专利名称：一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法
技术领域：
本发明涉及玻璃化超低温保存领域，具体涉及一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法。
背景技术：
种质资源(Germplasm resources)是决定生物种性并将其丰富的遗传信息从亲代传给子代的遗传物质的总称，是物种进化、遗传学研究和植物育种的物质基础。实现种质资源保存是我国社会、生态及经济发展的战略需求。
超低温保存(Cryopreservation)是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。玻璃化法(Vitrification)超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液(Plant Vitrification Solutions, PVS)中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首选方法。国内外先后对200多种植物的不同外植体进行了超低温保存技术研究，但有些植物(如热带植物或者含水量高的植物)恢复培养后成活率不高或根本不能成活，添加一定的外源物质有利于提高超低温保存成活率，但如何从众多可添加的外源物质中筛选出效果较好的几种，一般离体组织筛选外源物质，组织或细胞超低温保存后活性检测手段不够直接，并存在一定误差，而直接观察恢复生长情况又较慢，并且很多进行超低温保存的材料为珍稀濒危保护植物，不能用大量材料消耗去筛选有效的外源物质建立超低温保存体系，以上原因大大制约了有效外源物质筛选及超低温保存体系建立的效率。而拟南芥幼苗的玻璃化法超低温保存研究发现了一套超低温保存标准体系，用于筛选外源物质及作为研究对象进行深入的超低温保存机理研究，可为植物超低温保存技术体系的建立及优化提供科学的理论依据，最终实现快速高效的优良植物种质资源中长期离体保存。
发明内容
本发明的目的在于针对现有超低温保存体系的上述不足，提供一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，为有效外源物质的筛选提供了一条新途径，对植物种质资源保存起到了指导的作用。本发明首先公开了一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，为以拟南芥幼苗为实验对象，将外源物质添加到玻璃化溶液中用于拟南芥幼苗的玻璃化超低温保存，以不添加外源物质处理的拟南芥幼苗为对照，通过恢复生长率的比较评价外源物质的效果。
较优的，所述筛选方法具体步骤如下I)拟南芥幼苗的获得将拟南芥种子春化处理后，培养O 72h，获得不同苗龄的拟南芥幼苗；2)将不同苗龄的拟南芥幼苗分为实验组和对照组进行玻璃化超低温保存，实验组的玻璃化溶液中添加外源物质，对照组不添加；3)将实验组和对照组玻璃化超低温保存后的幼苗解冻、恢复培养后，比较实验组和对照组内苗龄相同的拟南芥幼苗的恢复生长率。较优的，步骤I)所述拟南芥种子是经过消毒的拟南芥种子，所述消毒的方法为用65 75%乙醇消毒10 30s,无菌水冲洗2 4遍后再用含15 25wt%NaC10及O O. 03wt%Tween20的水溶液消毒5 15min,无菌水冲洗5 6遍。更优的，步骤I)所述拟南芥种子是经过消毒的拟南芥种子，所述消毒的方法为用 70%乙醇消毒15s，无菌水冲洗4遍后再用含20wt%NaC10及O. 01wt%Tween 20的水溶液消毒IOmin,无菌水冲洗6遍。较优的，步骤I)所述春化条件为O 10°C，春化处理时间为24 72h。更优的，步骤I)所述春化条件为4°C，春化处理时间为48h。较优的，步骤I)所述培养是在MS固体培养基上，每天先光照培养8 12h，光强100 200 μ mo I πΓ2，培养温度20 27°C ;然后黑暗培养，培养温度为20 25°C。更优的，步骤I)所述培养是在MS固体培养基上，每天先光照培养8h，光强150 μ molnT2，培养温度25°C ;然后黑暗培养，培养温度为20°C。春化后的种子在MS固体培养基上的培养,按一天(24h)为单位,先进行光照培养，光照后，当天剩余的时间进行黑暗培养，一天结束后，再进行第二天的光照培养，这样光照培养与黑暗培养交替进行。例如先光照培养8h，然后黑暗培养的时间为16h，如此交替进行。较优的，步骤I)获得的拟南芥幼苗的苗龄分别为0、48、51、54、57、60、63、66、69、72h。更优的，步骤I)获得的拟南芥幼苗的苗龄分别为60、63、66、69、72h。最优的，步骤I)获得的拟南芥幼苗的苗龄分别为60h和72h。较优的，步骤2)所述玻璃化超低温保存方法为将拟南芥幼苗放入装载液中，室温处理20 30min ;将装载液吸除后，加入玻璃化溶液(TC处理40 60min ;将置于玻璃化溶液中的拟南芥幼苗放入液氮中保存O. 5 2h。更优的，步骤2)所述玻璃化超低温保存方法为将拟南芥幼苗放入装载液中，室温处理20min ;将装载液吸除后，加入玻璃化溶液0°C处理50min ;将置于玻璃化溶液中的拟南芥幼苗放入液氮中保存Ih。较优的，步骤2)所述装载液为含有2M甘油，O. 4M蔗糖的MS培养液；所述玻璃化溶液为含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v 二甲基亚砜和O. 4M蔗糖的MS培养液。上述玻璃化溶液为对照组使用的，不包括外源物质的玻璃化溶液；实验组所使用的玻璃化溶液还需要在上述玻璃化溶液的基础上，加入待筛选的外源物质。较优的，步骤3)所述解冻方法为将超低温保存的拟南芥幼苗从液氮中取出，35 40°C水浴解冻60 120s ;将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液室温处理30 50min，每隔5 IOmin换一次洗涤液；所述洗涤液为含有I. O I. 2M蔗糖的MS培养液。更优的，步骤3)所述解冻方法为将超低温保存的拟南芥幼苗从液氮中取出，40° C水浴解冻90s ;将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液室温处理40min，每隔IOmin换一次洗涤液，所述洗涤液为含有I. 2M蔗糖的MS培养液。冷冻管于水浴锅中解冻时需要不时轻轻摇动。步骤3)拟南芥幼苗的恢复培养条件范围同步骤I)拟南芥种子的培养条件，具体如下较优的，步骤3)所述恢复培养为将洗涤后的幼苗移到MS固体培养基中，每天先光照培养8 12h，光强100 200 μ mo I m_2，培养温度20 27°C ;然后黑暗培养，培养温度为 20 25°C。 更优的，步骤3)所述恢复培养为将洗涤后的幼苗移到MS固体培养基中，每天先光照培养8h，光强150 μ mo I πΓ2，培养温度25°C ;然后黑暗培养，培养温度为20°C。较优的，步骤3)在拟南芥幼苗恢复培养的第15天统计成活的拟南芥幼苗的数量，计算恢复生长率，所述恢复生长率=成活的幼苗数量/幼苗总数量X 100%。本发明筛选方法的标准为比较苗龄相同的拟南芥幼苗未添加外源物质处理(对照组)和添加外源物质处理(实验组)后，恢复生长率的变化，使对照组和实验组恢复生长率变化较大的外源物质为有效的外源物质。较优的，比较60h苗龄的拟南芥幼苗未添加外源物质处理(对照组)和添加外源物质处理(实验组)的恢复生长率变化，60h苗龄拟南芥幼苗对照组的恢复生长率小于等于25%，添加外源物质处理后，使拟南芥幼苗恢复生长率增大到大于等于50%的外源物质为有效的外源物质。较优的，本发明所使用的拟南芥为拟南芥哥伦比亚生态型(Arabidopsisthaliana ecotype Col_0)o较优的，步骤2)实验组和对照组内，苗龄相同的拟南芥幼苗分别设3 5个重复。本发明所使用的MS固体培养基为IL培养基中含有1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4, 370mg MgSO4 · 7H20，440mg CaCl2 · 2H20 (以上 5 种成分为大量元素)，37. 3mgNa2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌醇，0. 5mg 烟酸，0. 5mg 盐酸吡哆醇，0. Img 盐酸硫胺素，2mg 甘氨酸，O. 83mgKI, 6. 2mg H3BO3, 22. 3mg MnSO4 · 4H20,8. 6mg ZnSO4 · 7H20,0. 25mgNa2MoO4 ·2Η20，0· 025mg CuSO4 ·5Η20，0· 025mg CoCl2 .6H20，30g 蔗糖，IOg 琼脂粉，余量为水，调整培养基pH为5. 8。本发明所使用的MS培养液为IL培养基中含有1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4, 370mg MgSO4 · 7H20，440mg CaCl2 · 2H20 (以上 5 种成分为大量元素)，37. 3mgNa2EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌醇，0. 5mg 烟酸，0. 5mg 盐酸吡哆醇，0. Img 盐酸硫胺素，2mg 甘氨酸，O. 83mgKI, 6. 2mg H3BO3, 22. 3mg MnSO4 · 4H20,8. 6mg ZnSO4 · 7H20,0. 25mgNa2MoO4 ·2Η20，0· 025mg CuSO4 ·5Η20，0· 025mg CoCl2 ·6Η20，余量为水，调整培养基 pH 为 5. 8。本发明第二方面还公开了抗坏血酸(VC)、脱落酸(ΑΒΑ)、甜菜碱(GB)或还原型谷胱甘肽(GSH)在玻璃化超低温保存中的应用。较优的，所述应用具体为抗坏血酸(VC)、脱落酸(ΑΒΑ)、甜菜碱(GB)或还原型谷胱甘肽(GSH)作为玻璃化溶液外源物质的应用。更优的，所述抗坏血酸的浓度为ImM、所述脱落酸的浓度为I μ Μ、所述甜菜碱的浓度为10mM、所述还原型谷胱甘肽的浓度为O. 16mM。本发明筛选方法筛选到的外源物质能够有效提高拟南芥幼 苗的恢复生长率，在拟南芥幼苗的玻璃化超低温保存中，将苗龄60h的拟南芥幼苗的恢复生长率提高2倍左右，或者将苗龄72h的拟南芥幼苗的恢复生长率从O提闻到O以上，最闻可以提闻到14. 3%。并且本发明以拟南芥作为研究对象，筛选得到了具有广泛超低温保存效果的外源物质，不仅可应用于拟南芥的超低温保存，还可以应用于其他植物物种的超低温保存，例如亚热带植物(大苞鞘石斛)或者热带植物(百子莲)，或者还可以应用于不同植物外植体(例如胚性愈伤组织、原球茎等)的超低温保存，应用范围广。可见，本发明的促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，结果准确，可重复性强，应用范围广，可成批量进行筛选，效率高，为外源物质的筛选提供了一条有效途径，为玻璃化超低温保存技术的优化提供了技术保证，将对植物种质资源保存起到指导作用。
图I :对照组拟南芥不同苗龄幼苗超低温保存恢复生长率变化趋势2 :对照组拟南芥不同苗龄幼苗超低温保存恢复生长照片图3 :不同外源物质对拟南芥萌发60h幼苗超低温保存后恢复生长率的影响(CK为未添加外源物质的超低温保存体系)图4 :不同外源物质对拟南芥萌发72h幼苗超低温保存后恢复生长率的影响
具体实施例方式在进一步描述本发明具体实施方式
之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。实施例II.实验材料实验对象拟南芥哥伦比亚生态型(Arabidopsis thaliana ecotype Col_0)。实验试剂I)装载液含有2M甘油，O. 4M蔗糖的MS培养液；2)玻璃化溶液含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v 二甲基亚砜和O. 4M蔗糖的MS培养液；3)洗涤液添加有I. 2M蔗糖的MS培养液和添加有I. OM蔗糖的MS培养液；4)MS 固体培养基IL 培养基中含有 1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4,370mg MgSO4 · 7H20，440mg CaCl 2 · 2H20，37. 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌酉享,0. 5mg烟酸,0. 5mg盐酸卩比卩多醇,0. Img盐酸硫胺素，2mg甘氨酸，O. 83mgKI,6. 2mg H3BO3,22. 3mg MnSO4 · 4H20，8. 6mg ZnSO4 · 7H20，0. 25mg Na2MoO4 · 2H20，0. 025mg CuSO4 · 5H20，0. 025mg CoCl 2 · 6H20, 30g蔗糖，IOg琼脂粉，余量为水，调整培养基pH为5. 8 ;5) MS 培养液1L 培养基中含有 1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4, 370mgMgSO4 · 7H20，440mg CaCl2 · 2Η20，37· 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌醇，0. 5mg烟酸,0. 5mg盐酸批卩多醇，0. Img盐酸硫胺素，2mg甘氨酸，O. 83mgKI,6. 2mg H3BO3, 22. 3mgMnSO4 · 4H20，8. 6mg ZnSO4 · 7H20，0. 25mg Na2MoO4 · 2H20，0. 025mg CuSO4 · 5H20，0. 025mgCoCl2 · 6H20，余量为水，调整培养基pH为5. 8。2.筛选方法I)拟南芥幼苗的获得将拟南芥种子用70%乙醇消毒15s，无菌水冲洗4遍后再用含20wt%NaC10和O. 01wt%Tween 20的水溶液消毒lOmin，无菌水冲洗6遍；然后将消毒后的种子在4°C春化48h,置于MS固体培养基上培养,培养条件为每天光照培养8h,光强150 μ mo I m_2，培养温度25°C;然后黑暗培养16h，培养温度为20°C，将种子培养O 72h(本实施例具体选取了培养0h、48h、51h、54h、57h、60h、63h、66h、69h、72h)，获得不同苗龄的拟南芥幼苗。2)将不同苗龄的拟南芥幼苗分为实验组和对照组，实验组和对照组同一苗龄的幼苗设3个平行，将50株幼苗放入装有Iml装载液的2ml冷冻管中，室温处理20min ;将装载液吸除，加入玻璃化溶液，0° C处理50min ;将冷冻管投入液氮中保存lh。实验组的玻璃化溶液中添加有外源物质(I μ M脱落酸Abscisic acid, ABA ；lmMCaCl2 ；10mM KNO3 ;6mM硫辛酸 Lipoic acid ；0. 16mM 还原型谷胱甘肽 GSH ; ImM 抗坏血酸 VC ；IOmM舌甘菜喊Glycine betaine, GB ；6mM聚乙烯卩比咯烧酮PVP ；0. I μ M裡黑素Melatonin,见表I)。3)冷冻管于液氮中保存Ih后，取出冷冻管，快速放入35 40° C水浴锅中，解冻90s，并不时轻轻摇动；将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液，室温处理30 40min，每隔5 IOmin换一次洗漆液；洗漆后的幼苗移到MS固体培养基中,放入植物培养箱,培养箱各项参数同种子萌发条件(每天光照培养12h，光强lOOymol m_2，培养温度20°C ;然后黑暗培养12h，培养温度为25°C);拟南芥幼苗恢复培养15天后，计算实验组和对照组内拟南芥幼苗的恢复生长率，并比较实验组和对照组内苗龄相同的拟南芥幼苗的恢复生长率。对照组O 72h苗龄的拟南芥幼苗的恢复生长率曲线如图I所示。实验组60h苗龄和72h苗龄的拟南芥幼苗的恢复生长率见表2。表I实验组玻璃化溶液中添加的外源物质
权利要求
1.一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，其特征在于，为以拟南芥幼苗为实验对象，将外源物质添加到玻璃化溶液中用于拟南芥幼苗的玻璃化超低温保存，以不添加外源物质处理的拟南芥幼苗为对照，通过恢复生长率的比较评价外源物质的效果。
2.如权利要求I所述的筛选方法，其特征在于，具体步骤如下 1)拟南芥幼苗的获得将拟南芥种子春化处理后，培养O 72h，获得不同苗龄的拟南芥幼苗； 2)将不同苗龄的拟南芥幼苗分为实验组和对照组进行玻璃化超低温保存，实验组的玻璃化溶液中添加外源物质，对照组不添加； 3)将实验组和对照组玻璃化超低温保存后的幼苗解冻、恢复培养后，比较实验组和对照组内苗龄相同的拟南芥幼苗的恢复生长率。
3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤I)所述春化条件为O 10°C，春化处理时间为24 72h。
4.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤I)所述培养是在MS固体培养基上，每天先光照培养8 12h，光强100 200μπιο1 πΓ2，培养温度20 27°C ;然后黑暗培养，培养温度为20 25°C。
5.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤I)获得的拟南芥幼苗的苗龄分别为 0、48、51、54、57、60、63、66、69、72h。
6.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)所述玻璃化超低温保存方法为将拟南芥幼苗放入装载液中，室温处理20 30min ;将装载液吸除后，加入玻璃化溶液0°C处理40 60min ;将置于玻璃化溶液中的拟南芥幼苗放入液氮中保存O. 5 2h。
7.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)所述装载液为含有2M甘油，O. 4M蔗糖的MS培养液；所述玻璃化溶液为含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v 二甲基亚砜和O. 4M蔗糖的MS培养液。
8.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)所述解冻方法为将超低温保存的拟南芥幼苗从液氮中取出，35 40°C水浴解冻60 120s ;将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液室温处理30 50min，每隔5 IOmin换一次洗涤液；所述洗涤液为含有I. O I. 2M蔗糖的MS培养液。
9.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)所述恢复培养为将洗涤后的幼苗移到MS固体培养基中，每天先光照培养8 12h，光强100 200ymol m_2，培养温度20 27°C ;然后黑暗培养，培养温度为20 25°C。
10.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，在拟南芥幼苗恢复培养的第15天统计成活的拟南芥幼苗的数量，计算恢复生长率，所述恢复生长率=成活的幼苗数量/幼苗总数量 X 100%O
11.权利要求1-10任一权利要求所述筛选方法筛选获得的抗坏血酸、脱落酸、甜菜碱、还原型谷胱甘肽之任一在玻璃化超低温保存中的应用。
全文摘要
本发明涉及玻璃化超低温保存领域，具体涉及一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，为以拟南芥幼苗为实验对象，将外源物质添加到玻璃化溶液中用于拟南芥幼苗的玻璃化超低温保存，以不添加外源物质处理的拟南芥幼苗为对照，通过恢复生长率的比较评价外源物质的效果。本发明为促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，结果准确，可重复性强，应用范围广，可成批量进行筛选，效率高，为外源物质的筛选提供了一条有效途径，为玻璃化超低温保存技术的优化提供了技术保证，将对植物种质资源保存起到指导作用。
文档编号A01N3/00GK102823581SQ20121034270
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者申晓辉, 任丽, 张荻 申请人:上海交通大学