利用孤雌生殖进行裙带菜种苗培育的方法
【专利摘要】本发明涉及裙带菜培育的方法，具体的说是一种利用孤雌生殖进行裙带菜种苗培育的方法。将雌性配子体进行诱导培养至幼孢子体达到1mm以上转入充气培养条件下，进而完成孤雌生殖孢子体的生活史，获得成熟的孢子体；将其孢子叶置于海水中释放得到游孢子，待释放得到游孢子的海水颜色为黄褐色后，将游孢子附着在苗帘上，而后将苗帘放入新鲜海水中；待萌发的游孢子全部发育成雌配子体并充分生长后，降低光强，延缓配子体的发育使其度过高水温的夏季；将雄配子体与附着在苗帘上的雌配子体共同培养，完成发育和受精过程；待幼孢子体达到200μm左右，转到海上栽培，即实现裙带菜的培育。本发明通过孤雌生殖生活史可以完成雌配子体克隆的更新和扩大培养，对于纯系的保存和杂交育种具有重要意义。
【专利说明】利用孤雌生殖进行裙带菜种苗培育的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及裙带菜培育的方法，具体的说是一种利用孤雌生殖进行裙带菜种苗培育的方法。
【背景技术】
[0002]裙带菜种苗培育有游孢子采苗和配子体采苗两种途径，目前大规模育苗生产中以前者为主，后者只起辅助作用。配子体采苗的主要缺点是，配子体克隆接种到苗帘之后，只是靠藻体分泌的粘性物质附着在苗绳上，其牢固度非常差。而且幼孢子体在假根形成之前，依赖雌配子体附着在苗绳上。因此，这种松散的附着强度造成出苗以后在海上暂养时脱苗情况非常严重。相比之下，游孢子对基质的附着强度要高得多。配子体克隆杂交育种和育苗的最大优点在于能够产生性状高度一致的孢子体后代。因此，如果能将以上两种种苗培育方法的优势结合起来，将会对裙带菜良种选育和种苗培育工艺产生积极的推动作用。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种利用孤雌生殖进行裙带菜种苗培育的方法。
[0004]为实现上述目的本发明采用的技术方案为:
[0005]一种利用孤雌生殖进行裙带菜种苗培育的方法，
[0006]1)将雌性配子体进行诱导培养至幼孢子体达到1mm以上转入充气培养条件下，进行完成孤雌生殖孢子体的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子体；
[0007]2)将上述孤雌生殖成熟的孢子体的孢子叶置于海水中释放得到游孢子，待释放得到游孢子的海水颜色为黄褐色后，将游孢子附着在苗帘上，而后将苗帘放入新鲜海水中；
[0008]3)上述附着游孢子的苗帘在光强50-80 μ mol photons ηι?水温18 — 22°C,光周期12h白天:12h黑夜条件下培养13-15d，待萌发的游孢子全部发育成雌配子体并充分生长后，降低光强至2-10 μ mol photons π2^，延缓配子体的发育使其度过高水温的夏季；
[0009]4)将雄配子体与附着在苗帘上的雌配子在50-80 μ mol photons n^s—1光强下完成发育和受精过程；待幼孢子体达到200-500 μ m左右，转到海上栽培，即实现裙带菜的良种选育和种苗培育。
[0010]所述步骤1)将雌性配子体在PES海水培养基中以温度18-20°c，光照强度50 —80 μ mol photons nT2s4,光周期12h白天:12h黑夜；并每3_5天更换一次培养基的条件下静止培养至幼孢子体达到1_ ;
[0011]培养至1mm的幼孢子体在充入空气，以温度18_20°C，光照强度50 — 80 μ molphotons n^s—1,光周期12h白天:12h黑夜；并每2_3天更换一次PES海水培养基的条件下培养至幼孢子体长度达到1cm ；
[0012]培养至1cm的幼孢·子体在4_18°C，利用自然海水充入空气翻滚(请参考文献Panget al.2009)培养，并在自然海水中添加2.5mgL_1的NaN03和0.25mgL_1的ΚΗ2Ρ04,并每2-3天更新一次自然海水，进而完成孤雌生殖孢子体的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子体。[0013]所述PES培养基为每IL消毒海水中添加20mL制备液；制备液为每IL蒸馏水中加ANaN033.5g、KH2P04 0.5g、铁金属液250mL和金属液250mL ;经溶解消毒，冷却待用；铁金属液为，每IL蒸馏水中加入Fe (NH4)2 (SO4)2.6H20 0.702g和Na2EDTA 0.6g ;金属液为，每IL蒸馏水中加入 Na2EDTA lg, H3BO3 1.14g, FeCl3.6H20 49mg, MnSO4.H2O 164mg, ZnSO4.7H2022mg 和 CoSO4.7 H2O 4.8mg。
[0014]所述步骤2)将成熟的孢子体孢子叶割下消毒除杂藻后，阴干30 - 60min，将孢子叶放入海水中放散得游孢子，待放散得游孢子的海水颜色变为黄褐色后，游孢子放入苗帘，孢子附着密度控制在120倍放大倍数下60 - 100个附着的游孢子，而后将苗帘放入新鲜海水中。
[0015]本发明所具有的优点
[0016]1.本发明选育的方法是通过孤雌生殖诱导雌性配子体克隆产生的孢子体成熟后，释放的游孢子萌发后全部成为雌性配子体，它们与最初的雌性配子体克隆在遗传上是完全一致的。
[0017]2.本发明选育方法采用孤雌生殖产生的孢子体成熟后，释放的游孢子及其形成的雌配子体都可以牢固的附着在苗绳上，其牢固程度可以耐受高压水枪的冲洗。
[0018]3.本发明选育方法中游孢子附着到苗帘后，通过双高光技术控制配子体的生长、度夏和发育过程。首先保障雌性配子体充分生长，然后与雄性配子体克隆一起培养，使雌雄配子体同步发育 ，完成受精。
[0019]4.本发明中孤雌生殖孢子体成熟后释放的游孢子形成的雌性配子体与雄性配子体克隆杂交，产生的子一代孢子体在遗传上也是高度一致的，类似于配子体克隆单一交配组合后代。
[0020]5.本发明孤雌生殖产生的游孢子与亲本雌性配子体具有完全一致的遗传背景，因此可以取代雌配子体进行良种选育和种苗培育。
【具体实施方式】
[0021]实施例1
[0022]将雌性配子体(雌性配子体的获得方式请参考Shan, T.F.and Pang, S.J.2009.Assessing genetic identity of sporophytic offspring of the brown alga Undariapinnatifida derived from mono-crossing of gametophyteclones by use of amplifiedfragment length polymorphism and microsatellite markers.Phycol.Res.57:36-44.文献中的记载)在PES海水培养基中以温度18°C，光照强度50μπιΟ1 photons m—2s—\光周期12h白天:12h黑夜；并每3天更换一次培养基的条件下静止培养20天后，孤雌生殖产生的孢子体达到Imm以上，转到2L烧杯中充入空气，以温度18*€，光照强度50μπιο1 photonsm—2s—\光周期12h白天:12h黑夜；并每3天更换一次PES海水培养基的条件下培养至幼孢子体长度达到Icm ;将长度达到Icm的幼孢子体转到80升PP水箱利用自然海水充入空气翻滚培养(翻滚培养方式请参考 Pang, S.J.，Liuj F.，Shan, T.F.，Gao，S.Q.and Zhang, Z.H.2009.Cultivation of the brown alga Sargassum horneri:sexual reproduction andseedling production in tank culture under reduced solar irradiance in ambienttemperature.J.App1.Phycol.21:413-22.)，培养幼孢子体的自然海水中添加 2.5mgL—1 的NaNO3和0.25mgL_1的KH2PO4,并每2天更新一次添加添加2.5mgL_1的NaNO3和0.25mgL_1的KH2PO4的自然海水，水温的季节变化范围为4-18°C，进而完成孤雌生殖孢子体的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子体。
[0023]待上述孤雌生殖孢子体成熟，将孢子叶割下，用消毒纱布反复擦拭孢子叶表面，除去表面附着的杂藻，阴干30 - 60min，将孢子叶放入海水中放散游孢子，待释放得到游孢子的海水颜色变为黄褐色后，放入8m长的苗绳，孢子附着密度控制在120倍放大倍数下60 —100个附着的游孢子即可，之后将苗绳放入新鲜海水中。在光强50μπιΟ1 photons JiT2iT1,水温18 - 22°C，光周期12h白天:12h黑夜条件下培养15d，萌发的游孢子全部发育成雌配子体并充分生长，之后降低光强至IOymol photons IrT2iT1以下，延缓配子体的发育，使其度过高水温的夏季。
[0024]孤雌生殖产生的孢子体成熟后，释放的游孢子及其形成的雌配子体都可以牢固的附着在苗绳上，其牢固程度可以耐受高压水枪的冲洗。
[0025]游孢子附着到苗帘后，通过双高光技术控制配子体的生长、度夏和发育过程。具体为，第一高光期光强控制在50 μ mol photons IrT2iT1，使配子体充分生长，之后降低光强至10 μ mo 1 photons Ir TiV1以下,延缓配子体的生长,度过夏季高水温。第二高光期光强提高至50 μ molphotons IrTiV1以上,使雌雄配子体同时发育,完成受精。
[0026]将雄配子体打碎后，与附着在苗绳上的雌配子体一起培养，光强提高至50 μ molphotons HT2iT1以上，完成发育和受精过程。当幼孢子体达到200 μ m左右，转到裙带菜主栽培区-大连旅顺黄金山海区，海上暂养10天，然后夹苗，完成海上养成。
[0027]实施例2
[0028]若实现大规模生产培育，可将实施例1中孤雌生殖成熟的孢子体释放产生的雌配子体，再通过上述的诱导以及孤雌生殖孢子体的生活史的过程大量获得孤雌生殖成熟的孢子体。
[0029]待上述孤雌生殖孢子体成熟，将孢子叶割下，用消毒纱布反复擦拭孢子叶表面，除去表面附着的杂藻，阴干30 - 60min，将孢子叶放入育苗池的海水中放散游孢子，待释放得到的游孢子的海水颜色变为黄褐色后，放入苗帘(每个苗帘上缠绕的苗绳长100m)，孢子附着密度控制在120倍放大倍数下60 - 100个附着的游孢子即可，之后将苗帘放入新鲜海水中。在光强50 μ mol photons IrTiV1,水温18 — 22°C,光周期12h白天:12h黑夜条件下培养15d，萌发的游孢子全部发育成雌配子体并充分生长，之后降低光强至10 μ mol photonsIn-2S-1以下，延缓配子体的发育，使其度过高水温的夏季。
[0030]孤雌生殖产生的孢子体成熟后，释放的游孢子及其形成的雌配子体都可以牢固的附着在苗绳上，其牢固程度可以耐受高压水枪的冲洗。
[0031]将雄配子体打碎后，与附着在苗帘上的雌配子体一起培养，光强提高至50 μ molphotons HT2iT1以上，完成发育和受精过程。当幼孢子体达到200 μ m左右，将苗帘转到裙带菜主栽培区——大连旅顺黄金山海区，海上暂养10天，然后夹苗，完成海上养成。通过以上方法，大量成熟的孤雌生殖孢子体可以释放足够量的游孢子，用于裙带菜大规模的种苗培育，同时大量培养扩增雄性配子体，完成发育和受精过程。
[0032]按照上述的养殖方法，从当年10月份至翌年4月份作为一个养殖周期。翌年4月测量时，孢子体平均长、宽、鲜重分别为211cm，48.8cm和373g，孢子体后代经济性状高度一致；叶片光滑，品质优良。`
【权利要求】
1.一种利用孤雌生殖进行裙带菜种苗培育的方法，其特征在于:1)将雌性配子体进行诱导培养至幼孢子体达到1mm以上转入充气培养条件下，完成孤雌生殖孢子体的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子体；2)将上述孤雌生殖成熟的孢子体的孢子叶置于海水中释放得到游孢子，待释放得到游孢子的海水颜色为黄褐色后，将游孢子附着在苗帘上，而后将苗帘放入新鲜海水中；3)上述附着游孢子的苗帘在光强50-80μ mol photons m-2s-1,水温18 — 22°C,光周期12h白天:12h黑夜条件下培养13-15d，待萌发的游孢子全部发育成雌配子体并充分生长后，降低光强至2-10 μ mol photons m-2s-1，延缓配子体的发育使其度过高水温的夏季；4)将雄配子体与附着在苗帘上的雌配子在50-80μ mol photonsm-2s-1光强下完成发育和受精过程；待幼孢子体达到200-500 μ m左右，转到海上栽培，即实现裙带菜的培育。
2.按权利要求1所述的利用孤雌生殖进行裙带菜种苗培育的方法，其特征在于:所述步骤1)将雌性配子体在PES海水培养基中以温度18-20°C，光照强度50 —80 μ mol photons m-2s-1,光周期12h白天:12h黑夜；并每3_5天更换一次培养基的条件下静止培养至幼孢子体达到1_ ；培养至1mm的幼孢子体在充气培养条件下，以温度18-20°C，光照强度50 — 80 μ molphotons m-2s-1,光周期12h白天:12h黑夜；并每2_3天更换一次PES海水培养基的条件下培养至幼孢子体长度达到1cm ；培养至1cm的幼孢子体在4-18°C，利用自然海水充入空气翻滚培养，并在自然海水中添加2.SmgL.1的NaN03和0.25mgr1的ΚΗ2Ρ04，并每2-3天更新一次自然海水，进而完成孤雌生殖孢子体的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子体。
3.按权利要求1所述的利用孤雌生殖进行裙带菜种苗培育的方法，其特征在于:所述PES培养基为每1L消毒海水中添加20mL制备液；制备液为每1L蒸馏水中加入NaN03 3.5g、KH2P04 0.5g、铁金属液250mL和金属液250mL ;经溶解消毒，冷却待用；铁金属液为，每1L蒸馏水中加入Fe(NH4)2(S04)2.6H20 0.702g和Na2EDTA 0.6g ;金属液为，每1L蒸馏水中加入 Na2EDTA lg, H3B03 1.14g, FeCl3.6H2049mg, MnS04.H20 164mg, ZnS04.7H20 22mg 和CoS04.7H20 4.8mg。
4.按权利要求1所述的利用孤雌生殖进行裙带菜种苗培育的方法，其特征在于:所述步骤2)将成熟的孢子体孢子叶割下消毒除杂藻后，阴干30 - 60min，将孢子叶放入海水中放散得游孢子，待放散得游孢子的海水颜色变为黄褐色后，游孢子放入苗帘，孢子附着密度控制在120倍放大倍数下60 - 100个附着的游孢子，而后将苗帘放入新鲜海水中。
【文档编号】A01G33/00GK103651094SQ201210339467
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月13日 优先权日:2012年9月13日
【发明者】单体锋, 逄少军, 高素芹 申请人:中国科学院海洋研究所