专利名称：肌醇多磷酸2-激酶基因及其用途的制作方法
技术领域：
本申请享有2004年9月9日申请的U. S.临时申请No. 60/608, 244的权益。本发明涉及植物分子生物学领域。具体地，本发明涉及编码酶肌醇多磷酸2-激酶(IPP2-K)基因的鉴定和用途，该酶涉及植物中的植酸生物合成途径，并涉及这些基因及其突变体降低植物种子和含有该种子的食物或饲料中的植酸水平和/或提高含磷的非植酸(non-phytic acid phosphorous)水平的用途。
背景技术：
已经充分认识了磷(pho sphorOU s )在动物营养中的作用。在给动物提供结构的骨骼中发现了动物体内百分之八十的磷。动物百分之二十的磷发现于软组织中，其中涉及无数的生化反应，包括DNA、RNA、磷脂和一些B族维生素的合成和活性。尽管磷对动物健康是关键的，但不是饲料中所有的磷是生物可利用的。myo-肌醇1，2，3，4，5，6-六-kis-磷酸盐，通常称为植酸，是许多植物种子和蔬菜组织如根和块茎中存在的大量分子。植酸盐(或肌醇六磷酸盐)是种子中磷的主要存储形式，通常代表种子全部磷(P)的65%至80%。当非反刍动物食用基于种子的膳食时，所食用的植酸在消化道中形成几种营养重要矿物质的盐。这些盐的排泄降低了磷和矿物质两者的保留和利用(即，生物利用率)。因此，这导致食用种子的人和动物的矿物质缺乏。此外，动物废料中结合植酸的磷引起了地表和地下水 的污染。已经提出了几种方法来降低种子中的植酸内含物对膳食、磷和矿物质保留和环境的负面影响。方法包括通过收集后干涉除去膳食植酸和遗传上降低种子的植酸含量。US5, 689, 054 (玉米)和US6，111，168 (大豆)中提出了含降低植酸的种子的权利要求。WO00/73473,WO 99/05298,US 6，197，561 和 US 6，291，224 中讨论了通过处理肌醇1-磷酸合成酶(myo-1nositol1-phosphate synthase)而改变肌醇六憐酸盐的水平。W099/37786中讨论了通过用肌醇甲基转移酶分流4-0-甲基内消旋肌醇而改变肌醇六磷酸盐的水平。US6, 197，561提出了通过改变其他酶的数量来改变肌醇六磷酸盐的水平，这些酶包括磷脂酰肌醇-3-激酶、myo-肌醇1，3，4-三磷酸5/6-激酶、myo-肌醇单磷酸酶_3、肌醇多磷酸5-磷酸酶、D-myo-肌醇-3-磷酸合酶、D-myo-肌醇三磷酸盐3-激酶、myo-肌醇转运蛋白、玉米植酸酶、磷脂酰肌醇转运蛋白、磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶、磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶、myo-肌醇单磷酸酶-1、磷脂酰肌醇4-激酶、磷脂酰肌醇(4，5)双-磷酸5-磷酸酶、磷脂酰肌醇合酶。US6, 399，861、US6, 303，766、US5, 994，628、US5, 714，474 和US5, 543，576中还公开了植酸酶的植物/种子表达，植酸酶是一种能够降解肌醇六磷酸盐的酶。US2003/0009011 (W002/059324)公开了肌醇多磷酸激酶基因和用于调节肌醇六磷酸盐水平的用途，另外提出了鉴定其他肌醇多磷酸激酶基因的保守序列。US2003/0079247(W003/027243)公开了另外的肌醇多磷酸激酶基因，描述为肌醇1，3，4-三磷酸5/6-激酶基因家族。以上US5，689，054中描述的lpa2突变体含有多个该基因家族的突变(请参阅Plant Physiol. 2003 年 2 月；131 (2) :507_15)。尽管这些方法，仍然存在通过降低植酸水平和提高含磷的非植酸水平来提高植物特别是玉米营养成分的需要。IPP2-K酶催化多个导致植酸形成的步骤。它催化，例如ATP+肌醇1，4，5，6_四kis 憐酸盐(tetrakisphosphate)— ADP+ 肌醇五 kis 憐酸盐(pentakisphosphate)和 ATP+肌醇 I, 3, 4，5，6 五 kis 磷酸盐(pentakisphosphate)— ADP+肌醇 I, 2, 3, 4, 5, 6 六磷酸盐的反应。此外，该酶催化ATP+肌醇1，4，6-三磷酸盐一ADP+肌醇1，2，6-三磷酸盐的反应。发育中植物种子中IPP2-K酶活性的降低将中断植酸合成，因此降低种子中植酸的水平并使得饲喂种子的动物在代谢上更易于利用磷。本发明解决了通过提供编码全部或部分IPP2-K酶的核酸序列和用于操纵植物细胞中植酸生物合成途径的工具来提高磷酸盐生物利用率的需要
发明内容
根据本发明，提供了分离的植物多核苷酸，包括选自以下的成员(a)包括SEQ IDNO:1的多核苷酸；(b)包括与SEQ ID NO:1至少65%的序列同一性的多核苷酸，其中％序列同一性是基于完整的编码片段并通过使用默认参数的GAPlO分析测定；(c)包括与SEQID N0:1至少46%的序列同一性的多核苷酸，其中％序列同一性是基于完整的编码片段并通过使用默认参数的GAPlO分析测定；(d)编码包括SEQ ID NO:2多肽的多核苷酸；(e)包括使用基于SEQ ID NO:1和SEQID NO: 3的引物从植物核酸扩增的核酸序列的多核苷酸；(f)在严谨条件下与SEQID NO:1的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸，其中杂交条件包括600C O.1XSSC中的洗涤步骤；(g)编码玉米肌醇多磷酸-2-激酶的多核苷酸；(h)编码植物肌醇多磷酸-2-激酶的多核苷酸；(i)与(a)至(h)的多核苷酸互补的多核苷酸。本发明还涉及分离的蛋白质，包括选自以下的成员(a)包括SEQ ID N0:2的至少25个连续氨基酸的多肽；(b)包括与全长SEQ ID N0:2相比至少45%序列同一性的多肽，其中百分比序列同一性是基于完整序列长并通过使用默认参数的GAPlO分析测定；(c)由权利要求I的核酸编码的多肽；(d) SEQ ID NO:1编码的多肽；和(0具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽。本发明再一方面是分离的植物多肽，包括具有SEQ ID NO:2至少65%的序列同一性的氨基酸序列，其中多肽具有肌醇多磷酸2-激酶活性。本发明的另一方面是破坏植物组织中肌醇多磷酸2-激酶活性水平的方法，包括将植物组织接受诱变；从接受诱变的植物组织或其后代获得DNA样品；并测试DNA样品编码肌醇多磷酸2-激酶基因的损害。此外，本发明涉及含有人工诱导的编码肌醇多磷酸2-激酶基因损害的玉米种子。此外，本发明涉及含有人工诱导的编码肌醇多磷酸2-激酶基因损害的卡诺拉(canola)(油菜(Brassica napus))种子。再一实施方案中，本发明涉及降低动物饲料中植酸水平的方法，包括从含有编码肌醇多磷酸2-激酶基因损害的植物产生动物饲料，其中动物饲料具有降低水平的可利用肌醇六磷酸盐。本发明还涉及降低动物废料中磷水平的方法从包括编码肌醇多磷酸2-激酶基因损害的植物提供动物饲料。此外，本发明包括特征在于相对于物种的亲本种质具有低含量植酸的谷类植物物种的非致死突变种子，其中突变种子具有改变的肌醇多磷酸2-激酶活性。此外，本发明涉及通过将包括SEQ ID NO:2的多肽用作免疫原产生的纯化抗体。此外，本发明涉及用于转化植物细胞的载体，包括(a)与以下的基本上互补的反义核苷酸序列(I)编码肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子的一条链的相应部分，其中编码肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子在低严谨条件下与SEQ ID NO:1杂交或(2)由编码肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子编码的RNA序列的相应部分；和(b)可操作地将调节序列连接到反义核苷酸序列，使得反义序列在其转化进去的植物细胞中表达。必须提及的是本发明进一步涉及编码RNA分子的反义寡核苷酸或多核苷酸，该RNA分子与植物肌醇多磷酸2-激酶基因的RNA转录本的相应部分基本上互补，其中所述植物基因在低严谨条件下与SEQ ID NO:1杂交。本发明的再一方面是产生具有与基因敲除相关的所需性状的突变植物的方法，该方法包括提供收集的植物种子；用如EMS的化学诱变剂或选自UV、Y -照射、X-射线或快中子的照射来处理所述的植物种子集合；和选择具有所需性状的突变植物。本发明的再一 方面是分离的植物肌醇多磷酸2-激酶蛋白，包括至少一个选自以下的基序DAXDWXYXXEGXXNLXLXYXGSSP、VEIKXKCGFLXXSXXIXXXNXXKXXXXRXXMXQXCKXXXXXISXXSEYXPLDLFSGSKXXXXXAIKXXXXTPQNXXXXXXGSLXXGG, ISXXSEYXPLDLFSGSK、LXXLLXXQKLDXXIEGXIHXYY 和 LIXXTAXDCSXMISF。
图1A显示了在此要求保护的玉米IPP2-K与其它玉米肌醇激酶的相似性。低水平的序列相似性表明玉米IPP2-K是新的肌醇磷酸激酶。图1B显示了玉米IPP2-K蛋白质序列和来自玉米和其他物种的肌醇磷酸激酶之间的系统发生关系。从不同范围的物种(从人至拟南芥(Arabidopsis)推定的IPP2-K基因是密切相关的。相反，其他肌醇磷酸激酶被分到系统发生树的不同分枝中。多重比对算法使用 Clustal W 算法(NucleicAcid Research, 22 (22):4673_4680，1994)形成比对。简而言之，计算所有序列对之间的天然相似性，称为“等价比对(Parities alignment)”。然后将这些分数用于计算“导向树”或树状图，这表明了多重比对阶段，比对序列的次序用于最终的多重比对。拥有计算过的树状图，可以在越来越大的组中比对序列直至最终的比对中引入了完整的序列。图2显示了来自推定的植物IPP2-K基因的预测氨基酸序列的比较。图3显示了来自玉米近交系DAS5XH751的9681bp的IPP2-K的基因组结构。图4显示了使用32P- Y ATP的玉米IPP2-K的体外激酶活性，用放射性同位素标记的底物和TLC监测IP4和IP5底物。S卩，显示了 IPP2-K酶对IP4和IP5底物的体外活性。IPP2-K将肌醇1，4，5，6-四kis磷酸盐转化成肌醇五kis磷酸盐，和将肌醇1，3，4，5，6-五kis磷酸盐转化成肌醇六磷酸盐(肌醇六kis磷酸盐(hexakisphosphate))。泳道1:1PP2_K加肌醇1、4、5、6四kis磷酸底物；泳道2 IPP2-K加肌醇1、3、4、5、6五kis磷酸底物；泳道3 IPP2-K加肌醇1、4、5、6四kis磷酸底物；泳道4 :1PP2_K加肌醇1、3、4、5、6五kis磷酸底物。图5显示了如通过1H-NMR检测的在IPP2-K酶和AIP存在下，肌醇I，4，6_三磷酸盐体外转化成肌醇1，2，6-三磷酸盐。即，显示了含有ATP和DTT的D2O中的肌醇-1，4，6-三磷酸盐溶液的δΟΟΜΗζ1!! NMR谱。(A)加入ΙΡΡ2-Κ酶之前不久。(B)加入ΙΡΡ2-Κ酶两小时后。鉴定出对应于肌醇-1，4，6-三磷酸盐和肌醇-1，2，6-三磷酸盐的峰。区域3. 5-3. Sppm中的未标记峰对应于DTT，而那些3. 8-4. 8ppm的由ATP和ADP产生。肌醇-1，2，6-三磷酸盐的3’质子位于3. 67ppm的DTT峰下面。图6显示了玉米近交系DAS5XH751的种子提取物的磷-NMR谱，表明肌醇磷酸盐物质(species)存在。S卩，显示了玉米近交系DAS5XH751的种子提取物的磷NMR谱。在装备5-mmlH/13C/19F/31P探针的fcuker DRX-400NMR分光计上在400. 13MHz获得谱。将峰标记来表示产生信号的肌醇磷酸盐物质。IP6 :肌醇六磷酸盐(肌醇六kis磷酸盐)；IP5 :肌醇五kis磷酸盐；IP4 :肌醇四kis磷酸盐。
SEQ ID勵:1是近交系0八55乂!1751种子中编码玉米1 2-1(的00嫩的核苷酸序列。SEQ ID NO: 2是源自SEQ ID NO:1核苷酸序列的IPP2-K的推导氨基酸序列。SEQ ID NO: 3是玉米近交系5XH751的编码IPP2-K的基因组DNA的核苷酸序列。
具体实施例方式在此提供定义来帮助理解本发明。单位、前缀和符号以SI公认的形式来表示。除非另外指出，核酸是以从左至右5’至3’方向来书写；氨基酸序列是以从左至右氨基至羧基方向来书写。说明书内引用的数值范围包括限定范围的数字并包括限定范围内的每个整数。通过通常已知的三个字母符号或通过IUPAC-1UB Biochemical NomenclatureCommission (生化命名协会)推荐的一个字母符号来表示在此的氨基酸。同样，可以通过通常公认的单字母编码来表示核苷酸。除非另外提供，在此所用的软件、电、电子术语和TheNew IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electrnics Terms (电和电子术语的新IEEE标准字典)(第5版，1993)中定义的一样。以下限定的术语通过参照作为整体的说明书来更全面地限定。“反义RNA”指的是与全部或部分目标初级转录产物或mRNA互补并阻断目标基因表达的RNA转录产物(U. S.专利No. 5，107，065，在此引入作为参考)。反义RNA的互补性可以是特定基因转录本的任何部分，即，在5’ -非编码序列、3’ -非编码序列、内含子或编码序列。“功能RNA”指的是正义RNA、反义RNA、核酶RNA、RNAi或其他没有得到翻译但对细胞过程仍然具有影响的RNA。术语“互补DNA” (cDNA)指的是可以从mRNA模板通过酶逆转录形成的单链DNA分子。通常，将与部分mRNA互补的引物用于启动逆转录。本领域技术人员还使用术语“cDNA”来表示源自mRNA分子的双链DNA分子。术语“重叠群(contig)”指的是重叠核酸序列来形成一个连续的核苷酸序列的装配。例如，将几个DNA序列比较并比对来鉴定普通的或重叠的片段。然后将单独的序列装配成单个连续的核苷酸序列。
术语“表达”指的是源自本发明核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达还可以指mRNA翻译成多肽。“反义抑制”指的是反义RNA转录产物的产生能够抑制目标蛋白质的表达。“过表达”指的是转基因生物体中的基因产物的产生超过正常或非转化生物体中的产生水平。“共抑制”指的是正义RNA转录产物的产生能够抑制相同或实质上相似的外源或内源基因的表达(U. S.专利No. 5，231，020，在此引入作为参考)。可以将使用锌指(ZF)识别基序的DNA-结合蛋白设计来识别和修饰特定的DNA序列或改变表达。当可操作地连接核酸酶时(ZFNs)，可以将这样工程化的锌指(ZFs)用于直接改变天然环境中的基因。通过ZF结合介导的位点择优或位点特异性核酸酶剪切可以有效表改变达或活性。目标基因的改变可以包括用设计的DNA通过同源重组的替代和插入或删除引起的基因破坏。可在Biol. Chem. 1999七月-八月；380 (7-8) :841-848 ;Molecularand Cellular Biology 21 (I) :289-297,2001 ；Genetics 161 :1169_1175，2002 中找到ZFN-介导的基因组改变的实例。相反，当设计作为与反式基因相互作用的转录因子时，ZF可以间接调节表达和活性。可以将这样的ZFPs工程化来提高或降低转录(refs)。ZFP表达的调节可以是组成型、组织特异性、瞬间特异性或诱导型的。可在Proc. Nat. Acad. Sc1. 99
(20):13290-13295,2002 ；Proc.Nat. Acad. Sc1. 99 (20) : 13296-13301，2002 ；Plant CellPhysiol. 43 (12) : 1465-1472，2002 ；Curr. Opin. Plant Biol. 6 :163-168,2003 中的综述中找到ZFP介导的表达改变的实例。术语“基因”指的是表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列之前(5’ -非编码序列)和之后(3’ -非编码序列)的调节序列。“天然基因”指的是天然发现的基因，具有其自身的调节序列。“嵌合基因”指的是不是天然基因的任何基因，包括不是天然一起发现的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可以包括源自不同来源的调节序列和编码序列，或调节序列和编码序列源自相同来源，但以不同于天然发现的方式排列。“内源基因”指的是位于生物体基因组中天然位置的天然基因。可以将内源基因另外的一个拷贝或多个拷贝重新引入宿主生物体中不同的染色体位置，导致前后和表达水平的差异。“外源”基因指不是在宿主生物体中正常发现的但通过基因转移引入了宿主生物体中的基因。外源基因可以包括插入非天然生物体中的天然基 因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经引入基因组中的基因。术语“基因组DNA”指的是染色体DNA并可以包括内含子。内含子是插入序列。它是基因内的非编码DNA序列，转录成核内不均RNA (hnRNA)，但然后通过核中的RNA剪接除去，留下成熟的mRNA，然后在细胞质中将其翻译。内含子末端的片段通常是自我互补的，允许在hnRNA中天然形成发夹结构。术语“肌醇多磷酸2-激酶多核苷酸”或“IPP2-K多核苷酸”指的是编码具有至少肌醇多磷酸2-激酶活性的多肽的多核苷酸，或能够调节宿主细胞中IPP2-KmRNA或蛋白质表达的多核苷酸。术语还包括具有上述任一种活性的片段、变体、同系物、等位基因或前体(例如，前蛋白(preprotein)或原蛋白(proprotein)。术语“ IPP2-K”指的是对于任何核酸或多肽的肌醇多磷酸2-激酶，或相关的功能活性。本发明的IPP2-K酶具有宽泛的底物特异性并可以使几种肌醇磷酸盐物质磷酸化，包括但不限于，肌醇三磷酸盐、肌醇四kis磷酸盐和肌醇五kis磷酸盐，使用腺苷三磷酸盐(ATP)作为磷酸盐供体，形成产物腺苷二磷酸盐(ADP)和磷酸化的肌醇磷酸盐。
术语“分离的”指的是物质，如核酸或蛋白质，其是(I)基本上或实质上无发现物质的天然产生环境中通常伴随或相互作用的成分或(2)如果物质是在其天然环境中，已经通过故意的人干预将物质改变成组合物和/或置于物质在细胞中天然位置以外的位置。术语“损害”指的是核酸相对于野生型植物核酸的任何分子改变。例如，损害可以是核酸序列中的删除、倒置、插入、重复、颠换、转变或重排。术语“基序”指的是构成较长序列一部分的核酸或氨基酸保守序列的短片段。术语“非-反刍动物”意思是具有分成食道、贲门、基底和幽门部分的单胃的动物。非反刍动物另外表示没有功能性瘤胃的动物物种。瘤胃是消化系统的一部分，在通过消化道之前饲料/食物在其中浸湿并接受微生物的消化。在非反刍动物中不产生这种现象。术语非反刍动物包括但不限于人、猪、家禽、猫和狗。术语“植酸”指的是myo-肌醇四磷酸、myo-肌醇五磷酸、myo-肌醇六磷酸及其衍生物如5_焦磷酸-肌醇(1，3，4，6)-四kis磷酸盐、5-焦磷酸-肌醇(1，2，3，4，6)-五kis磷酸盐和5，6-双-焦磷酸-肌醇(1，2，3，4)-四kis磷酸盐。作为有阳离子的盐，植酸为“肌醇六磷酸盐”。术语“植物”包括植物和植物部分，包括但不限于，植物细胞和植物组织，如叶、茎、根、花、花粉和种子。可以用于本发明中的植物种类通常宽至顺从诱变的高等和低等植物的种类，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。术语“多核苷酸”指的是任何核酸并包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单-或多-链聚合物。核酸还可以包括片段和修饰的核苷酸。因此，如在此所用的，术语“核酸”和“多核苷酸”可交替使用。术语“启动子”通常指指导结构基因转录来产生RNA的DNA序列。通常，启动子位于基因上游500个碱基对片段中，接近转录起始位点。如果启动子是诱导型启动子，那么转录的速率响应外源或内源诱导剂而提高或降低。相反，如果启动子是组成型启动子，通过诱导剂将转录速率调节至较低的程度。术语“转录调节片段”和“调节片段”指的是调节基因转录的DNA部分。调节片段可以包括各种顺式-作用元件，包括但不限于，启动子、增强子和激素应答部件。此外，因为已知内含子和5’ UTR影响转录，转录调节片段可以包括这样的序列。术语“基本上相似”指的是其中一个和多个核苷酸碱基的改变导致一个或多个氨基酸取代但没有影响DNA序列编码的蛋白质的功能特性的核酸片段。“基本上相似”还指其中一个或多个核苷酸碱基通过反义或共抑制技术的改变没有影响核酸片段介导的基因表达改变的核酸片段。“基本上相似”还指关于介导通过反义或共抑制技术的基因表达改变或所得到蛋白分子的功能特性改变的能力，本发明核酸片段的改变如一个或多个核苷酸的删除或插入基本上没有影响所得到的转录产物的功能特性。因此，理解本发明包括多于特定示范性的序列。例如，本领域 共知可以使用表示少于基因完整编码片段的核酸片段，或通过与待抑制的基因不具有100%序列同一性的核酸片段来实现基因表达的反义抑制和共抑制。此夕卜，导致在给定位点产生化学上等价的氨基酸但没有影响所编码蛋白功能特性的基因改变是本领域公知的。因此，用于氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可以由编码另一种疏水性较低的残基如甘氨酸或疏水性较高的残基如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子来取代。相似地，也可以预期导致一个负电荷残基替代另一个如天冬氨酸替代谷氨酸，或一个正电荷残基替代另一个如赖氨酸替代精氨酸的改变来产生功能上等价的产物。此外，导致蛋白质分子N-端和C-端部分改变的核苷酸改变也不期待来改变蛋白质的活性。所提出的每个改变都在本领域常规技术范围内，所编码产物生物活性保持的测定也是如此。此外，还可以通过在严谨条件下(O.1 X SSC, O. 1%SDS，65°C)与在此公开的核酸片段的杂交能力来表征基本上相似的核酸片段。还可以通过它们编码的氨基酸序列与在此公开的氨基酸序列的百分比相似性来表征本发明基本上相似的核酸片段，如通过本领域技术人员常用的算法来测定。优选的是其核苷酸序列编码与在此报道的氨基酸序列80%相似的氨基酸序列的那些核酸片段。更优选的是编码与在此报道的氨基酸序列90%相似的氨基酸序列的核酸片段。最优选的是编码与在此报道的氨基酸序列95%相似的氨基酸序列的核酸片段。使用GCG程序包(GeneticsComputer Group, Madison, WI)进行序列比对和百分比相似性计算。使用具有默认参数(GAP PENALTY=10，GAP LENGTH Penalty=IO)的 Clustal 比对算法(Higgins，D. G.和 Sharp，P.M. (1989)CABI0S. 5:151-153)进行序列的多重比对(此后，称为Clustal算法)。使用Clustal 方法的成对比对的默认参数是 KTUPLE 1，GAP PENALTY=3, WIND0ff=5 和 DIAGONALSSAVED=50氨基酸或核苷酸序列的“实质性部分”指的是通过本领域技术人员的序列人工评价或使用算法如 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool ；Altschul,S. F.等，(1993)J. Mol. Biol. 215 :403-410 ;请参阅 www. ncb1. nlm. nih. gov/BLAST/)通过计算机自动化序列比较和鉴定足以提供多肽或基因推定鉴定的多肽氨基酸序列或基因的核苷酸序列。通常，推定鉴定作为与已知蛋白或基因同源的多肽或核酸序列需要十个或更多个连续氨基酸或三十或更多个核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，在基因鉴定(例如，SOUTHERN分析)和分离(例如，细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)的序列依赖性方法中使用包括20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针。此外，为了获得包括引物的特定核酸片段，可以将12-15个碱基的短寡核苷酸用作PCR中的扩增引物。因此，核苷酸序列的“实质性部分”包括足以提供包括序列的核酸片段的特定鉴定和/或分离的序列。本说明书教导了部分或全部氨基酸和编码一个或多个特定植物蛋白的核苷酸序列。本领域技术人员，具有在此报道的序列的益处，现在可以使用公开序列的全部或实质性部分，用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括附属序列表中报道的完整序列，以及上述那些序列的实质性部分。术语“变体”指的是基本上相似的序列。通常，本发明的核酸序列变体具有与天然核苷酸序列至少 46%、48%、50%、52%、53%、55%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性，其中 ％序列同一性基于完整序列并通过使用默认参数的GAP 10分析来测定。通常，本发明的多肽序列具有与天然蛋白至少约 60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%序列同一性，其中 ％序列同一性基于完整序列并通过使用默认参数的GAP 10分析来测定。GAP使用Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48 =443-453,1970)的算法来发现两个完整序列的比对，其最大化相配的数量和最小化缺口的数量。术语“变体”还指含有与本发明内包含的和任意地本发明生物功能需要的基序高度相似的氨基酸序列的基本上相似的序列。通常，本发明的多肽序列变体具有与限定基序中保守氨基酸残基至少85%、90%或95%序列同一性。在此使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的且更全面地公开于Sambrook, J.&Russell, D. ff. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册);Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor,NY 2001 (此后称为 “Sambrook”)。本发明中包括的变体可以含有核酸或多肽序列的单个取代、删除或添加，其改变、添加或删除所编码序列中的单个氨基酸或小比例的氨基酸。“保守修饰变体”是导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸的改变。当合成上制备或改变核酸时，可以利用确定宿主的已知密码子偏好。
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本发明的核酸片段可以用于分离编码相同或其他植物物种的同源蛋白的cDNA和基因。使用序列依赖性方案的同源基因的分离是本领域公知的。序列依赖性方案的实例包括但不限于，核酸杂交方法以及DNA和RNA扩增方法，如通过使用各种核酸扩增技术(例如，聚合酶链式反应、连接酶链式反应)扩增的。例如，可以直接分离编码其他肌醇三磷酸激酶、肌醇四kis磷酸激酶、肌醇五kis磷酸激酶或肌醇多磷酸2-激酶的基因，作为cDNAs或基因组DNAs，使用全部或部分本发明的核酸片段作为DNA杂交探针使用本领域技术人员公知的方法，从任何所需的植物来筛选文库。可以通过本领域已知的方法来设计和合成基于本发明核酸序列的特异性寡核苷酸探针(Sambrook)ο此外，完整序列可以用于直接合成DNA探针，通过本领域技术人员已知的方法如随机引物DNA标记、缺口平移或末端标记技术，或用于直接合成RNA探针，使用体外可用的转录系统。此外，可以设计特异性引物并用于扩增本发明序列的部分或全部。可以在扩增反应过程中直接标记或扩增反应后标记所得到的扩增产物，并用作探针在合适严谨度的条件下分离全长cDNA或基因组片段。此外，可以将本发明核酸片段的两个短片段用于聚合酶链式反应方案中，来扩增编码DNA或RNA同源基因的较长核酸片段。还可以在克隆的核酸片段的文库上进行聚合酶链式反应，其中一个引物的序列源自本发明的核酸片段，而另一个引物的序列利用编码植物基因的mRNA前体3’端的多腺苷酸区域存在。或者，第二个引物序列可以基于源自编码载体的序列。例如，本领域技术人员可以按照RACE方案(Frohman等，(1988)PNAS USA 85:8998)来产生cDNA，使用PCR来扩增转录产物中单个点和3’或5’端之间片段的拷贝。可以从本发明的序列设计3’和5’方向定向的引物。使用可购得的3’ RACE或5’ RACE系统(Invitrogen, Carlsbad CA),可以分离特定的 3’ 或 5’ cDNA 片段(Ohara 等，(1989) PNASUSA 86 :5673 ;Loh 等，(1989)Science 243:217)。可以将通过 3’和 5’RACE 程序产生的产物结合来产生全长 cDNA (Frohman, Μ. A.和 Martin, G. R. (1989) Techniques 1:165)。本发明的核苷酸以及推导的氨基酸序列的有效性促进了 cDNA表达文库的免疫筛选。可以合成表示本发明氨基酸序列一部分的合成肽。可以将这些肽用于免疫动物来产生具有包括氨基酸序列的肽或蛋白质特异性的多克隆或单克隆抗体。然后可以将这些抗体用于筛选cDNA表达文库来分离目标全长cDNA克隆(Lerner, R. A. (1984) Adv.1mmunol. 36 I;Sambrook)ο
本发明的核酸片段可以用来建立转基因植物，其中所公开的肌醇多磷酸2-激酶以低于正常的水平存在。对于一些应用，降低或消除植物中编码肌醇多磷酸2-激酶基因的表达是有利的。为了实现这，可以通过将编码肌醇多磷酸2-激酶的基因或基因片段连接植物启动子序列来构建为共抑制本发明植酸生物合成酶而设计的嵌合基因。或者，通过将基因或基因片段以反方向可操作地连接植物启动子序列来构建为表达本发明核酸片段全部或部分的反义RNA而设计的嵌合基因。可以通过转化将共抑制或反义嵌合基因引入植物中，其中降低或消除相应内源基因的表达。获得基因敲除的一种可替换方法涉及使用RNA干扰(RNAi)和转录后基因沉默(PTGS) [Fraser 等(2000)，Nature,408,325-330 ；Gonczy 等，(2000), Nature,408(331-336)]。将双链RNA (dsRNA)引入这些生物体的细胞中导致同源基因转录本的序列特异性降解。通过内源核糖核酸酶Dicer的作用将长的双链RNA分子减小至小的21-23个核苷酸的干扰 RNA (siRNA)。(Bernstein 等，(2001), Nature, 409, 363-366 ;Grishok 等，(2000)，Science,287 (5462)，2497-7 ;Zamore 等，(2000)，Cell,101 (I)，25-33 ;Knight，S. ff.和 B.L.Bass. (2001), Science, 293 (5538)，2269-2271)。可以在异种宿主细胞中特别是在微生物宿主的细胞中产生本发明的肌醇多磷酸2-激酶(或其部分)，并可以通过本领域技术人员公知的方法用于制备这些蛋白的抗体。抗体可用于在细胞内原位或细胞提取物体外检测肌醇多磷酸2-激酶。用于生产本发明肌醇多磷酸2-激酶的优选异种宿主细胞是微生物宿主。含有指导外源蛋白高水平表达的调节序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员公知的。这些中的任何一个可以用来构建用于产生本发明肌醇多磷酸2-激酶的嵌合基因。然后通过转化将该嵌合基因引入合适的微生物中来提供所编码的植酸生物合成酶的高水平表达。可以使用(a)标 准重组方法，(b)合成技术，或其组合来制得本发明的分离核酸。一些实施方案中，可以从单子叶植物或双子叶植物克隆、扩增或另外构建本发明的多核苷酸。单子叶植物的典型实例是玉米、高粱、大麦、小麦、黍米、大米或草坪草。典型的双子叶植物包括大豆、红花、向日葵、卡诺拉、苜蓿、马铃薯或木薯。可以使用在严谨条件下选择性杂交的引物来获得本发明中包括的功能性片段。引物通常为至少12个碱基长并可以高如200个碱基，但通常为15至75，或更可能为15至50个碱基。可以使用各种技术如限制性分析、Southern分析、引物延伸分析、PCR或DNA序列分析来鉴定功能性片段。本发明包括编码相同氨基酸序列的多个多核苷酸。遗传密码的简并性允许这样的“沉默改变”，其可以用于例如选择性杂交和检测本发明多核苷酸的等位基因变体。此外，本发明包括含有等位基因变体的分离核酸。在此所用的术语“等位基因”指的是相同基因的相关核酸。例如，可以通过寡核苷酸定点诱变、连接物扫描诱变、使用聚合酶链式反应的诱变等来获得本发明中包括的核酸的变体。参见，例如，Current Protocols in MolecularBiology (分子生物学中的通用方案)，Brent等编辑,Wiley和Sons, New York (2003)(此后称为 fcent)。此外，通常参阅，McPherson (编辑)，DIRECTED MUTAGENESIS:A PracticalApproach (定点诱变一种实践方法)，(IRL Press, 1991)0因此，本发明还包括DNA分子，该分子含有具有与本发明序列实质性序列相似性的核苷酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰变体指的是编码相同氨基酸序列或其保守修饰变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，很多功能上相同的核酸编码任一个给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和G⑶全部编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定的丙氨酸的每个位置，可以将密码子改变成所述相应密码子中的任何一个而没有改变所编码的多肽。这样的核酸变化是“沉默变化”并表示保守修饰变化中的一种形式。通过参照遗传密码，在此编码多肽的每个核酸序列还描述了每个可能的核酸沉默变化。本领域技术人员将认识到可以改变核酸中的每个密码子(除了 AUG，这是通常甲硫氨酸仅有的密码子；和UGG，这是通常色氨酸仅有的密码子)来产生功能上相同的分子。因此，每个所述的多肽序列中暗示着编码本发明多肽的核酸的每个沉默变化并在所要求的本发明的范围内。同样对于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到改变、添加或删除所编码序列中单个氨基酸序列或小比例氨基酸序列的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个取代、删除或添加是“保守修饰变体”，其中改变导致由化学上相似的氨基上替代氨基酸。因此，可以改变选自I至50整数的任何数量的氨基酸残基。因此，例如，可以形成1、2、3、14、25、37、45或50个改变。保守修饰变体通常提供和产生其的未修饰多肽序列相似的生物活性。例如，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常是天然蛋白对其天然底物的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。提供功能上相似氨基酸的保守取代表是本领域公知的。例如，以下六组各自 包含对于另一个是保守置换的氨基酸I)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。请参阅，(Creighton(1984)Protein ff. H. Freeman and Company),也可以使用本领域已知的其他可接受的保守置换模式，如序列比较程序的得分矩阵，如GCG程序包、BLAST或 CLUSTAL。所要求的本发明还包括通过本发明的多核苷酸序列改组产生的“shufflent”，来获得所需的特征。序列改组描述于PCT申请No. 96/19256中。请参阅，Zhang，J. H.等，Proc.Natl. Acad. Sc1. USA 94:4504-4509 (1997)。本发明还包括5’和/或3’ UTR片段用于调节异种编码序列的转录或翻译的通途。正向序列基序包括翻译启动保守序列(Kozak, Nucleic Acids Res. 15 :8125 (1987))和7-甲基鸟苷帽子结构(Drummnd等,NucleicAcids Res. 13 :7375 (1985)。反向兀件包括稳定的分子内5’UTR茎-环结构(Muesing等，Cell 48 :691 (1987))和AUG序列或5’UTR中前面为合适AUG的短开放阅读框(Kozak，上文，Rao等，Mol. Cell. Biol. 8 :284 (1988))。此外，可以修饰本发明多核苷酸的多肽编码片段来改变密码子使用。改变的密码子使用可以用来改变翻译率。可以使用可购得的软件包如从GCG, University ofWisconsin Genetics Computer Group可获得的“Codon Preference”来统计学分析本发明多核苷酸编码片段中的密码子使用(参见Devereaux等，Nucleic Acids Res. 12 :387-395(1984)。例如，可以将本发明的核酸或其反义对应部分最佳化，用于提高在目标植物中的表达。参见，例如，Perlak 等(1991) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 88 :3324-3328 ;和 Murray等(1989)Nucleic Acid Res. 17 :477_498，其公开内容在此引入作为参考。如此，可以使用植物优选的密码子来合成多核苷酸。本发明提供了包括分离核酸的子序列，该分离核酸含有所要求序列的至少20个邻接碱基。例如，分离的核酸包括含有所要求序列至少25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1，000、1，500 或 2，000 个邻接核苷酸的那些。通过引
入结合、插入、分裂和/或交联核酸的子序列化合物，分离核酸的子序列可以用于调节或检测基因表达。本发明所要求的核酸可以方便地包括多克隆位点，包括插入核酸中来帮助多核苷酸分离的一个或多个核酸内切酶的限制·位点。此外，可以将可翻译的序列插入来帮助本发明翻译的多核苷酸的分离。例如，六-组氨酸标记序列或GST融合序列，提供了方便的纯化本发明所要求蛋白质的方法。可以将本发明要求的多核苷酸连接用于本发明多核苷酸克隆和/或表达的载体、适配子、启动子、转运肽或连接物。可以将另外的序列加入这样的克隆和/或表达序列中来最佳化它们在克隆和/或表达中的功能、帮助多核苷酸的分离或提高多核苷酸进入细胞中的效率。克隆载体、表达载体、适配子和连接物的使用是本领域公知的并在本领域得到广泛描述。对于这样的核酸的描述，参见例如，Stratagene Cloning Systems, 2004目录(LaJolla, Calif.);和 Amersham BioSciences, Inc, 2004 目录(Piscataway, N. J.)。可以使用本领域技术人员已知的许多克隆方法从植物生物来源获得本发明的分离核酸组合物，如RNA、cDNA、基因组DNA或其混合物。一些实施方案中，使用在严谨条件下与本发明的多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针来鉴定cDNA文库或基因组DNA文库中所需的序列。不范性总RNA 和 mRNA 分离方案描述于 Plant Molecular Biology :A LaboratoryManual (植物分子生物学实验室手册)，Clark编辑，Springer-Verlag, Berlin (1997)和Brento 从销售商如 Stratagene (La Jolla, Calif. )、Clonetech (Palo Alto, Calif.)、Amersham BioSciences (Piscataway,N. J.)和 5，-3’ (Paoli’Pa.)可购得总 RNA 和 mRNA分离试剂盒。请参阅，U. S.专利No. 5，614，391 ;和5，459，253。典型的cDNA合成方案是本领域技术人员公知的并描述于这样的标准参考文献中如Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual (植物分子生物学实验室手册)，Clark 编辑，Springer-Verlag,Berlin (1997)和 Brent。从多个商业销售商如 Stratagene和Pharmacia可购得cDNA合成试剂盒。Carninci 等，Genomics 37 :327-336 (1996)描述了构建高于 95% 纯的全长 cDNA文库的示范性方法。用于产生全长文库的其他方法是本领域已知的。参见，例如，Edery等，Mol. Cell Biol. 15 (6):3363-3371 (1995)和 PCT 申请 W096/34981。通常方便地将cDNA文库标准化来建立其中每个克隆得到更相等表示的文库。很多标准化cDNA文库的方法是本领域已知的。标准化文库的构建描述于Ko，Nucl. Acids.Res. 18 (19):5705-5711 (1990) ；Patanjali 等，Proc. Natl. Acad. U. S. A. 88:1943-1947(1991) ；U. S.专利 No. 5, 482, 685 和 5, 637, 685 和 Soares 等，Proc. Natl. Acad. USA 91 9228-9232 (1994)。消减cDNA文库是另一种提高较低丰度⑶NA物质比例的方法。参见，Foote等，Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual(植物分子生物学实验室手册)，Clark编辑，Springer-Verlag, Berlin (1997)中；Kho 和 Zarbl, Technique 3 (2):58-63 (1991);Sive 和 St.John, Nucl. Acids Res. 16 (22) 10937 (1988) ；Brent ;和 Swaroop 等,Nucl.Acids Res. 19 (8):1954 (1991)。cDNA 消减试剂盒是可购得的。参见，例如，PCR-Select(Clontech)0为了构建基因组文库，通过随机片段化产生大片段的基因组DNA。可在Sambrook和 Methods in Enzymology (酶学中的方法)，Vol. 152 :Guide to Molecular CloningTechniques(分子克隆技术指导)，Berger 和 Kimmel 编辑，San Diego Acadmic Press, Inc.
(1987), Brent ；Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual (植物分子生物学实验室手册)，Clark编辑，Springer-Verlag, Berlin (1997)中找到合适的分子生物技术和说明的实例。用于构建基因组文库的试剂盒也是可购得的。cDNA或基因组文库可以使用本领域技术人员已知的方法使用PCR来直接筛选，或使用基于本发明的核酸序列如在此公开那些的探针来筛选。探针可以用于与基因组DNA或cDNA序列杂交来分离相同或不同植物物种中的同源多核苷酸。本领域技术人员将认识到可以在测试中使用各种程度的杂交严谨性；杂交或洗涤介质可以是严谨的。可以通过温度、离子强度、PH和部分变性溶剂如甲酰胺的存在来控制严谨性的程度。通常，严谨杂交条件是那些其中在pH7. O至8. 3盐浓度低于约1. 5M Na离子，通常约O. 01至1. OMNa离子浓度(或其他盐)，对于短探针(例如，10至50个核苷酸)的温度是至少约30°C，对于长探针(例如，高于50个核苷酸)的温度是至少约60°C，还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来获得严谨条件。
示范性的低严谨条件包括在37°C使用30至35%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基硫酸钠)缓冲溶液的杂交和在50°C IX至2XSSC(20XSSC=3. OMNaCl/O. 3M柠檬酸三钠)中的洗涤。示范性的中等的严谨条件包括在37 V使用40至45%甲酰胺、IMNaCl、1%SDS的溶液杂交和在55°C O. 5X至IXSSC中洗涤。示范性的高严谨条件包括在37°C在50%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS中的杂交和在60°C O.1 X SSC中的洗涤。通常杂交时间为4至16小时。可在 Tssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic acid Probes(生物化学和分子生物学中的实验室技术一用核酸探针的杂交)，第I部分，第2章“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid probes assays”(杂交原理和核酸探针测试策略的综述)，Elsevier, N. Y. (1993)和Brent中发现核酸杂交的进一步的指导。通常,将cDNA文库标准化来提高相对稀少的cDNAs的表示。可以使用扩增技术从核酸样品如植物核酸样品扩增本发明的核酸。例如，聚合酶链式反应(PCR)技术可以用来从基因组DNA文库、cDNA文库或通常从内含子加工的任何阶段的核转录产物构建的文库来直接扩增本发明的多核苷酸序列和相关的多核苷酸。可以从各种植物组织如穗、秧苗、叶、茎、根、花粉或种子形成文库。PCR和其他体外扩增方法还可以用于例如克隆编码待表达蛋白质的核酸序列、形成用作探针的核酸，用于检测样品中所需mRNA的存在、用于核酸测序或用于其他目的。用于体外扩增方法的技术实例可在Berger, Sambrook和Brent以及Mullis等，U.S.专利No. 4，683，202( 1987);和 PCR Protocols A Guide to Methods andApplications(PCR 方案方法和应用指南)，Innis 等编辑，Academic Press Inc. San Diego, Calif.(1990)中找到。用于基因组PCR扩增的可购得试剂盒是本领域已知的。参见，例如，优势-GC-基因组PCR试剂盒(Clontech)。T4基因32蛋白(BoehringerMannheim)可以用来提高长PCR产物的产量。基于PCR的筛选方法也已经得到了描述。Wilfinger等描述了一种基于PCR的方法，其中在第一个步骤中鉴定出最长的cDNA，使得可以从研究中消除不完整的克隆。Bio Techniques, 22 (3):481-486 (1997)。或者，本发明的序列可以用于分离其他生物体中的相应序列，特别是其他植物，更特别的是其他单子叶植物。如此，如PCR、杂交等的方法可以用来鉴定这样与本发明序列具有实质性序列相似性的序列。参见，例如，Sambrook和Innis等(1990),PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (PCR 方案:方法和应用指南)(Academic Press,New York)。本发明包括基于与在此所示的完整本发明编码序列或其部分的序列同一性的分离的编码序列。还可以通过以下方法通过直接化学合成来制备本发明的分离核酸，如Narang等，Meth. Enzymol. 68 :90-99 (1979)的憐酸三酯法；Brown 等，Meth. Enzymol. 68 109-151(1979)的磷酸二酯法；Beaucage 等，Tetra. Lett. 22 :1859-1862 (1981)的二乙基磷酰胺法；Beaucage 和 Caruthers 所述的固相憐酸胺三酯法，Tetra. Lett. 22(20):1859-1862( 1981),例如，使用自动化合成仪，例如Needham-VanDevanter等所述的，NucleicAcids Res. 12 6159-6168 (1984);和U. S.专利No. 4，458，066的固相支持法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。可以通过与互补序列的杂交，或使用单链作为模板通过DNA聚合酶的聚合将这转化成双链DNA。本领域技术人员将认识到尽管化学合成的DNA限于约100个碱基的序列，但通过较短序列的连接可以获得较长的序列。本发明核酸片段的全部或实质性部分还可以用作探针，用于遗传上和物理上对其为部分的基因作图，和用作用于与那些基因相关的性状的标记。为了产生具有所需表型的系，这样的信息可用于植物育种中。例如，本发明的核酸片段可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可以用本发明的核酸片段来探测限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook)。然后将所得到的条带模式接受遗传分析，使用计算机程序如MapMaker(Lander等，(1987)Genomics1:174-181)来构建遗传图谱。此外,本发明的核酸片段可以用于探测含有一组表示限定遗传交叉的亲本和后代的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹。注意DNA多态性的分离并用于计算本发明的核酸序列在之前使用该群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein，D.等(1980) Am. J. Hum. Genet. 32 :314-331 )。R. Bernatzky, R.和 Tanksley, S. D. (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4 (I):37-41中描述了遗传作图中所用的植物基因衍生的探针的产生和使用。多种出版物描述了使用上述方法或其改进的特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2杂交群、回交群、随机配对群、近等基因系和其他系列的个体可以用于作图。这样的方法是本领域技术人员公知的。源自本发明核酸序列的核酸探针还可以用于物理作图(B卩，序列在物理图上的安置；参见 Hoheisel, J. D.等，在 NonmammaIian GenomicAnalysis APractical Guide (非哺乳动物基因组分析实践指导)，Academic Press 1996，pp. 319-346，且在此引为参考)。另一个实施方案中，源自本发明核酸序列的核酸探针可以用于直接荧光原位杂交(FISH)作图中(Trask，B. J. (1991) Trends Genet. 7 :149-154)。尽管 FISH 作图的通用方法偏爱使用大的克隆(几至几百KB ;参见Laan，Μ.等(1995) Genome Research 5:13-20)，灵敏度的提高可以允许使用较短的探针来进行FISH作图。可以使用本发明的核酸序列进行各种基于核酸扩增的遗传和物理作图方法。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian，H. H. (1989) J. Lab. Clin. Med. 114 (2) :95-96), PCR扩增片段的多态性(CAPS !Sheffield，V. C.等(1993) Genomics 16 :325_332)，等位基因特异性连接(Landegren, U 等(1988) Science 241 :1077-1080),核苷酸延伸反应(Sokolov,B. P. (1990) Nucleic Acid Res. 18 :3671)，照射杂交作图(Walter，Μ· Α·等(1997) NatureGenetics 7 :22-28)和快乐作图(Dear，P. H.和 Cook，P.R. (1989) Nucleic Acid Res. 17 6795-6807)。对于这些方法，将核酸片段的序列用于设计和产生扩增反应或引物延伸反应中所用的引物对。这样引物的设计是本领域技术人员公知的。使用基于PCR的遗传作图方法中，必需鉴定对应于本发明核酸序列的片段中作图交叉亲本之间的DNA序列差异。然而，这对于作图方法通常是不需要的。对于本发明的cDNA克隆可以鉴定功能突变表型的丢失，通过靶向基因破坏方案或通过鉴定携带所有可能基因突变的群体中所含这些基因的特定突变(Ballinger和Benzer, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86 :9402 ；Koes 等(1995) Proc. Natl. Acad. SciUSA 92 :8149 ;Bensen等，(1995) Plant Cell 7:75)。可以以几种方式来完成后一种方法。首先，将本发明核酸片段的短片段用于从植物群制得的DNA的聚合酶链式反应中，结合突变标记物序列引物，植物中已经引入了增变基因转座子或一些其他引起突变的DNA元件(参见Bensen，上文)。用这些引物的特定DNA片段的扩增显示出突变标记物元件插入编码肌醇多磷酸2-激酶的植物基因中或附近。或者，本发明的核酸片段可以用作从突变群产生的使用突变标记物序列引物，结合随机基因组位点引物，如用于限制酶位点锚定的合成适配子PCR扩增产物的杂交 探针，。第三，可以将突变作图于特定基因内，使用能够在错配处切断的单链核酸内切酶(Till等，(2004)，Nucleic Acids Res. 32 :2632-41 )，一种称为TILLING的方法。最后，使用本领域技术人员已知的PCR方法来鉴定删除，如US专利申请20050053975和如下本发明的实施例中所述的。使用每种方法，可以鉴定和获得含有编码肌醇多磷酸2-激酶内源基因突变的植物。然后可以将该突变植物用于测定或证实基因产物的天然功能。本发明的蛋白质包括具有公开序列的蛋白质以及由公开的多核苷酸编码的蛋白质。此外，本发明的蛋白质包括通过在天然蛋白质的一个或多个位点删除、添加或置换一个或多个氨基酸而源自天然蛋白质的蛋白质。这样的变体可以由例如遗传多态性或人工操纵获得。这样的操纵方法通常是本领域已知的。例如，可以通过克隆的编码目标天然蛋白的DNA序列中的突变来制得多肽的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域公知的。参见，例如，Walker和Gaastra 编辑，(1983)Techniques in Molecular Biology (分子生物学技术)(MacMillanPublishing Company,New York)；Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 82:488-492;Kunkel 等(1987) Methods Enzymo1. 154 :367-382 ；Sambrook ；U. S.专利 No. 4, 873, 192 ;和在此引用的参考文献；在此引入作为参考。本领域技术人员将容易理解关于没有影响本发明蛋白质生物活性的合适氨基酸置换的指导。保守置换，如将一个氨基酸与另一个具有相似特性的交换，是优选的。在构建目标蛋白变体中，通常进行编码变体的核苷酸序列的修饰，使得变体继续具有所需的活性。本发明的分离蛋白质包括含有由本发明任一核酸编码的至少25个邻接氨基酸的多肽，或其保守修饰变体的多肽。本发明的蛋白或其变体可以包括任何数量的来自本发明多肽的邻接氨基酸残基，其中数目选自25至本发明全长多肽残基数目的整数。任意地，这种邻接氨基酸的序列是至少25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350,400,450或500个氨基酸长。本发明包括催化上活性的多肽(B卩，酶)。催化上活性的多肽通常具有天然(非合成)内源多肽的至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的特异性活性。此外，对于每种活性，底物特异性可以任意地与天然(非合成的)内源多肽基本上相似。通常，对于任何给定的底物，Km将至少是天然(非合成)内源多肽的约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。测定和定量测量酶活性和底物特异性(Keat/Km)的方法是本领域技术人员公知的。参见,例如，Segel,Biochemical Calculation (生物化学计算),第2版,JohnWiley and Sons, New York (1976)。本发明包括对本发明蛋白质形成的修饰。特别地，所希望的是减少基因的活性。可以形成其他修饰来促进克隆、表达或将靶向分子引入融合蛋白质中。这样的修饰是本领域技术人员公知的并包括，例如，在氨基末端添加甲硫氨酸来提供启动位点，或将另外的氨基酸或肽(例如，多His、GST等)置于任一个末端来形成方便定位的限制性位点或终止密码子或纯化。本发明的蛋白质，一旦得到表达，可以从细胞中分离出来，通过裂解细胞并对裂解物应用标准分离技术。通过使用Western印迹技术或放射性免疫测定或其他标准免疫测定技术来完成纯化过程的监控。还可以利用指导表达的蛋白质从细胞分泌至培养基中的表达盒。在这些情况中， 可以使用标准蛋白纯化技术从细胞生长培养基中纯化表达的蛋白。还可以使用非细胞合成方法来构建本发明的蛋白质。通过将序列的C-端氨基酸连接不溶的支持物接着顺次添加序列中剩余的氨基酸来完成低于约50个氨基酸长的蛋白质固相合成。用于固相合成的技术描述于Barany和Merrifield, Solid-Phase PeptideSynthesis (固相妝合成)，pp. 3-284,在 The Peptides Analysis, Synthesis,Biology (肽分析、合成、生物学)中，Vol. 2 :Special Methods in Peptide Synthesis (妝合成的特定方法)，A 部分；Merrifield 等，J. Am. Chem. Soc. 85 :2149-2156 (1963),和 Stewart 等，Solid-Phase Peptide Synthesis (固相妝合成)，第 2 版,Pierce Chem. Co. , Rockfrd, II1.(1984)。可以通过较短片段的氨基和羧基端的缩合来合成更长的蛋白质。通过羧基端的激活(例如，通过使用耦合剂N，N’ - 二环己基碳化二亚胺)形成肽键的方法是本领域技术人员已知的。可以通过本领域公知的标准技术将本发明的蛋白质(重组或合成)纯化至实质性的纯度，这些技术包括去污剂溶解、用如硫酸铵这样物质的选择性沉淀、柱色谱、免疫纯化方法等等。参见，例如，R. Scpoes,Protein Purification:Principles and Practice(蛋白质纯化原理和实践)，Springer-Verlag :New York (1982) ；Deutscher, Guide to ProteinPurification (蛋白质纯化的指导),Academic Press (1990)。例如,可以制备在此所述蛋白的抗体。按照U. S.专利No. 4，511，503中所述的方法可以获得从大肠杆菌(E. coli)的纯化。检测本发明蛋白的方法不是本发明的关键方面。可以使用许多公知的免疫结合测定来检测和/或定量蛋白质(参见，例如，U. S.专利No. 4，366，241 ;4，376，110 ;4，517，288 ；和4，837，168)。对于一般免疫测定的综述，请参阅Methods in Cell Biology (细胞生物学中的方法)，Vol. 37 :Antibodies in Cell Biology (细胞生物学中的抗体)，Asai编辑,Academic Press, Inc. New York (1993) ；Basic and Clinical Immunology (基石出和临床免疫学)，第7版，Stites&Terr编辑(1991)。此外，可以在几种构造中的任何一种进行本发明的免疫测定，例如Enzyme Immunoassay (酶免疫测定)中综述的那些，Maggio编辑，CRCPress,Boca Raton, Fla. (1980)；Tijan,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(酶免疫测定的实践和理论)，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology (生物化学和分子生物学中的实验室技术)，Elsevier Science Pulishers B. V.,Amsterdam (1985);Harlow 和 Lane,上文；Immunoassay: A Practical Guide (免疫测定实践指导)，Chan 编辑，Academic Press, Orlando, Fla. (1987) ；Principles and Practiceof Immunoassays (免疫测定的原理和实践)，Price 和 Newman 编辑，Stockton Press, NY(1991)和 Non-1sotopic Immunoassays (非同位素免疫测定)，Ngo 编辑，Plenum Press, NY
(1988)。 常用的方法包括Western印迹(免疫印迹)分析、分析生物化学方法如电泳、毛细管电泳、高性能液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱等，和各种免疫方法如流体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射性免疫测定(RIAs)、酶联免疫吸附测定(ELISAs)、免疫荧光测定等。通常通过间接方法来连接非放射性标记。通常，将配体分子(例如，生物素)共价连接分子。配体然后结合抗配体分子(例如，抗生蛋白链菌素)，该分子本身是可检测的或共价结合信号系统如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。可以使用多种配体和抗配体。在配体具有天然抗配体的情况中，例如，生物素、甲状腺素和氢化可的松，可以结合标记的天然产生的抗配体使用。或者，任何半抗原或抗原化合物可以结合抗体使用。还可以将分子直接缀合产生信号的化合物，例如，缀合酶或荧光团。作为标记的目标酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括虫萤光素和O. 2, 3- 二氢酞嗪二酮(O. 2, 3-dihydrophthalazinediones),例如，发光氮(luminol)。对于各种可以使用的标记或产生信号系统的综述，参见，U. S.专利No. 4，391，904，在此将其引入作为参考。一些测定形式不需要使用标记的化合物。例如，凝集试验可以用于检测目标抗体的存在。在这种情况中，通过含有目标抗体的样品使涂覆抗原的颗粒凝聚。在这种形式中，任何一种成分都不需要标记，通过简单目测来检测目标抗体的存在。本发明的蛋白可以用于鉴定结合(例如，底物)，和/或提高或降低(B卩，调节)本发明催化活性多肽的酶活性的化合物。该方法包括将本发明的多肽接触待测定其结合或调节酶活性能力的化合物。所用的多肽具有至少本发明天然全长多肽(例如，酶)特定活性的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。测量酶动力学的方法是本领域公知的。参见，例如，Segel, Biochemical Calculation (生物化学计算)，第 2 版，John Wiley and Sons,New York (1976)0可以制备本发明蛋白的抗体，蛋白包括单个的、等位基因的、菌株或物种变体或其片段，以天然产生(全长)形式或重组或合成形式。此外，可以制备这些蛋白天然构型或非天然构型的抗体。还可以产生抗独特型抗体。制造抗体的许多方法是本领域技术人员已知的。在一些情况中，所希望的是从各种哺乳动物宿主如小鼠、啮齿动物、灵长类、人等制备单克隆抗体。用于这样单克隆抗体的技术描述可在例如Basic andClinical Immunology (基础和临床免疫学)，第 4 版，Stites 等编辑，Lange MedicalPublications,Los Altos,Calif.，和其中引用的参考文献；Harlow 和 Lane,上文；Goding,MonoclonalAntibodies Principles andPractice (单克隆抗体原理和实践)，第 2 版，Academic Press, New York, N. Y. (1986);和 Kohler 和 Milstein, Nature 256 :495-497(1975)。其他合适的技术涉 及噬菌体或相似载体中重组抗体文库的选择(参见，例如，Huse 等，Science 246:1275-1281 (1989);和 Ward 等，Nature 341:544-546 (1989);和Vaughan 等，Nature Biotechnology 14:309-314 (1996))。或者，从含有未重排人重链和轻链Ig基因座片段的转基因小鼠(即，微小基因座转基因小鼠)获得高亲和力的人单克隆抗体。Fishwild等，Nature Biotech. 14 :845-851 (1996)。此外，可以产生重组免疫球蛋白 ο 参见，Cabilly, U. S.专利 No. 4, 816, 567 和 Queen 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 86 10029-10033 (1989)。本发明的抗体可以用于分离本发明蛋白的亲和性色谱中、用于筛选特定表达产物如正常或异常蛋白的表达文库或用于制备用于检测或诊断与各自抗原存在相关的各种病理状况的抗独特型抗体。通常，可以通过结合(共价或非共价)提供可检测信号的物质来标记本发明的蛋白和抗体。多种标记和缀合技术是已知的且在科学和专利文献中有大量报道。合适的标记包括放射性核苷酸、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性颗粒等。本发明进一步提供了调节(S卩，降低)植物或其部分中本发明要求的多肽的浓度或组成的方法。可以通过提高或降低植物中的浓度和/或组成(即，本发明要求的多肽的比例)来实现调节。该方法包括用包括反义核苷酸序列的表达盒转化植物细胞，该反义核苷酸序列与以下的序列基本上互补(I)编码肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子的一条链的对应部分，其中编码肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子在低严谨条件下与SEQ IDNO:1杂交或(2)由编码肌醇多磷酸2-激酶的DNA分子编码的RNA序列的对应部分；和(b)可操作地连接反义核苷酸序列的调节序列，使得反义核苷酸序列在其转化进入的植物细胞中表达。一些实施方案中，通过改变(体内或体外)本发明非分离基因的启动子来下调基因表达可以降低植物中本发明多肽的含量和/或组成。一些实施方案中，通过置换、添加、插入或删除来降低所编码酶的活性可以改变本发明天然基因的编码片段。参见，例如，Kmiec，U. S.专利No. 5，565，350 ；Zarling等，PCT/US93/03868。下调蛋白的一种方法涉及使用提供蛋白降解目标的PEST序列。一些实施方案中，将含有启动子序列的分离核酸(例如，载体)转染至植物细胞中。随后，通过本领域技术人员已知的方法来选择包括可操作地连接本发明多核苷酸的启动子的植物细胞，这些方法如但不限于，Southern印迹、DNA测序或使用启动子以及特异性引物检测基因和从其产生的基因和扩增子的PCR分析。将通过上述实施方案改变或修饰的植物或植物部分在植物形成条件下种植足以降低植物中本发明多肽浓度和/或组成的时间。植物形成条件是本领域公知的。通常，相对于缺少上述表达盒的天然对照植物、植物部分或细胞，多肽含量提高或降低至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。本发明中的调节可以发生在植物生长至所需发育阶段的过程之中和/或之后。通过使用可操作地连接的本发明多肽的合适启动子来暂时控制调节核酸表达和/或特别在组织中，如上文更详细地讨论的例如反义方向。还可以通过外部给予有效量的诱导化合物来控制本发明多核苷酸表达的诱导。诱导型启动子和激活这些启动子表达的诱导化合物是本领域公知的。特定实施方案中，在单子叶植物或双子叶植物例如玉米、大豆、向日葵、红花、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、大米、大麦和黍米中调节本发明的多肽。转化方法对于本发明不是关键的；各种转化方法是目前可用的。因为较新的方法可用于转化可以直接应用的作物或其他宿主细胞。因此，已经产生了多种方法将DNA序列插入宿主细胞的基因组中来获得序列的转录和/或翻译来实现生物体中的表性改变。因此，可以使用提供有效转化/转染的任何方法。编码本发明所需多核苷酸的DNA序列，例如编码全长蛋白的cDNA或基因组序列，可以用于构建引入所需植物中的表达盒。可以根据本领域的已知技术将本发明的分离核酸引入植物中。通常，制备如上所述的且适用于转化植物细胞的表达盒。用于转化多种高等植物物种的技术是公知的并描述于技术、科学和专利文献中。参见，例如，Weising 等， Ann. Rev. Genet. 22 :421-477 (1988)。例如，可以将 DNA 构建体直接引入植物细胞中的基因组DNA中，使用如电穿孔、PEG穿孔、基因枪轰击、硅纤维传送或植物细胞原生质体或胚性愈伤组织的微注射的技术。参见，例如，Tomes等，Direct DNATransfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment(通过微注身寸轰击指导DNA转移至完整植物细胞中),pp. 197-213在Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Fundamental Methods (植物细胞、组织和器官培养，基础方法)中，编辑0. L. Gamborg和 G. C. Phillips, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1995。或者，可以将DNA构建体结合合适的T-DNA侧翼片段并引入常规的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacients)宿主载体中。当细菌感染细胞时，根癌农杆菌宿主的侵入性功能将指导构建体和邻接的标记插入植物细胞DNA中。参见，U.S.专利No. 5，591，616。使用聚乙二醇沉淀的DNA构建体引入描述于Paszkowski等，Embo J. 3 =2717-2722(1984)中 ο 电穿孔技术描述于 Fromm 等,Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 82 :5824 (1985)中。弹道转化技术(Ballistic transformation)描述于 Klein 等,Nature327 :70-73 (1987)。根癌农杆菌介导的转化技术充分描述于科学文献中。参见，例如Horsch等，Science 233 :496-498( 1984)，和 Fraley 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. 80 :4803( 1983)。例如，玉米的根癌农杆菌描述于U. S.专利No. 5，981，840中。大豆的根癌农杆菌描述于U. S.专利 No. 5，563，055 中。其他的转化方法包括(I)发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的转化(参见，例如，Lichtenstein 和 Fuller,在Genetic Rngineering (遗传工程)中，Vol. 6,P. ff. J. Rigby 编辑，London, Academic Press, 1987 和 Lichtenstein, C. P.和 Draper, J.，在DNA Cloning(DNA 克隆)中，Vol. 11，D. M. Glover 编辑，Oxford，IRI Press, 1985),申请 PCT/US87/02512 (W088/02405，1988年4月7日公开)描述了使用发根农杆菌菌株A4及其Ri质粒和根癌农杆菌载体PARC8或pARC16，(2)脂质体介导的DNA吸收(参见，例如，Freeman等，Plant Cell Physiol. 25 :1353 (1984))，和(3)涡旋法(参见，例如，Kindle，Proc. Natl.Acad. Sc1. USA 87:1228 (1990))。还可以通过指导DNA转移至花粉中来将DNA引入植物中，如Zhou等所述的，Methods in Enzymology 101:433 (1983) ；D. Hess,Intern Rev. Cytol. ,107 367 (1987);Luo等，Plant Mol. Biol. Reporter 6:165 (1988)。可以通过将DNA注射至植物的生殖器官中来获得编码多肽的多核苷酸表达，如Pena等所述的，Nature 325:274 (1987)。还可以将DNA直接注射至未成熟胚中并使干燥的胚复水，如Neuhaus等所述的，Theor. Appl.Genet. 75 30 (1987)和 Benbrook 等，在 Proceedings Bio Expo 1986 中，Butterworth,Stoneham, Mass. , pp.27-54 (1986)。
对于通过各种方法的转化，动物和低等真核生物(例如，酵母)宿主细胞是能胜任的或给予能力的。存在几种公知的将DNA引入动物细胞中的方法。这些包括磷酸钙沉淀、受体细胞与含有DNA的细菌原生质体的融合、用含有DNA的脂质体处理受体细胞、DEAE葡聚糖、电穿孔、基因枪(Biolistics)和将DNA直接微注射至细胞中。通过本领域公知的方法培养转染的细胞。Kuchler, R. J.，Biochemical Methods in Cell Culture and Virology(细胞培养和病毒学中的生物化学方法)，Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977)。可以培养通过上述任一种转化技术产生的转化植物细胞来再生具有转化基因型的完整植物。这样的再生技术通常依赖于组织培养生长培养基中特定植物激素的操纵，通常依赖于已经和本发明的多核苷酸一起引入的杀菌剂和/或除草剂标记。对于玉米的转化和再生，参见 Gordon-Kamm 等，The Plant Cell 2:603-618 (1990)。可以根据标准植物组织培养技术例如从单个细胞、愈伤组织或叶圆片再生用植物表达载体转化的植物细胞。本领域公知几乎任何植物的各种细胞、组织和器官可以成功地培养来再生完整的植物。从培养的原生质体的植物再生描述于Evans等，ProtoplastsIsolation and Culture,Handbook of Plant Cell Culture(原生质体分离和培养,植物细胞培养手册)，MacmiIIan Publishing Company,New York,pp. 124-176 (1983)和 Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts(植物再生，植物原生质体)，CRC Press,BocaRaton,pp.21-73 (1985)。可以实现含有通过农杆菌引入的外源基因的植物再生,如Horsch等，Science,227 :1229-1231 (1985)和 Fraley 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 80 :4803 (1983)。这种方法通常在两至四周内产生幼芽，然后将这些转化子幼芽转移至合适的诱导根的培养基中，培养基含有选择性试剂和防止细菌生长的抗生素。本发明的转基因植物可以是能繁殖的或不能繁殖的。还可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分实现再生。这样的再生技术概括地描述于Klee等,Ann. Rev. Plant Phys. 38 :467-486(1987)。从单个植物原生质体或各种外植体的植物再生是本领域公知的。参见,例如,Methods for Plant Molecular Biology(植物分子生物学方法)，A. Weissbach和H. Weissbach编辑,Academic Press, Inc. , San Diego,Calif. (1988)。对于玉米细胞培养和再生一般参见The Maize Handbook (玉米手册)，Freeling 和 Walbot 编辑，Springer, New York (1994)；Corn and Corn Improvement (玉米和玉米改良)，第 3 版，Sprague 和 Dudley 编辑，American Society of Agronomy, Madison,ffis. (1988)。本领域技术人员将认识到将表达盒稳定地引入转基因植物中并证实是可操作的之后，可以通过性交将其引入其他植物中。根据待杂交的物种，可以使用许多标准育种技术。在生长繁殖的作物中，可以通过插枝、通过单性生殖种子的产生或通过组织培养技术使成熟转基因植物繁殖来产生多个相同的植物。进行所需转基因的选择并获得新的品种并生长繁殖用于商业用途。在种子繁殖的作物中，可以将成熟转基因植物自交来产生纯合近亲繁殖植物。近亲繁殖植物产生含有新引入的异种核酸的种子。使这些种子生长来产生将产生选定表型的植物。本发明包括从再生植物获得的部分，如花、种子、叶、枝条、果实等，只要这些部分包括含有本发明分离核酸的细胞。再生植物 的后代和变体以及突变体也包括于本发明的范围内，只要这些部分包括引入的核酸序列。可以通过例如标准免疫印迹和DNA检测技术筛选表达选择标记的转基因植物来用于本发明核酸的传播。还通常评价转基因系的异种核酸的表达水平。最初测定RNA水平的表达来鉴定和定量表达阳性的植物。使用RNA分析的标准技术，包括使用设计的只扩增异种RNA模板的寡核苷酸引物的PCR扩增测试和使用异种核酸特异性探针的溶液杂交测试。然后通过Western免疫印迹分析使用本发明的特定反应性抗体来分析RNA-阳性植物的蛋白质表达。此外，根据标准方案进行原位杂交和免疫细胞化学，使用异种核酸特异性多核苷酸探针和抗体各自来定位转基因组织内的表达位点。通常，为了引入的核酸通常筛选许多转基因系来鉴定和选择具有最合适表达特征的植物。本发明的转基因植物对于添加的异种核酸可以是纯合的；即，转基因植物含有两个添加的核酸序列，一个基因位于染色体对的每条染色体上的相同基因座。通过将含有单个添加的异种核酸的异种转基因植物性交(自体受精)来获得纯合转基因植物，使一些所产生的种子萌芽并分析所产生植物的本发明多核苷酸相对于对照植物(即，天然的、非转基因的)改变的表达。还计划了与亲本植物的回交以及与非转基因植物的异交。或者，通过无融合生殖来完成异种转基因植物的繁殖。本发明提供了含有本发明多核苷酸植物的基因型测定方法。基因型测定提供了辨别染色体对同系物的方法并可以用于区分植物群体中的分离。分子标记方法可以用于系统产生研究、表征作物品种的遗传关系、鉴定杂交或体细胞杂种、定位影响单基因性状的染色体片段、基于图谱的克隆和定量遗传的研究。参见，例如，Plant MolecularBiology:A Laboratory Manual (植物分子生物学实验室手册)，第7章，Clark编辑，Springer-Verlag,Berlin( 1997)。对于分子标记方法，一般参见，Andrew H. Paterson 1996的 The DNARevolution (DNA 革命)(第 2 章)，在Genome Mapping in Plants (植物的基因组作图)(编辑，Andrew H. Paterson), Academic Press/R. G. Landis Company, Austin,Tex. , pp. 7_21 o本发明中的特定基因性测定方法可以使用多种分子标记分析技术，如但不限于，扩增片段长度多态性(AFLPs)。AFLP是由核苷酸序列可变性引起的DNAPCR扩增片段之间的等位基因差异的产物。因此，本发明进一步提供了一种方法来进行本发明的基因或核酸以及遗传上连接这些基因或核酸的染色体序列的分离，使用如AFLP分析这样的技术。可以用于本发明中的植物包括单子叶植物和双子叶植物。优选的植物包括玉米、小麦、大米、大麦、燕麦、高粱、黍米、黑麦、大豆、向日葵、红花、苜蓿、卡诺拉油菜、棉花或草坪草。
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从转化植物细胞、植物部分或植物组织再生的植物产生的种子，或源自再生转化植物的后代，可以直接用作饲料或食物，或可以进行进一步的加工。本发明通过参照以下详细的实施例将得到进一步的描述。然而，可以理解存在除实施例和描述中所示以外的对本发明基本主题的许多延伸、改变和修饰，这些在本发明的精神和范围内。实施例在以下实施例中进一步限定本发明，其中所有份数和百分比是以重量计的，且是摄氏温度，除非另外指出。应当理解这些实施例，尽管表示本发明的优选实施方案，但只是以说明的方式给出。从以上的讨论和这些实施例，本领域技术人员将认识到本发明的实质性特征，且没有脱离其精神和范围，可以形成本发明的改变和修饰来使其适于各种用法和条件。实施例1.候选IPP2-K基因的鉴定来自人和酵母的用于预测的肌醇五kis磷酸-激酶(In5_K)基因的DNA序列描述于 Verbsky, J. W.等(2002) J. Biol. Chem. 277 :31857-31862 (此后称为“Verbsky”)。在公众数据库包括GenBank (http://www. ncb1. nlm. nih. gov. /)中鉴定出相似的、推定的玉米IPP2-K基因序列的片段。将玉米序列片段与人和酵母序列比对，也根据BLAST算法用于 NCBI 数据库筛选(Altschul，S.F.等，(1991) J. Mol. Biol. 215 :403_10)。在公众结构域包括但不限于 BM520171、BE556094、BG882429 (大豆(Glycine max)) ;C73039、AA750614、AL606608. 3、AAAAO1003483, AP008210、AK102842、XM474214 (水稻(Oryza sativa))；BH647760、BH724856 (甘蓝(Brassica oleracea)) ；TC238218 (包括来自小麦(Triticumaestivum)ESTsCA732984、BQ579364、BE430881、CD876080、BE498028、CA714664、BE498127、BJ233635、BE496998、CA604588、BJ212905, BJ22038U BE445478、CA700172、CA613702 的TIGR 重叠群)、TC97085(包括来自高粱(Sorghum bicolor )CD233879、BG054179、BE594569、CD207152 的 TIGR 重叠群)、BN45053K04、BN25068E01、Brassica napustuc04-02_052912，TC1941 (包括来自油菜(Brassica napus) CD832483、CD827663、CD837809 和 CD832284 的TIGR 重叠群)中鉴定出来自拟南芥(Arabidopsis thaliana) (AT5g42810、ATlg22100、ATlg58936)和其他物种的几个序列。此外，在公众数据库和公开的专利申请(Shi，J.等，W02003027423)中鉴定出具有低水平序列相似性并预测在功能上不同的序列。基于相似性的程度可以将这些序列从与在此要求的IPP2-K相似的那些中区分出来。这些序列之间的相似性百分比和系统生成关系显示于图1A和IB中。此外，将载体NTI的多序列比对应用用来形成来自玉米、拟南芥和大米的推定IPP2-K基因的预测氨基酸序列的比对。基于氨基酸序列同一性，那些比对结果限定了称为共有序列的保守片段，作图于图2中。鉴定了五个共有序列来限定IPP2-K基因特征性的基序。使用这些基序来探寻数据库(例如，GeneBank)，本领域技术人员可以从各种植物物种中鉴定出其他的推定IPP2-K基因1. DAXDWXYXXEGXXNLXLXYXGS SP2. VEIKXKCGFLXXSXXIXXXNXXKXXXXRXXMXQXCKXXXXXISXXSEYXPLDLFSGSKXXXXXAIKXXXXTPQNXXXXXXGSLXXGG3.1SXXSEYXPLDLFSGSK4. LXXLLXXQKLDXXIEGXIHXYY5. LIXXTAXDCSXMISF实施例2 :全长cDNA序列的分离公众玉米序列数据库(www. maizegdb. org)的探询鉴定出表达的序列标记物(ESTs)BG842305、AW066374 和 BE639260，作为邻接序列(contig)ZMtuc02-12_23· 4536 的片段。该重叠群为1. 7kb长。该重叠群的翻译蛋白序列含有与人肌醇五kis磷酸激酶(In5-K)基因中鉴定的保守A、B、C和D盒高度相似的序列，如Verbsky所述的。可以使用RT-PCR方法来获得玉米IPP2-K cDNA克隆，如该实施例中所述的。在授粉后(DAP)9 天使用 TRIzol 试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 MACS 试剂盒(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)的组合从玉米(DAS 5XH751)种子中分离出多(A)+-尾mRNA ο 使用源自 ZMtuc02-12-03. 4536 (5，-TCG GAAATTACT GTG ACA AGC-3’)的基因特异性引物和Superscriptase II酶(Invitrogen)如制造商所建议的对该mRNA进行逆转录反应来产生 cDNA。通过使用源自 ZMtuc02-12-23. 4536 (5，-GAA TCG GCA CGA GGC AGCAGC GGC AGC-3，和5，-TGA CAA GCC ACG GTG TAT GCA-3’)的不同基因特异性引物来完成IPP2-KcDNA的扩增。使用TA克隆试剂盒按照制造商的推荐(Invitrogen)将扩增的cDNA克隆至载体质粒载体PCR2.1中。将该玉米IPP2-K cDNA克隆(1. 6kb长)命名为zmIP5K_l。为了获得对应于IPP2-K cDNA的5’ -和3’ -未翻译片段(UTR)的序列，使用来自Invitrogen的GeneRacerTM试剂盒进行cDNA末端快速扩增(RACE)实验。对于5’ -RACE,用小牛肠磷酸酶和烟草酸性焦磷酸酶如制造商所述的处理来自9DAP种子的mRNA。按照试剂盒的说明将试剂盒提供的RNA寡核苷酸(RNA锚)连接上述的mRNA。通过另一个IPP2-K基因特异性引物(5’-GCAATAGCAAAT TGA GAT ACA TTC ATA C-3’)来指导逆转录。随后使用源自RNA锚序列的引物和不同的基因特异性引物(5’ -TTC CAG GCG TTAAGG GTC GAGCCT-3’)来扩增推定的玉米IPP2-K激酶cDNA的5’ -端。将所得到的扩增产物克隆至质粒载体pCR2.1中并测序。为了获得3’ -UTR序列，用寡-cKT)引物和源自在3’ -端的RNA锚引物按照GeneRacer 试剂盒来指导来自9DAP种子的mRNA的逆转录。然后用源自zmIP5K-l(5’-CGTGTT TCT AGG GAT TTT CTG GAG C TT-3’)的基因特异性引物和3’-RNA锚序列侧翼寡_d(T)引物扩增推定的IPP2-K转录产物的3’-端。将PCR产物克隆至pCR2.1中并测序。随后，将源自5’-和:V -RACE实验的克隆序列数据用于设计对应于UTR (5’-CTT CAG TCCCTT TCC CCG GGC T-3’ 和 5’ -TTT TTTTTT TTT GGA GGA TGAAAG TTT CAC CAAACA TTTCT-3’)的ΙΡΡ2-Κ特异性PCR引物。使用那些引物，使用高保真度Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)进行来自9DAP种子的mRNA的RT-PCR扩增来产生推定的全长IPP2-KcDNA。然后将所得到的PCR产物克隆至pCR2.1中并将四个独立的克隆进行测序。将表示全长IPP2-K cDNA的克隆的核苷酸序列命名为(SEQ ID NO:1)并将该cDNA编码的蛋白质的预测氨基酸序列命名为(SEQ ID NO: 2)。实施例3 :基因组DNA序列的鉴定使用分离的推定玉米IPP2-K cDNA作为询问序列，根据BLAST搜寻玉米基因组数据库(WWW. maizegdb. org)并鉴定出其他未知功能的重叠、相似序列片段。将这些序列装配成重叠群 / 单线态(contig/singlet)，包括 ZMGSStuc28403. 1，ZMGSStuc03-04-29. 4761。使用标准方案(Sambrook)进行基因组Southern印迹。分析玉米(DAS 5XH751)未消化或用BamH1、EcoR1、Hind III和Not I酶单一消化的基因组DNA，。通过O. 8%琼脂糖中的电泳来分离gDNA片段，转移至尼龙膜上并在严谨条件下(O. 2XSSC，60°C)与25ng用32P-dCTP (Prime-1t II 标记试剂盒，Stratagene, La Jolla, CA)标记的1. 6kb 玉米 IPP2-KcDNA (zmIP5K-l)探针杂交。将对应于2或3个基因的条带鉴定为可能的IPP2-K候选者，表示基因作为小基因家族存在。
实施例4 从λ噬菌体文库分离ΙΡΡ2-Κ基因组克隆从已经在液氮中研磨成细粉的3周大的叶片组织分离玉米(DAS5XH751)的基因组DNA。如Sambrook中所述的使用基于十六烧基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium)的标准方法(CTAB)在包括 IOOmM Tris ρΗ7· 5、0· 7MNaCl、10mM EDTA、1%CTAB、1%β -巯基乙醇的缓冲液中提取gDNA。用BamH I限制酶消化所得到的DNA并按照制造商的推荐使用Klenow酶(Stratagene, La Jolla, CA)将末端接受填补反应。填补反应后,提取DNA,沉淀并根据制造商所述的方案连接用Xho I预消化的λ卩遼菌体载体(λ FixII, Stratagene),除了连接缓冲液和连接酶是由Promega提供的(Madison, WI )。使用来自Stratagene的Gigapack试剂盒,按照制造商的推荐将连接混合物加入Gigapack III XL包装提取物中并使用Sambrook所述的标准方法将包装的文库涂布于LB培养基上。所得到的玉米基因组文库具有3. 6 X IO6PFUs,经过常规扩增，文库最终的滴定度是3. 6X 101QPFU/ml。λ文库筛选方法源自Sambrook。以高密度涂布玉米DAS5XH751基因组文库并转移至尼龙膜。将膜在严谨条件下(I X SSC的2次洗涤，O. 2 X SSC的2次洗涤，65 °C )与探针杂交，探针由如上所述标记的1. 6kb IPP2-K cDNA克隆(zmIP5K-l)片段构成。分离阳性斑并接受2轮另外的筛选，得到几个推定的阳性λ克隆。克隆片段的DNA测序证实了这些序列的同一性和源自基因组ΙΡΡ2-Κ基因的一样。将这些序列和以下描述的BAC克隆一起用于产生命名为(SEQ ID Ν0:3)的邻接基因组序列。实施例5 :含有ΙΡΡ2-Κ基因的BAC克降的分离和表征根据Zhang (2002)所述的方法制备玉米(DAS近交5ΧΗ751)的基因组DNA的细菌人造染色体(BAC)文库。从2周大的秧苗组织收集叶片组织并冷冻于液氮中。将冷冻组织在液氮中研磨成细粉，转移至 IXHB (IOX 储液0.1M Trizma 碱、O. 8M KCl、0.1M EDTA、IOmM 亚精胺、IOmM 精胺，pH9. 4-9. 5)加O. 15%β -巯基乙醇和O. 5%曲通Χ-100，在冰上涡旋10分钟并通过两层粗棉布和一层Miracloth过滤。将匀浆沉淀并用冰冷洗涤缓冲液(O. OlM Trizma碱、O. 08MKC1、0.01M EDTA、ImM 亚精胺、ImM 精胺、2% 曲通 Χ_100、0· 015%β -巯基乙醇，ρΗ9. 4-9. 5)洗涤。将核沉淀物重悬浮于洗涤缓冲液中并通过1，800Xg,4°C 15分钟离心3次来再次沉淀。将沉淀的核重悬浮于ImllXHB中并计数。用IXHB将核浓度调节至5X IO7个核/ml。如Zhang (2002)所述的将完整的核包埋于琼脂糖填料中，在O. 5M EDTA, pH9. 0-9. 3, 50°C洗涤一小时，在O. 05M EDTA, ρΗ8· 0，冰上洗涤一小时，并存储于O. 05Μ EDTA, ρΗ8· 0，4°C中。通过在 10-20 体积的冰冷 TE (IOmM Tris-HCl，ρΗ8· O, ImM EDTApH8. O)力卩 O.1mM 苯甲基磺酰氟化物(PMSF)中洗涤核-填料三次一小时来进行填料中巨大碱基(megabase) DNA的进一步纯化。将DNA在10-20体积冰冷TE中另外洗涤三次一小时。如Zhang (2002)所述的在琼脂糖填料中直接用限制酶EcoRI消化包埋于核中的基因组DNA。消化后，用1/10体积的O. 5M EDTA, pH8. O停止反应。根据Zhang (2002)在连接BAC载体之前对消化的DNA进行脉冲场凝胶电泳接着琼脂糖填料中的大小选择。如Zhang (2002)中所述的，用限制酶EcoRI消化BAC载体pECBACl DNA。用CIAP酶(Invitrogen)将线性化的载体DNA去磷酸并用冷TE中的4 μ I O. 5Μ EDTA,pH8. O, 20 μ I10%SDS和40 μ I lmg/ml蛋白酶K来停止400 μ I的反应。通过加入1/10体积3Μ NaAC,ΡΗ7. O和2体积100%乙醇，在-80°C孵育10分钟，接着在10，OOOrpm离心15分钟来沉淀DNA。洗涤和重悬浮后，将DNA浓度调节至IOng/ μ I并将载体存储于_20°C。如下进行巨大碱基基因组DNA进入BAC载体pECBACl中的连接将从琼脂糖填料中洗脱出来的基因组DNA对一升冰冷O. 5 X TE在冰上透析2次I小时。在1%琼脂糖凝胶上估算收集的DNA的浓度。以载体DNA1:4的分子量比使用T4DNA连接酶根据Zhang(2002)所述的标准方法来进行连接反应。将连接反应在16°C孵育8-12小时。
使用具有增压器和O. 15cm间隙的Cell Porator比色皿的Cell Porator System(Labrepco, Horsham PA)通过电穿孔来进行连接混合进入感受态大肠杆菌细胞(DHB10B,Invitrogen)中的转化。电穿孔设置为330uF电容、4Kohm电阻。电穿孔后，将细胞在37°C在大约Iml SOC培养基中振荡恢复，离心沉淀并存储于冷冻培养基中(2. 5w/v颗粒状LB肉汤、13mM KH2PO4,36mM K2HP04、1. 7mM 柠檬酸钠、6. 8mM(NH4)2SO4,4. 4%w/v 甘油)直至涂布。将培养物以形成离散细菌菌落的密度涂布在加了 L 5%bactoagar、90 μ g/ml X_gal、90 μ g/mlIPTG和12. 5 μ g/ml氯霉素的LB培养基上。使用Q-bot自动仪(Genetix，Boston MA)挑选程序来挑选单个的菌落并排列至300个384-孔平板中。源自近交品种DAS 5XH751的这种玉米BAC文库的滴定测试表明文库含有大约115，000个克隆，具有平均130k b插入大小的基因组片段。使用Q-bot自动仪(Genetix, Boston MA)点程序将排列的玉米5XH751 BAC文库以4X4格子点在22cm2尼龙膜上。除了在杂交之前增加了另外的裂解步骤，按照Sambrook将滤纸(filter)在LB琼脂糖上37°C生长过夜，然后变性、固定和干燥。然后将滤纸器在严谨条件下(I XSSC 0. 1%SDS 2 次洗涤，0. 2 X SSC, 0. 1%SDS 2 次洗涤，65 °C)与 916bpIPP2-K片段(zmIP5K-l)构成的探针杂交，该探针是使用IPP2-K特异性引物(IP5K-PF3 5’ -AGTCCCTTTCCCCGGGCTGTGGTAC-3’ 和 IP5K-PR1 :5’ -TTAAGTTGTTCTGAGGAGTTGAGAAAAGGGA-3’)通过cDNA克隆(zmIP5K-l)的PCR产生的。使用Invitrogen的随机引物标记盒用Y 32-P dCTP将探针放射性标记。通过用存储的磷屏筛选,接着运行Incogen(WiIIiamburg,VA)高密度滤纸阅读软件的 Storm phsphorimager (Molecular Dynamics, Mountain ViewCA)分析,通过暴露16小时的磷显影(phosphorimaging)来进行阳性克隆的观察。从文库平板阵列回收阳性克隆培养物并在LB培养基中37°C生长过夜。按照制造商的说明使用Qiagen (Valencia CA)大构建试剂盒从分离的克隆中提取BAC DNA。将IPP2-K编码片段的特异性 PCR 引物(IP5-1PF :5’ -CGCGGATGCCAAGGACTGGGTTTACAAGGG-3’ 和 IP5-1PR :5’ -TTACAACAGCAGCACCAAGCAGCAGGAAC-3’ )用于扩增推定的阳性克隆并证实BAC上IPP2-K基因的存在。用NotI限制酶切含有IPP2-K基因的BAC，接受脉冲场凝胶电泳和分析。估算插入片段大小大约为180kb长，对应于含有IPP2-K基因的玉米染色体的基因组片段。进行含有IPP2-K的BAC克隆的测序，通过BAC DNA的直接测序或通过BAC的猎枪-亚克隆接着质粒测序和重叠群装配(Lark Technologies,Houston TX)。产生多个BAC序列运行并与上述的λ噬菌体克隆比对来产生命名为(SEQ ID N0:3)的邻接基因组序列。图3中显示了含有玉米DAS5XH751的IPP2-K基因的基因组基因座的结构。实施例6 :体外表征的IPP2-K活件按照制造商的推荐将对应于预测的1. 32kb开放阅读框(ORF)的玉米IPP2_KcDNA克隆的片段克隆至pGEX_2T质粒表达载体(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)中并在大肠杆菌细胞(BL21 (DE3)pLysS)中表达。设计该载体来产生GST (谷胱甘肽-S-转移酶)肽按读码框融合至表达蛋白N-端上。从标准提取裂解缓冲液(50mMTris-HCl pH7. 5,150mM NaCl, IOmM EDTA, ImM DTT,ImM PMSF, lmg/ml溶菌酶接着加入O. 4%曲通X-100)中的大肠杆菌细胞提取总蛋白。使用Branson Sonifier 450 (Branson Ultrasonic Corporation,Danbury CT)将所得至Ij的大肠杆菌裂解物在冰上超声波处理30秒的四个循环，每次20%输出设置和50%工作循环。将细菌表达的蛋白通过谷胱甘肽-琼脂糖柱，用缓冲液A (50mM Tris-HCl pH7. 5,150mM NaCl、IOmM EDTAUmM DTTUmMPMSF 和 0· 4% 曲通 Χ-100)洗涤 3Χ，用缓冲液 B (50mM Tris-HCl,ρΗ8. O)洗涤3次，并用50mM Tris-HCl中的IOmM谷胱甘肽洗脱。将通过Bio-RacKHerculesCA)蛋白测定试剂测定的O. 5ml含蛋白流分集合并通过SDS-PAGE分析(Sambrook)。使用Shevchenko, A等(1996) Anal. Chem. 68 :850-858所述的肽片段指印方法证实了异种表达的、纯化蛋白的鉴定是玉米IPP2-K。用常规薄层色谱分离32_P标记的肌醇磷酸盐后，通过放射自显影法证实了异种表达的玉米IPP2-K蛋白磷酸化多种肌醇磷酸盐物质的能力，包括肌醇四kis磷酸盐(IP4)和肌醇五 kis 磷酸盐(IP5) (图 4)。在含有 20mM HEPES (ρΗ7· 5)、6mMMgCl2、IOmM LiCl、ImMDTT、40ng/ μ I 肌醇磷酸盐底物、40 μ M ATP 和 5 μ Ci Y -32P 标记的 ATP (3000Ci/mmol)的反应缓冲液中进行纯化蛋白的玉米IPP2-K活性测定。将反应混合物点在PEI纤维素TLC板上并在1. ON HCl中展开。这些激酶活性测试的结果表明了玉米IPP2-K酶能够催化肌醇I，3，4，5，6五kis磷酸盐(IP5)通过肌醇环2-位的磷酸化反应转化产生肌醇1,2, 3, 4，5，6六kis磷酸盐(植酸)(图4)。此外，该玉米酶能够磷酸化肌醇1，4，5，6四磷酸盐(IP4)来产生IP5。另外观察到的酶活性包括将肌醇1，4，6-三磷酸盐(IP3)转化成放射性标记的IP3产物的能力。基于这些结果，玉米酶是肌醇磷酸激酶。为了进一步表征上述TLC测试中观察到的IPP2-K的肌醇1，4，6_三磷酸激酶活性的异构特异性，使用基于NMR的方法来检测底物转化。在该实施例中，将含有600 μ ID2O中 50mM Tris DC1，ρΗ7· 5、IOmM LiCl、6mM MgCl2UmM DTT、ImM 肌醇 1，4，6-三磷酸盐和ImM ATP的溶液置于5-mm NMR管中，并在fcuker DRX-600NMR上通过质子NMR分析。根据Liu等(2001)的方法，为了消除4. 8ppm处大的残余水峰同时保留下面的底物峰，使用RE⑶R-TOCSY脉冲程序收集数据。原料表征后，将45 μ g纯化的异种表达的玉米IPP2-K酶加入管中，并在使用质子NMR之前监控反应。在600MHz的质子共振频率在室温获得所有谱。使用了总共128个扫描，32K数据点，30度脉冲宽度和2秒驰豫延迟。使用标准Bruker软件XWIN-NMR进行数据收集和处理。图5中显示了表示在酶存在下在37°C O和120分钟孵育时间点的谱。开始和结束时间点的谱比较显示了在IPP2-K酶存在下，肌醇1，4，6-三磷酸盐转化成1，2，6-三磷酸盐(图5)。该结果清楚地证明了 IPP2-K可以催化肌醇1，4，6_三磷酸盐的去磷酸化和磷酸化,如TLC测试中所观察到的；此外，IPP2-K的激酶活性对于肌醇-2位的磷酸化是特异性的，证实了 IPP2-K基因编码的酶是肌醇多磷酸-2激酶。实施例7 :体内表征的IPP2-K活件通过遗传互补实验来测试从玉米DAS 5XH751分离的IPP2-K cDNA编码的蛋白的功能性。在一个实施例中，含有IPP2-K基因改变的双子叶植物拟南芥的突变体可以呈现降低的植酸累积表型。例如，本领域技术人员可以通过使用玉米IPP2-KcDNA序列作为询问序列搜寻TAIR数据库(www. arabidopsis. org)鉴定出公众可获得的描述为在预测的IPP2-K基因中含有T-DNA插入的拟南芥系。含有这样T-DNA插入的系可以呈现出中断的IPP2-K基因表达的降低或敲除，导致酶活性降低或丢失。使用Raboy在美国专利号006111168A中所述的螯合测试，将来自那些系自体授粉后代的种子接受肌醇六磷酸盐含量的分析。预测与玉米IPP2-K基因同源的拟南芥IPP2-K基因的破坏，以及引起的IPP2-K活性的消除，将导致肌醇六磷酸盐累积的降低。预测通过如Weigel,D. &Glazebrook, J. (2002)ArabidopsisA Laboratory Manual(拟南芥实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, NY)中所述的遗传转化将这样的植物工程化来表达功能性玉米IPP2-K基因时，这些突变系恢复正常的、接近正常的或提高水平的植酸累积。在另一个与上述拟南芥实验相似的实施例中，本领域技术人员可以从公众可获得的遗传收集如(http: //www. uniformmu. or R ；或 hhtp://w3. aces, uiuc. edu/maize-coop/)鉴定出IPP2-K基因破坏的玉米突变株。例如，由于插入基因中的Mu可换位元件的存在，一些玉米突变株的PP2-K基因受到破坏。预测这些突变株可以呈现降低水平的植酸累积。通过遗传转化通过表达功能性玉米基因来补充这样的突变体。通过遗传转化将这样的植物工程化来表达玉米IPP2-K基因时，预测这些突变系将恢复正常或接近正常水平的植酸累积。在上述的实施例中，本领域技术人员可以利用NMR分析来测定遗传上改变的植物中肌醇磷酸盐代谢物的特定含量和种类。预测由于IPP2-K基因表达的改变而呈现植酸降低累积的植物也具有改变的肌醇六磷酸盐前体含量和/或种类，如IP5、IP4等。例如，可以使用磷NMR分析这样突变体的植物提取物来测定肌醇六磷酸盐降低对肌醇六磷酸盐前体累积的作用。为了说明该实施例，进行了近交系DAS5XH751的成熟玉米种子中存在的肌醇磷酸盐分子的测定。该实施例中，将IOg干燥成熟玉米种子的玉米粉在0. 5N HCl中提取、过滤、浓缩至干并用80%甲醇洗涤。将甲醇浆液浓缩成黑色焦油并溶解于含有30mg/ml EDTA的D2O溶液中。用NaOH将溶液pH调节至>12。随后进行没有过滤的磷NMR分析。在配备5-mmlH/13C/19F/31P 探针的 fcuker DRX-400NMR 分光计上在 400. 13MHz 获得磷 NMR 谱。在室温用质子去耦获得所有谱。使用64K数据点、30度脉冲宽度和2. O秒驰豫延迟获得总共23K过渡现象(transient)，使得总获取时间为16小时。将原始数据补零至32K点谱并使用1. OHz指数加权函数来处理。图6中显示了所得到的谱。在非突变的玉米中，预测肌醇六kis磷酸盐(肌醇六磷酸盐)是主要的肌醇磷酸盐物质，存在少量肌醇五-和四-kis磷酸盐,如图6中观察到的。实施例8 :使用快中子(FN)照射的玉米种子诱变Van Harten (1998)充分描述了细胞FN轰击的方法和一般的遗传结果，且这种方法已经成功地用于如Li，X.等描述的拟南芥植物，，(2001)Plant J. 27 :235_242。通常可以期待FN产生大约几百个碱基对至几千个碱基对或更多的大小范围的删除。FN照射的效率取决于待处理生物材料的种类和性质。在该实施例中，在匈牙利布达佩斯的Atomic EnergyResearch Institute (原子能研究所)使用快中子束源进行照射。在诱变玉米种子样品的一个实验中，在照射之前通过测量在实验室干燥箱中80°C处理14h之前和之后的质量来测试采收后已经干燥至大约40%水分的大 量种子的含水量。基于样品％水w/w，根据工具束校准将调节实际计算的束暴露时间。对于这些实施例，使用2Y/Cd旋转几何形状的BRR的BIF的照射几何形状。通过U-235、Th-232裂变室和GM计数器来监控暴露。对单袋种子进行照射暴露1145秒，每次对于2Y/Cd产生实际平均12. 71mGy/s+3%的柯玛量率(kerma doserate)。用快中子ll_20Gy (11、13、15、17、20Gy)的目标剂量范围处理多个玉米种子样品。将所得到的Ml种子在标准中西部农场条件下种植并生长，自由授粉并单独收集每个Ml穗来产生M2家族。收集单个成熟穗、干燥、脱壳并装入用M2家族特异性标识标记的单个信封中。实施例9 :从诱变的种子分离基因组DNA使用Invitrogen 的 Charge-Switch 技术(CST)方法(Carlsbad, CA)以 96-孔形式从完整的、干燥的玉米种子分离的基因组DNA，使用以下的改进。从信封中单个取出每个M2家族的种子样品用于基因组DNA提取。将每个家族的6粒种子置于24孔-深孔平板的(CoStar Scientific, Cambridge MA)每个孔中(每个孔I个家族),吸水过夜,随后在冻干室中(Virtis, Gardiner NY)在真空下冻干最少 48 小时。使用 Genogrinder(Spex Certiprep,Metuchen NJ)的最大设置结合碳化鹤珠子(Small Part, Inc. , Miami Lakes FL)将干燥的种子研磨成粉末并重悬浮于包括O. 25%SDS、IOmM EDTA pH8. 0、50mM Tris pH8. O的含水缓冲剂中。离心后，将提取物上清液转移至新的平板并集合成每个孔6个样品(M2家族)的组合。通过在冰上加入NaCl至750mM和KOAc至1. 2M终浓度从溶液中沉淀出蛋白质，接着简短的离心。将PEG8000加入上清液中至8%的终浓度、混合并离心来沉淀gDNA。将沉淀物重悬浮于CST (Invitrogen)消化混合物中并按照制造商的方案使用Biomek FX自动操控的液体处理系统(Beckman-Couter, Inc. , Fullerton CA)来提取gDNA。洗脱后，将DNA样品等分成多个密封的平板中并存储于_80°C或4°C的潮湿容器中。实施例10 :基于PCR筛诜刪除突变体为了筛选目标基因中的删除，可以使用基于PCR的方法。US专利申请20050053975中描述了几种这样方法的实例。例如，基于基因座的序列数据来设计对应于目标基因两侧的基因组序列的寡核苷酸引物。使用可购得的对于长PCR最佳化的方法和酶(LA-Taq)按照制造商的推荐(Takara-Bio, Inc. , Shiga, Japan)将DNA样品进行PCR扩增。进行删除的检测，通过常规琼脂糖凝胶电泳(Sambrook)来观察PCR产物条带。为了说明这种方法的实用性，设计基于公开的信息将对应于玉米Adh-1基因座两侧的基因组DNA序列的寡核苷酸的引物。将这些引物用于在以下条件下扩增玉米基因组DNA:将含有IX LA-Taq缓冲剂、1. 6mM dNTPs、0. 5mM MgCl2,2%DMS0 和 LA-Taq 酶的反应混合物加入 gDNA 模板(l_30ng)和O. 4 μ M 寡核苷酸引物中(引物 Adhl6s :5’ -GTCTGACAACGCCTGAGATTGAATCGAA GACC-3’，引物Adh21a :5’-CAGCTACCACTTGCGCTTGAGGGATT TGAA-3’)。在以下温度体系下在自动化热循环仪中扩增 PCR 反应(MJ Research, Waltham, MA)步骤1:94°C I分钟；步骤2 98°C 10秒钟；步骤3 70°C 15分钟；步骤4 :重复步骤2&3另外31个循环；步骤5 72°C 10分钟；和步骤6 :保持4°C存储。使用常规琼脂糖凝胶电泳分析所得到的PCR产物。因此产生的扩增子包括完整的Adh-1基因加上几kb的侧翼序列，总共12. 3kb的DNA序列。在该反应中使用的模板gDNA在12. 3kb的范围内含有删除的情况中，本领域技术人员可以检测较小的PCR产物，其表示来源种质的突变。我们已经对几个其他的目标基因使用了该方法。如这些实施例中所示的，本领域技术人员可以检测显示出相对于对照扩增子大小减小的PCR反应。可以将这些反应中所用DNA模板的种子来源指定为推定的删除突变体并接受重复的分析。一旦证实了删除，可以使来自该家族的突变玉米生长并自体授粉来产生纯合的种质。可以使用如Raboy上文所述的植酸检测的常规测定来测量10至20粒M3种子中来自这样种质的种子中的肌醇六磷酸盐含量。可以使含有降低肌醇六磷酸盐的种子再次生长并在动物饲养测试或其它用途中测试提高的营养价值。参考文献Altschul, S. 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权利要求
1.一种具有通过基因敲除提供的所需性状的突变植物的生产方法，该方法包括 Ca)提供植物花粉或植物种子的集合； (b)用选自UV、y-照射、X-射线或快中子的照射处理所述植物花粉或植物种子的集合；和 (c)选择具有所需性状的突变植物。
2.根据权利要求1所述的具有通过基因敲除提供的所需性状的突变植物的生产方法，其中该植物种子的集合是玉米仁或卡诺拉种子的集合。
3.根据权利要求1所述的具有通过基因敲除提供的所需性状的突变植物的生产方法，其中该照射是快中子，且其中被照射的花粉被用作该突变的来源。
4.根据权利要求1所述的具有通过基因敲除提供的所需性状的突变植物的生产方法，其中该基因敲除是在编码肌醇多磷酸2-激酶的基因中。
5.根据权利要求1所述的具有通过基因敲除提供的所需性状的突变植物的生产方法，其中该照射是快中子。
6.根据权利要求1所述的具有通过基因敲除提供的所需性状的突变植物的生产方法，其中提供了植物种子的集合。
7.根据权利要求2所述的具有通过基因敲除提供的所需性状的突变植物的生产方法，其中植物种子的集合是玉米仁的集合。
全文摘要
本发明涉及肌醇多磷酸2-激酶基因及其用途，具体而言，本发明涉及植酸生物合成途径中新鉴定的多核苷酸和多肽，及其变体和衍生物；制备多核苷酸、多肽、变体、衍生物和拮抗剂的方法。特别地，本发明涉及编码肌醇多磷酸2-激酶(IPP2-K)的多核苷酸和呈现这样的活性以降低植酸和/或提高非植酸磷的方式来调节植酸生物合成的多肽，尤其是在玉米或大豆动物饲料中。
文档编号A01H1/06GK103039358SQ20121033788
公开日2013年4月17日 申请日期2005年9月9日 优先权日2004年9月9日
发明者M·A·汤普森, H·J·布特勒, Y·孙, V·K·舒克拉 申请人:美国陶氏益农公司