盐酸调pH至5. 7_5. 8,定容至1L。若为MS固体培养基，加入0. 8%琼脂粉。番茄预、共、后培养基在上述MS培养基基础上，添加生长素(喷哚三乙酸)和玉米素，终浓度分别为0. 2mg/L和2mg/L。番茄分化培养基在上述MS培养基基础上，使用前添加羧苄青霉素和卡那霉素，终浓度分别为400mg/L和30mg/L。番茄生根培养基在MS培养基基础上，添加生长素和羧苄青霉素，终浓度分别为0. lmg/L 和 400mg/L。实施例I果实特异性E8启动子和S1MYB12基因全长cDNA的克隆，植物表达载体的构建I.番茄果实特异性E8启动子和S1MYB12基因cDNA的克隆以番茄品种中蔬4号基因组DNA为模版，引物E8PF1，其基因序列如如SEQ ID NO:4所示，和E8PR1，其基因序列如如SEQ ID NO 5所示，组合扩增，得到预期I. Ikb片段(图2所示)。进而将E8PF1/R1组合扩增产物进行TA克隆，连接到PCR产物克隆载体pGEM_T Easy载体。转化大肠杆菌DH5a，获得大量克隆。利用特异性引物组合E8PF1/R1对随机挑选的12个克隆进行菌落PCR鉴定，得到8个有目标片段插入的克隆。随机挑选两个克隆提取质粒并使用EcoR I酶切验证，确认其携带目标片段(图3所示)，该片段经测序验证，其为编码E8启动子的DNA序列。根据RT-PCR方法，以番茄Micro-Tom来源的RNA为模板合成第一链cDNA，进而以第一链cDNA为模板，通过特异引物S1MYB12F1，其基因序列如如SEQ ID N0:2所示，和S1MYB12R1，其基因序列如如SEQ ID NO :3所示，高保真扩增全长S1MYB12基因，约Ikb (图2所示)。测序结果显示所扩增的S1MYB12与数据库中序列一致，表明克隆成功。
pX6载体选用现有的PX6-GFP，通过常规的Xho I-Spe I双酶切后去掉GFP片段后备用，以与上述E8启动子克隆以及S1MYB12基因连接构建pX6-E8: :S1MYB12载体。试验中用到的引物序列及说明见下表。
权利要求
1.一种赋予茄科植物积累类黄酮和咖啡酰奎尼酸能力的DNA片段，其基因序列如SEQID NO 1 所示。
2.根据权利要求I所述的DNA片段，其特征在于还包括包含有如SEQID NO :1所示基因序列的DNA片段。
3.根据权利要求I或2所述的DNA片段，其特征在于片段内至少包含全长的S1MYB12基因编码序列或经过修饰的该序列，该基因序列编码的蛋白质具有MYB类转录因子蛋白的结构。
4.根据权利要求3所述的DNA片段，其特征在于片段内还含有其他功能基因片段。
5.如权利要求I所述的基因片段在增加植物类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量上的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于利用如权利要求I所述的DNA片段构建植物表达载体pX6-E8: :S1MYB12，并利用该载体转化到茄科植物中增加茄科植物类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一种可以赋予茄科植物积累类黄酮包括芦丁、山奈酚芸香苷和柚皮素查尔酮等，以及咖啡酰奎尼酸能力的DNA，其基因序列如SEQ ID NO1所示，该片段从番茄中获得，包含番茄类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成调控基因S1MYB12，发明人提供了该片段的分离克隆、功能验证和应用的具体方法；本发明利用番茄果实特异性表达启动子E8，驱动番茄内源基因S1MYB12在番茄果实中特异表达，大大提高了番茄果实中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量，验证了番茄内源S1MYB12基因具有调节类黄酮和咖啡酰奎尼酸合成的功能。
文档编号A01H5/00GK102796746SQ20121027900
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者储朝辉, 丁新华, 周萌, 于丹丹 申请人:山东农业大学