专利名称：一种黄河鲇三倍体的诱导方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类多倍体的诱导方法，特别是一种黄河鲇三倍体的诱导方法。
背景技术：
黄河鲇(Silurusasotus)隶属鲇形目(Siluriformes)、鲇科(Siluridae)、鲇属(Silurus)，是我国黄河流域分布广泛的一种优良淡水经济鱼类。其肉嫩味美，不具肌间刺，营养价值高，易实现产业化养殖。染色体组操作在鱼类育种中占有重要地位。二十世纪后期，国内外水产养殖业发展迅速，因而以提高养殖鱼类产量和质量为主要目的的染色体操作已成 为鱼类育种的热点。所谓染色体操作是通过物理或化学方法改变生物体内的染色体组成的一种生物技术。多倍体(polyploid)系指生物体体细胞中含有超过2个染色体组的个体。相对于二倍体，多倍体含有3个、4个或更多的染色体组，而依次被称为三倍体(triploid)、四倍体(tetroploid)和五倍体(pentaploid)等。在水产动物中现在研究最多的是三倍体。多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，染色体加倍则通过卵子第二极体的保留或受精卵早期有丝分裂的抑制而实现。根据鱼类受精细胞学的研究，精子入卵的时间是在第二次成熟分裂的中期，受精后排出第二极体。如果卵子受精后不排出第二极体，即它们不经过正常的减数分裂，形成了二倍体卵核，与单倍体精核结合后，就形成了三倍体。三倍体鱼主要有以下优势多倍体鱼类具有比较强的生活力、适应性和生长势；三倍体鱼类还具有抗病力强、肉质鲜美等特点；另外，三倍体鱼类是不育的，除了能提高生长速度外，对种质资源的保护也有重要意义，不至于因逃逸对野生资源造成遗传混杂。
目前三倍体的诱导方法有以下几种化学诱导三倍体的方法目前主要的化学诱导剂有细胞松弛素B( CB)、6_ 二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素和聚乙二醇(PEG)等。其缺点是成功率低；试验材料(受精卵)能用于试验处理的数量也受到限制；有些诱导剂毒性较大，有致癌性，难溶于水，且价格昂贵。物理诱导三倍体方法主要有温度休克法、静水压法、电融合法和高盐高碱法等。温度休克法和静水压法较常用而且效果较好。温度休克处理诱导率低，且死亡率较高；静水压处理需要专门设备，成本较高，样本容量有限。生物学诱导三倍体方法可以分为远缘杂交、核移植、细胞融合等3种。文献报道较多的是杂交，尤其是种间杂交的方法。周期较长、诱导率较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导黄河鲇三倍体简单、易操作、不需要专用设备和诱导成功率高、周期短的一种黄河鲇三倍体的诱导方法。实现本发明目的的技术方案是，一种黄河鲇三倍体的诱导方法，其特征在于有以下步骤
(I)人工催产用量为5000IU/kg鲇体的绒毛膜促性腺激素和25ug/kg鲇体的人工合成促黄体素释放激素对黄河雌鲇亲鱼进行催产，对黄河雄鲇亲鱼的催产用量为上述雌鲇用量的一半，上述催产均为一次性注射，催产后放入21 — 30 °C曝气自来水中培育，效应时间为 8—12h ；
(2)人工受精待黄河鲇亲鱼发情时，将亲鱼捞起，擦干体表，挤出雌鲇卵子于干净碗中，同时用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水温为25°C的曝气自来水中，搅拌均匀，使精卵充分结合；
(3)三倍体诱导用浓度为25mg/kg的秋水仙素，对上述受精卵进行处理
秋水仙素开始处理的时间为3 —15分钟，持续时间为25—35分钟，得到三倍体黄河鲇。本发明与现有技术比较具有方法简单、容易操作、不需要专用设备和诱导成功率高、周期短的显著优点。
图I是本发明黄河鲇三倍体诱导方法流程方框图。具体实施方法
结合上述流程方框图对本发明作详细描述，本发明有以下步骤
(1)人工催产对黄河鲇亲鱼采用绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体素释放激素或其类似物(LRH-A)进行催产。雌鲇剂量为HCG 5000 IU* kg ^+LRH-A 25 gg^kg-1，雄鲇剂量减半，均一次性注射，催产后放入30 °C曝气自来水中培育，效应时间10 h左右；
(2)人工受精待黄河鲇亲鱼发情时，将亲鱼捞起，擦干体表，挤出雌鲇卵子于干净碗中，同时用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水温25°C的曝气自来水，搅拌均匀，使精卵充分结合；
(3)三倍体诱导
A.秋水仙素的使用剂量25mg/L
B.秋水仙素开始处理的时间
精卵结合后，设计5 min、15 min、25 min、35 min 4种秋水仙素浸泡起始时间，持续浸泡30 min,以确定最佳秋水仙素浸泡起始时间。
起始时间(min) I存活率(％) I畸形率(％) _
5~ 19. I32.2
15~ 11.357.0
25~ 12.341.8
35~9.861. 3
O (对照组)170. 413. I—根据实验结果，受精后5min开始进行秋水仙素处理，诱导效果最佳，存活率最高，达到19. 1%。C.秋水仙素处理的持续时间
在受精后5 min，分别采用秋水仙素持续浸泡处理10 min、20 min、30 min、40 min 4种组合，做为秋水仙素浸泡持续处理时间，以确定秋水仙素浸泡处理最佳持续时间。
处理时间(min) I存活率(％)I畸形率(％)—
10~9.858. 3
20~8. 742.8
30— 17.430.4
40— 10.237.8
O(对照组)|69· 2\2. 3—根据实验结果，用秋水仙素处理30min,诱导效果最佳,存活率最闻，达到17.4%。倍性检测用染色体制片法检测诱导黄河鲇鱼的倍性，三倍体黄河鲇诱导率达到19. 1%。
本发明技术方案带来的有益效果
提供了一种诱导黄河鲇三倍体简单、易操作的方法，诱导率高、周期短，适宜批量进行，易于大规模推广。
权利要求
1.一种黄河鲇三倍体的诱导方法，其特征在于有以下步骤 (1)人工催产用量为5000IU/kg鲇体的绒毛膜促性腺激素和25ug/kg鲇体的人工合成促黄体素释放激素对黄河雌鲇亲鱼进行催产，对黄河雄鲇亲鱼的催产用量为上述雌鲇用量的一半，上述催产均为一次性注射，催产后放入21 — 30 °C曝气自来水中培育，效应时间为 8—12h ； (2)人工受精待黄河鲇亲鱼发情时，将亲鱼捞起，擦干体表，挤出雌鲇卵子于干净碗中，同时用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水温为25°C的曝气自来水中，搅拌均匀，使精卵充分结合； (3)三倍体诱导用浓度为25mg/kg的秋水仙素，对上述受精卵进行处理 秋水仙素开始处理的时间为3 —15分钟，持续时间为25—35分钟，得到三倍体黄河鲇。
全文摘要
本发明公开了一种黄河鲇三倍体的诱导方法，(1)人工催产用量为5000IU/kg鲇体的绒毛膜促性腺激素和25ug/kg鲇体的人工合成促黄体素释放激素对黄河雌鲇亲鱼进行催产，对黄河雄鲇亲鱼的催产用量为上述雌鲇用量的一半，上述催产均为一次性注射，催产后放入21—30℃曝气自来水中培育，效应时间为8—12h；(2)人工受精待黄河鲇亲鱼发情时，将亲鱼捞起，擦干体表，挤出雌鲇卵子于干净碗中，同时用吸管吸出雄鲇精液，逐滴滴加于卵子之上，然后迅速加入水温为25℃的曝气自来水中，搅拌均匀，使精卵充分结合；(3)三倍体诱导用浓度为25mg/kg的秋水仙素，对上述受精卵进行处理秋水仙素开始处理的时间为3—15分钟，持续时间为25—35分钟，得到三倍体黄河鲇。
文档编号A01K61/00GK102812914SQ20121033805
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者李学军, 李爱景, 程果, 彭新亮, 乔志刚, 聂国兴, 孔祥会 申请人:河南师范大学