专利名称：一种放射形土壤杆菌突变株及其制备β-1,3葡聚糖作为鱼虾抗病因子饲料添加剂的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，特别涉及到一种放射形土壤杆菌突变株及其制备β -I, 3葡聚糖作为鱼虾抗病因子饲料添加剂的方法。
背景技术：
β_1，3葡聚糖普遍存在于多种细菌、真菌、植物和酵母细胞壁中。上世纪北欧芬兰等国科学家，已实验证明β -I, 3葡聚糖能提高鱼虾抗病免疫力，其原理是鱼虾的巨噬细胞上有一种高度专一性的受体，这种受体能对β_1，3葡聚糖特殊的分子结构进行高度 转移的结合，从而活化巨噬细胞，增强其吞噬各种病菌、病毒的能力。此外，β_1，3葡聚糖还能和甲壳类动物(如虾等)血液中的一种专一性蛋白质反应，并与淋巴细胞上的专一受体结合，诱导颗粒性血淋巴细胞中的酚氧化酶释放，酶原经过β -I, 3葡聚糖催化成具有活性的酚氧化酶，这种酚氧化酶迅速将酚氧化成醌，而醌类的高反应活性可以杀死微生物(含病毒)，从而达到抗原免疫的效果，而β_1，4或β_1，6葡聚糖，则不具有上述的特殊功能。我国九十年代初，已成功从啤酒酵母细胞壁中提取β -I, 3葡聚糖。目前查到的相关专利文献有I.专利申请号2004100461741.3，公开了一种提取β-1，3-葡聚糖的方法，包括如下步骤1)碱处理向酵母细胞壁中加入NaOH反应，过滤收集沉淀物；2)酸处理向沉淀物中加入酸溶液反应，调节PH到4. 5，升温，过滤收集沉淀物3)有机溶剂浸提，冷冻干燥后即得。该发明制备工艺简单，工艺参数易于控制，产物β_1，3葡聚糖的得率和纯度都比较高。所得产物能显著提高肉仔鸡的生长和免疫功能，可广泛用于畜禽养殖业，调节畜禽的免疫机能。2.专利号200810153337. 0，公开了一种快速制备酵母β-1,3-葡聚糖的方法，是以酵母细胞或酵母细胞壁为原料，加入浓度为O. 5-1. 5Μ的NaOH溶液，放入高压锅中在O. 070-0. 140MPa下处理O. 3_lh后，冷却至室温，离心，用水稀释剩余的不溶物，离心，水洗；向沉淀物中加入体积浓度为1%_6%的冰乙酸溶液，升温到70-90°C，反应O. 5-lh后，离心收集沉淀物，水洗，剩余物用乙醇洗涤，抽滤；在干燥箱中干燥即可制得。用该方法制备酵母β -I, 3葡聚糖可大大缩短生产时间，制备得的β -I, 3葡聚糖可用于食品添加、医药保健以及化妆品行业，还可用于动物免疫，大大提高其附加值；对于酵母的综合利用有重要的意义。3.专利号200810238547. X，公开了一种利用酵母制备可溶性β-1,3-葡聚寡糖的方法，该方法包括碱预处理、酸水解和分离纯化，其中所述的分离纯化是将酸水解中制得的可溶性β_1，3-葡聚寡糖溶解后，经过由AG50W-X4层析柱与Bio-Gel Ρ4层析柱串联而成的分子筛层析系统进行分离纯化。该发明提供的β_1，3-葡聚寡糖制备方法操作较简单，所得寡糖种类较多，制备量大，可以重复操作，适用于工业化大规模生产。然而，上述三个专利所利用的啤酒酵母，其细胞壁β -I, 3葡聚糖含量低，只占干啤酒酵母细胞重量的3%-5%，在提取过程中，必需加入大量的强酸、强碱，而且强酸强碱法提取得率低，其生产结果，不但成本高，而且给环境带来污染，是不符合当代绿色环保的要求。专利号94108278. 4，公开了一种生产β _1，3_葡聚糖的方法，包括一种属于土壤杆菌、能生产β -I, 3-葡聚糖并且是磷酸烯醇丙酮酸羧酸酶活性不足或缺乏的微生物和一种生产β_1，3-葡聚糖的方法，即在培养基中培养所述微生物，然后将其回收。该发明的方法可以以高产率(以碳水化合物计)和高效率生产β_1，3-葡聚糖。该方法的不足之处在于工艺流程长，设备繁多，投资大，且有大量废水排放，产品售价昂贵，不适宜养殖户使用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种生产效率高，碳水化合物转化率高，成本低，工艺流程短、无发酵液污水排放且环保的微生物发酵制备β -I, 3葡聚糖作为鱼虾抗病因子饲料添加剂的方法。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的 一种放射形土壤杆菌突变株，其分类命名为放射形土壤杆菌突变株L-15，学名为Agrobacterium radiobacter(Beijerinck et van Deiden)Cohn mutant strainL-15,保藏编号为cctccM NO :2012294,保藏日期为2012年7月19日，保藏单位中国典型培养物保藏中心,保藏地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。以上所述放射形土壤杆菌突变株L-15是将保藏编号为As. I. 150的放射形土壤杆菌经过紫外线诱变、Co6tl诱变和等离子束诱变后筛选所得，所述保藏编号为As. I. 150的放射形土壤杆菌学名为 Agrobacterium radiobacter (Beijerinck et van Deiden)Cohn。以上所述紫外线诱变的操作步骤为把从中国典型培养物保藏中心购买回来的放射形土壤杆菌，保藏号为As. I. 150菌株，按照菌种保藏中心提供的说明书的方法进行活化，并转接到斜面培养基中，保存备用。(I)取对数生长期的保藏编号为As. I. 150的放射形土壤杆菌，以最大致死量的80%-90%的剂量进行紫外线照射，然后在黑暗中培养24小时，再稀释涂于平板筛选培养基，置30°C -35°C中培养48-96小时；(2)在平板筛选培养基上挑取蓝色菌落，接种在斜面培养基中，置30°C -35°C中培养24-48小时；(3)再将斜面培养基中的菌株分别接入基本发酵培养基中进行发酵，置于300C -35°C，以 150r/min-200r/min 振荡培养 48-96 小时；(4)发酵后选用β -1，3葡聚糖产量最高的菌株作为下一步诱变试验的出发菌株。以上所述Co6°诱变的操作步骤为(I)将紫外线诱变所得的出发菌株，用Co6tl照射进行诱变，照射剂量为600-1000GY，照射后的菌液，在黑暗中培养24小时，再稀释涂平板筛选培养基，置30 0C -35°C中培养48-96小时；(2)在平板筛选培养基上挑取蓝色菌落，接种在斜面培养基中，置30°C -35°C中培养24-48小时；(3)再将斜面培养基中的菌株分别接入基本发酵培养基中进行发酵，置于30°C -35°C，以 150r/min-200r/min 振荡培养 48-96 小时；(4)发酵后选出3个β -1，3葡聚糖产量较高的菌株，作为等离子束诱变的出发菌株。以上所述等离子束诱变的操作步骤为(I)用无菌生理盐水将Co6°诱变后选出的菌株洗入烧瓶中，振荡10分钟，得到菌液；(2)将菌液稀释至10-lcfu/ml，取O. 2mL，滴在无菌培养皿中吹干，用13mA，20Kev的低能氮离子束轰击，其剂量为10X26X1013ions/cnTl00X26X 1013ions/cm2 ；(3)轰击后将菌株接入基本发酵培养基中进行发酵，置于30°C -35°C，以150r/min-200r/min振荡培养48-96小时，即得放射形土壤杆菌突变株L-15。 以上所述平板筛选培养基是由质量体积比分别为1%葡萄糖，O. 5%酵母膏，O. 001%-0. 008%苯胺蓝染料和2%琼脂组成，其pH值为7. 0-7. 8。以上所述斜面培养基是由质量体积比分别为O. 3%牛肉膏，O. 5%蛋白胨，O. 5%氯化钠，O. 1%-0. 15%玉米浆水解液和2%琼脂组成，其pH值为7. 0-7. 8。以上所述基本发酵培养基是由质量体积比分别为4%蔗糖，O. 1%磷酸氢二铵，O. 1%磷酸二氢钾，O. 05%七水硫酸镁，O. 005%七水硫酸亚铁，O. 1%-0. 15%玉米浆水解液，O. 002%氯化钴，O. 001%硫酸锌和O. 001%硫酸锰组成，其pH值为7. 0-7. 8。上述放射形土壤杆菌突变株制备β -I, 3葡聚糖作为鱼虾抗病因子饲料添加剂的方法，包括以下步骤(I)斜面种子培养将放射形土壤杆菌突变株L-15接种在斜面培养基，置于30 0C -35°C培养24小时；(2)液体菌种培养将步骤(I)的放射形土壤杆菌突变株L-15，用接种环挑取一环菌种，接种于装有50mL基本发酵培养基的250mL三角瓶中，置30°C -35°C摇床上，以150r/min-200r/min振荡培养24小时,得到一级种子培养液；(3)菌种一级扩大培养取一级种子培养液，按接种量5%_10%，加入装有200mL基本发酵培养基的500mL三角瓶中，置30°C -35°C，以150r/min_200r/min振荡培养24-48小时，得到二级种子培养液；(4)取二级种子培养液，按接种量5%_10%，加入到装有35L基本发酵培养基的50L种子发酵罐中培养24-48小时，罐中温度控制在30°C -35°C，以150r/min_200r/min速度搅拌,通气量为O. 5M3-2M3时，保持罐压O. 05MPa-0. IMPa ；(5)将步骤(4)培养后的种子液，压入装350L发酵培养基的500L发酵罐中，调罐温30°C -35 °C,以150r/min-200r/min速度搅拌，通气量为10M3_20M3时，保持罐压O. 05MPa-0. IMPa，培养90-100小时后，停止搅拌，保温保压2-12小时，即可得到β _1，3葡聚糖含量4%以上的发酵液；向上述所得发酵液加入100目-200目的麸皮，搅拌均匀，经60°C-8(TC干燥，即为β-1，3葡聚糖鱼虾抗病因子饲料添加剂，也可以将发酵液直接与鱼虾饲料搅拌均匀，凉干后即可直接喂鱼虾。以上所述发酵培养基是由质量体积比分别为7%蔗糖、O. 1%磷酸氢二铵、O. 1%磷酸二氢钾、O. 05%七水硫酸镁、O. 005%七水硫酸亚铁、O. 1%-0. 15%玉米浆水解液、O. 002%氯化钴、O. 001%硫酸锌和O. 001%硫酸锰组成，其pH值为7. 0-7. 8。。与现有技术相比，本发明的有益效果是I.本发明采用放射形土壤杆菌突变株L-15，以蔗糖为主要原料，直接发酵生产β -I, 3葡聚糖，生产效率高，碳水化合物转化率高，成本低，发酵液与菌体溶解物，全部进行干燥，工艺流程短，无强酸强碱废水废液排放，是一条绿色促进我国水产养殖业可持续发展的有效途径。2.本发明的β_1，3葡聚糖产量高，达到4%以上，其原料蔗糖转化率达60%以上。3.应用本发明放射形土壤杆菌突变株L-15发酵制得的β -1，3葡聚糖鱼虾抗病因子饲料添加剂，能有效刺激对虾食欲，增强对虾免疫力，且对虾的产量提高，虾色好，有明显的抗病增重双重功效。
图I为β -1，3葡聚糖标准品的高效液相色谱；图2为本发明β -I, 3葡聚糖样品的高效液相色谱；图3为β -1，3葡聚糖标准品的气相谱图；图4为本发明β -I, 3葡聚糖样品的气相谱图；图5为β -1，3葡聚糖标准品的红外谱图；图6为本发明β -I, 3葡聚糖样品的红外谱图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。实施例I :一、把从中国典型培养物保藏中心购买回来的放射形土壤杆菌，保藏号为As. I. 150菌株，按照菌种保藏中心提供的说明书的方法进行活化，并转接到斜面培养基中，保存备用。二、在实验全过程所采用的培养基配方A :斜面培养基O. 3%牛肉膏，O. 5%蛋白胨，O. 5%氯化钠，O. 1%_0· 15%玉米浆水解液，2%琼脂，调ρΗ7. O—7. 8，常规灭囷。B :平板筛选培养基1%葡萄糖，O. 5%酵母膏，O. 001%-0. 008%苯胺蓝染料，2%琼脂，调ρΗ7· 0-7. 8，常规灭菌C :基本发酵培养基4%蔗糖，O. 1%磷酸氢二铵，O. 1%磷酸二氢钾，O. 05%七水硫酸镁，O. 005%七水硫酸亚铁，O. 1% — O. 15%玉米浆水解液，O. 002%氯化钴，O. 001%硫酸锌，O. 001%硫酸锰，调ρΗ7· 0-7. 8。D :发酵培养基7%蔗糖，O. 1%磷酸氢二铵，O. 1%磷酸二氢钾，O. 05%七水硫酸镁，O. 005%七水硫酸亚铁，O. 1% — O. 15%玉米浆水解液，O. 002%氯化钴，O. 001%硫酸锌，O. 001%硫酸锰，调ρΗ7· 0-7. 8。三、诱变实验A :紫外线诱变试验①预备试验按常规方法，先做放射形土壤杆菌As. I. 150菌株的生长曲线试验，取对数生长期的菌液做紫外线照射最大致死率试验，我们是取致死量80%-90%的剂量进行紫外线照射诱变试验。②紫外线照射试验 取对数生长期的菌株As. I. 150菌液，以最大致死量的80%_90%的剂量照射，照射后的菌液，在黑暗中培养24小时，再稀释涂固体培养基平板，置30°C -35°C中培养48-96小时，在平板培养基上出现不同形态的突变株。如表I所示。表I不同菌落形态突变株的特点
笫-■种鏡第二种W落第二种爾落
形态突变株__形态突变株__.形态突变株
"一 , 表面粘稠，边缘光滑，白边缘呈放射状，表而干表面干燥，边缘光滑，黄 形态特点
—__色，圆形爾落燥，白色》圆形崗热__色圆形菌落
在染色平板
上的变色情变蓝色不变蓝色不变蓝色
况____
^ , mmmn>淡黄色，x发酵液澄沽，&色，χβ 发酵: 为货色· μ沾·* tr_、'、 臭味，众葡聚糖产生臭味，尤葡聚糖产牛酸兑味，尤葡聚糖产卞从众多变蓝色菌落中，挑取80个菌落，分别接种在斜面培养基中，置30°C _35°C中培养24-48小时，然后分别接入基本发酵培养基中，置30°C -35°C,以150r/min_200r/min振荡培养48-96小时。发酵结束，用苯酚硫酸法测定葡聚糖含量，试验结果为表2所示表2紫外线诱变后不同菌株产葡聚糖量
菌株编号D47 >26 Μ5EMO1X73
产葡聚糖靖
1.601.901.74I 9H2.01
(g/100mL)最后，选用D-73菌株作为下一步诱变试验的出发菌株。B =Co60诱变试验(I)采用紫外诱变的突变菌D-73，作为出发菌株，进行Co6°照射诱变试验。将紫外线诱变所得的出发菌株，用Co6°照射进行诱变，照射剂量为600-1000GY，目的在于提高菌株发酵生产葡聚糖的产率；照射后的菌液，在黑暗中培养24小时，再稀释涂平板筛选培养基，置30°C -35°C中培养48-96小时；(2)在平板筛选培养基上挑取蓝色菌落，接种在斜面培养基中，置30°C -35°C中培养24-48小时；
(3)再将斜面培养基中的菌株分别接入基本发酵培养基中进行发酵，置于 300C -35。。，以 150r/min-200r/min 振荡培养 48-96 小时；(4)发酵后选出3个P -1，3葡聚糖产量较高的菌株。试验结果如表3所示。表3Co6°照射诱变后，不同菌株的产葡聚糖量
权利要求
1.ー种放射形土壤杆菌突变株，其特征在于该突变株的分类命名为放射形土壤杆菌 L-15,Agrobacterium radiobacter (Beijerinck et van Deiden) Cohnmutant strain 1-75,保藏编号为cctcc M NO :2012294,保藏日期为2012年7月19日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
2.根据权利要求I所述的放射形土壤杆菌突变株，其特征在于所述放射形土壤杆菌突变株L-15是将保藏编号为As. I. 150的放射形土壤杆菌经过紫外线诱变、Co6tl诱变和等离子束诱变后筛选所得，所述保藏编号为As. I. 150的放射形土壤杆菌学名为Agrobacteriutnradiobacter (Beijerinck et van Deiden)しohn。
3.根据权利要求2所述的放射形土壤杆菌突变株，其特征在干，所述紫外线诱变的操作步骤为 取对数生长期的保藏编号为As. I. 150的放射形土壤杆菌的菌液，以最大致死量的80%-90%的剂量进行紫外线照射，然后在黑暗中培养24小时，再稀释涂于平板筛选培养基，置30°C -35°C中培养48-96小时； 在平板筛选培养基上挑取蓝色菌落，接种在斜面培养基中，置30°C -35°C中培养24-48小时； 再将斜面培养基中的菌株分别接入基本发酵培养基中进行发酵，置于30°C -35°C,以150r/min-200r/min 振荡培养 48-96 小时； 发酵后选用β -I, 3葡聚糖产量最高的菌株作为下ー步诱变试验的出发菌株。
4.根据权利要求3所述的放射形土壤杆菌突变株，其特征在于，所述Co6°诱变的操作步骤为 将紫外线诱变所得的出发菌株，用Co6tl照射进行诱变，照射剂量为600-1000GY，照射后的菌液，在黑暗中培养24小吋，再稀释涂平板筛选培养基，置30°C -35°C中培养48-96小时； 在平板筛选培养基上挑取蓝色菌落，接种在斜面培养基中，置30°C -35°C中培养24-48小时； 再将斜面培养基中的菌株分别接入基本发酵培养基中进行发酵，置于30°C -35°C,以150r/min-200r/min 振荡培养 48-96 小时； 发酵后选出3个β -1，3葡聚糖产量较高的菌株。
5.根据权利要求4所述的放射形土壤杆菌突变株，其特征在干，所述等离子束诱变的操作步骤为(1)用无菌生理盐水将Co6°诱变后选出的菌株洗入烧瓶中，振荡10分钟，得到菌液； (2)将菌液稀释至KTcfu/ml，取O.2mL，滴在无菌培养皿上，在无菌操作台上吹干，用13mA,20Kev 的低能氮离子束轰击，其剂量为 10X26X1013 ions/cm2 100X26X 1013ions/cm2 ； (3)轰击后将菌株接入基本发酵培养基中进行发酵，置于30°C-35 °C,以150r/min-200r/min振荡培养48-96小吋，即得放射形土壤杆菌突变株L-15。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的放射形土壤杆菌突变株，其特征在于所述平板筛选培养基是由质量体积比分别为1%葡萄糖，O. 5%酵母膏，O. OOP/o-O. 008%苯胺蓝染料和2%琼脂组成，其pH值为7. 0-7. 8。
7.根据权利要求3-5中任一项所述的放射形土壤杆菌突变株，其特征在于所述斜面培养基是由质量体积比分别为O. 3%牛肉膏，O. 5%蛋白胨，O. 5%氯化钠，O. 1%-0. 15%玉米浆水解液和2%琼脂组成，其pH值为7. 0-7. 8。
8.根据权利要求3-5中任一项所述的放射形土壤杆菌突变株，其特征在于所述基本发酵培养基是由质量体积比分别为4%蔗糖，O. 1%磷酸氢ニ铵，O. 1%磷酸ニ氢钾，O. 05%七水硫酸镁，O. 005%七水硫酸亚铁，O. 1%-0. 15%玉米浆水解液，O. 002%氯化钴，O. 001%硫酸锌和O.001%硫酸锰组成，其pH值为7. 0-7. 8。
9.一种如权利要求1-8中任一项所述的放射形土壤杆菌突变株制备β -I, 3葡聚糖作为鱼虾抗病因子饲料添加剂的方法，其特征在于包括以下步骤 将放射形土壤杆菌突变株L-15接种于斜面培养基和基本发酵培养中培养，得到ニ级种子培养液； 取ニ级种子培养液，按接种量5%-10%，加入到装有35L基本发酵培养基的50L种子发酵罐中培养24-48小时，罐中温度控制在30°C -35°C,以150r/min_200r/min速度搅拌，通气量为 O. 5 M3-2M3 时，保持罐压 O. 05MPa-0. IMPa ； 将步骤(2)培养后的种子液，压入装350L发酵培养基的500L发酵罐中，调罐温30 V -35 V，以150r/min-200r/min速度搅拌，通气量为10M3_20M3时，保持罐压O.05MPa-0. IMPa，培养90-100小时后，停止搅拌，保温保压2-12小时，即可得到β _1，3葡聚糖含量4%以上的发酵液。
10.根据权利要求9所述的放射形土壤杆菌突变株制备β-1，3葡聚糖作为鱼虾抗病因子饲料添加剂的方法，其特征在于，所述ニ级种子培养液的培养步骤如下斜面种子培养将放射形土壤杆菌突变株L-15接种在斜面培养基，置于.30 0C -35°C培养24小时； 液体菌种培养将步骤(I)的放射形土壤杆菌突变株L-15，用接种环挑取ー环菌种，接种于装有50mL基本发酵培养基的250mL三角瓶中，置30°C -35°C摇床上，以150r/min-200r/min振荡培养24小时,得到一级种子培养液； 菌种ー级扩大培养取ー级种子培养液，按接种量5%-10%，加入装有200mL基本发酵培养基的500mL三角瓶中，置30°C _35°C，以150r/min_200r/min振荡培养24-48小时，即得到ニ级种子培养液； 所述发酵培养基是由质量体积比分别为7%蔗糖、O. 1%磷酸氢ニ铵、O. 1%磷酸ニ氢钾、O. 05%七水硫酸镁、O. 005%七水硫酸亚铁、O. 1%-0. 15%玉米浆水解液、O. 002%氯化钴、O.001%硫酸锌和O. 001%硫酸锰组成，其pH值为7. 0-7. 8。
全文摘要
本发明公开一种放射形土壤杆菌突变株，其分类命名为放射形土壤杆菌突变株L-15，保藏编号为CCTCC NOM2012294；用上述放射形土壤杆菌突变株L-15发酵制备β-1,3葡聚糖作为鱼虾抗病因子饲料添加剂的方法，其步骤包括将放射形土壤杆菌突变株L-15接种于斜面培养基和基本发酵培养中，得二级种子培养液；取二级种子培养液加入装有35L基本发酵培养基的50L种子发酵罐中培养24-48小时，再将所得种子液压入装有350L发酵培养基的500L发酵罐中培养90-100小时，即得β-1,3葡聚糖含量4%以上的发酵液。本发明具有生产效率高、成本低、工艺流程短、无发酵液污水排放且环保等优点。
文档编号A23K1/18GK102827791SQ20121028175
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者周河治, 杨辉, 周延华, 梁海秋 申请人:广西大学