专利名称：用于防治花生青枯病的拮抗菌s20及其制备的微生物有机肥料和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物领域，涉及用于防治花生青枯病的拮抗菌S20及其制备的微生物有机肥料和应用。
背景技术：
花生青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种土传病害，一旦发生，通常造成20%-30%的花生死亡，严重时高达60%以上，甚至绝收。由于目前还没有有效的化学农药，对花生青枯病的防治主要依靠作物轮作和选育抗病品种。随着绿色农业的发展，对花生青枯病的防治重点逐渐转向以生物防治为主的综合防治，筛选高效拮抗菌株是进行生物防治的核心，同时将拮抗菌株和有机肥结合开发成既能够抗病又可以改善 土壤结构的微生物有机肥料越来越受到人们的重视。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一株用于防治花生青枯病的拮抗菌S20。本发明的另一目的是提供该拮抗菌S20的应用。本发明的又一目的是提供该拮抗菌S20制备的微生物有机肥料及其制备方法和应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现用于防治花生青枯病的拮抗菌S20,属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens), 2011年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 5139。所述的用于防治花生青枯病的拮抗菌S20的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，杆状，产芽孢。菌株S20在NA平板表面生长的菌落呈圆形，不透明，白色，表面有褶皱，无光泽，边缘整齐，不产色素。发酵葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇，木糖产酸，能水解淀粉和液化明胶，接触酶、硝酸盐还原反应、V-P反应均为阳性，而甲基红反应为阴性。本发明所述的用于防治花生青枯病的拮抗菌S20在制备生物有机肥中的应用。利用本发明所述的保藏号为CGMCC No. 5139的拮抗菌S20所生产的微生物有机肥料。所述的微生物有机肥料中含有2. OX IO9个/g及以上的拮抗菌S20、全氮含量为30. 5gkg4,全磷含量为12. Ig kg'全钾含量为20. 4g kg'本发明所述的微生物有机肥料的生产方法，包括如下步骤I)将权利要求I所述的保藏号为CGMCC No. 5139的拮抗菌S20接种到PDA培养液中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为初始PH范围为7. 0-7. 2，培养温度25-30°C，150-180转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵获得的S20拮抗菌液含菌或芽孢量> 5 X IO9个/ml ；2)有机肥的制备以腐熟的猪粪堆肥和氨基酸有机肥以体积比6 4比例混合制成；3)将所述的拮抗菌S20菌液按体积质量比20%的比例接种到步骤2)所述有机肥中进行固体发酵，发酵温度为30-50°C，发酵过程中每天翻堆I次，发酵周期5-7天，使拮抗菌S20含量达到2. OX IO9个/g及以上，最后在温度不超过60°C的条件下将含水量蒸发至30%以下即为获得的防治花生青枯病的微生物有机肥料。其中，步骤I)所述的PDA培养液配制方法为，以配制IL培养基为例用200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g蔗糖，定容至1000ml，pH 值调至 7. 2-7. 4，121°C 灭菌 20min。
所述的腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为I. 2-2%，含水量25-30%。本发明所述的微生物有机肥料在防治花生青枯病中的应用。有益效果本发明涉及一种能克服或消除连作花生青枯病的拮抗菌、微生物有机肥料及其生产方法，利用猪粪堆肥和氨基酸有机肥混合物，再与拮抗菌液混合后制成微生物有机肥料，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点I)该肥料产品中含有抑制花生青枯病病原细菌生长的专一性高效菌株——解淀粉芽孢杆菌S20(CGMCC No. 5139)。田间试验结果表明，在含有花生青枯病的土壤上施用本产品后，花生青枯病的生物防治率高达60%以上。2)该肥料为有机肥，含有丰富的有机质，含有丰富的氨基酸和小分子多肽。有机肥料中含有的丰富营养不仅促进了植物的生长，也为其中的拮抗菌提供了生长繁殖的条件，使其在土壤中存活下来并形成优势种群，从而发挥防病作用。3)由于是生物菌株制剂，完全没有如化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于花生的无公害生产，农民可以不用或减少化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少了农产品中的农药残留，有利于农产品的出口。同时，该微生物有机肥料还有增产功能，可为农民增加收入。
图I.拮抗菌S20对花生青枯病病原菌的抑制生物样品保藏信息用于防治花生青枯病的拮抗菌S20，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2011年8月15日，保藏号为CGMCC No. 5139。
具体实施例方式实施例I菌株的分离和鉴定以花生青枯病病原菌青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum, DSM No. 9544)为指示菌，从来自于江西省鹰潭市花生青枯病发病田块中的健康花生植株根际土壤中分离拮抗菌。再通过盆栽试验最终筛选出高效拮抗菌株S20 (图1)，鉴定到属种，属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),菌种于30%甘油中一 70°C保存。将拮抗菌S20送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2011年8月15日，保藏号为 CGMCC No. 5139。拮抗菌S20,属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，杆状，产芽孢。菌株S20在NA平板表面生长的菌落呈圆形，不透明，白色，表面有褶皱，无光泽，边缘整齐，不产色素。发酵葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、木糖产酸，能水解淀粉和液化明胶，接触酶、硝酸盐还原反应、V-P反应均为阳性，而甲基红反应为阴性。实施例2菌剂生产
I)拮抗菌S20 (CGMCC No. 5139)菌株接种到PDA培养液中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为初始pH范围为7. 0-7. 2，培养温度30°C，170转/分钟，发酵48h后形成芽孢，获得S20拮抗菌发酵液含菌或芽孢量> 5 X IO9个/ml ；所用PDA培养液配制方法为，以配制IL培养基为例用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至
7.2-7. 4，121。。灭菌 20min。2)有机肥(OF)的制备以腐熟的猪粪堆肥和氨基酸有机肥(江苏新天地氨基酸肥料有限公司产品，登记证号苏农肥(2008)准字0180号，肥料规格N+P205+K20彡6%有机质彡30%氨基酸彡5%)以体积比6:4混合制成。所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为I. 2-2%，含水量25-30%。
3)将步骤I)制备的S20拮抗菌液按20%(V/W)的比例接种到步骤2)所述的有机肥中进行二次固体发酵，发酵温度为30-50°C，发酵过程中每天翻堆I次，发酵发酵周期5-7天，使拮抗菌含量达到2. OX IO9个/g以上，获得拮抗菌S20的固体菌剂。最后在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，获得防治花生青枯病的微生物有机肥料(BOF)。用上述拮抗菌所生产的微生物有机肥(BOF)(防治花生青枯病的专用微生物有机肥料)，该肥料中含有彡2. OX IO9个/g的拮抗菌S20、全氮含量为30. 5g kg_S全磷含量为12. Ig kg—1、全钾含量为 20. 4g kg—1。实施例3田间试验试验在江西省鹰潭市连作花生地进行，设置以下3个处理，每个处理150m2，三次重复。I) CK (常规施肥)2)使用75kg /亩微生物有机肥3)使用150kg /亩微生物有机肥5月初种花生，对照按照当地常规施肥(尿素20kg/亩，钙镁磷肥40kg/亩，氯化钾20kg/亩)，微生物有机肥作为基肥一次性使用，不足的N，P, K用化肥补齐，以保证处理和对照同样的养分。8月中旬收获。花生成熟期调查青枯病的发生情况，计算防治效果。结果显示，使用75kg /亩微生物有机肥和使用150kg /亩微生物有机肥的处理对花生青枯病的生物防治率分别为61. 5%和74. 4% (表I )，花生产量分别比对照提高37. 5%和48. 7%。试验结果表明，施用微生物有机肥不但可以起到防治花生青枯病，大大减少土壤中青枯病原菌数量的作用，还促进花生根际微生物群落的变化，有益细菌、放线菌及真菌群落均显著增加(表2)。表I含有拮抗菌S20的有机肥对防治花生青枯病的效果
权利要求
1.用于防治花生青枯病的拮抗菌S20,属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens), 2011年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 5139。
2.权利要求I所述的用于防治花生青枯病的拮抗菌S20在制备生物有机肥中的应用。
3.用权利要求I所述的保藏号为CGMCCNo. 5139的拮抗菌S20所生产的微生物有机肥料。
4.根据权利要求3所述的微生物有机肥料，其特征在于所述的微生物有机肥料中含有2. OX IO9个/g及以上的拮抗菌S20、全氮含量为30. 5g kg_\全磷含量为12. Ig kg—1、全钾含量为20. 4gkg'
5.权利要求3或4所述的微生物有机肥料的生产方法，包括如下步骤 O将权利要求I所述的保藏号为CGMCC No. 5139的拮抗菌S20接种到PDA培养液中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为初始PH范围为7. 0-7. 2，培养温度25-30°C，150-180转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵获得的S20拮抗菌液含菌或芽孢量> 5 X IO9个/ml ； 2)有机肥的制备以腐熟的猪粪堆肥和氨基酸有机肥以体积比64比例混合制成； 3)将所述的拮抗菌S20菌液按体积质量比20%的比例接种到步骤2)所述有机肥中进行固体发酵，发酵温度为30-50°C，发酵过程中每天翻堆I次，发酵周期5-7天，使拮抗菌S20含量达到2. OX IO9个/g及以上，最后在温度不超过60°C的条件下将含水量蒸发至30%以下即为获得的防治花生青枯病的微生物有机肥料。
6.根据权利要求5所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤I)所述的PDA培养液配制方法为，以配制IL培养基为例用200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min,经过滤后滤液中加20g鹿糖,定容至1000ml, pH值调至7. 2-7. 4,121/C灭菌20min。
7.根据权利要求5所述微生物有机肥料的生产方法，所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量彡35%，有机氮质量比含量为I. 2-2%，含水量25-30%。
8.权利要求3所述的微生物有机肥料在防治花生青枯病中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于防治花生青枯病的拮抗菌S20及其制备的微生物有机肥料和应用，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了对花生青枯病病原细菌有显著拮抗作用的一株拮抗菌—解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)S20，利用该拮抗菌与有机堆肥制成抗病微生物有机肥料，肥料中含有2.0×109个/g以上的S20细胞，全氮含量为30.5g kg-1、全磷含量为12.1g kg-1、全钾含量为20.4gkg-1。试验表明，这种微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群，对花生青枯病防治率高达60％以上。
文档编号C05F17/00GK102827797SQ20121032664
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月6日 优先权日2012年9月6日
发明者沈其荣, 沈标, 杨兴明, 冉伟 申请人:南京农业大学