专利名称：一种黑莓组培苗叶片高效循环再生的方法
技术领域：
本发明涉及一种用黑莓组培苗叶片反复循环再生的方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术：
黑莓(Rubus spp.)为蔷薇科悬钩子属半灌木浆果类果树，果实为聚合果，营养丰富，富含糖、果酸及多种维生素，有防衰老和提高人体免疫力等功效，尤其是过氧化物歧化酶(SOD)含量为水果之最，是近年来国内外兴起的第三代水果之一，具有很高的经济价值。优良黑莓品种的培育和推广具有重要的应用和经济价值。目前，黑莓育种上多采用实生选优、杂交育种、辐射育种等常规育种手段为主，有一定的局限性，而且选育进程较慢，严重制约了黑莓优良品种的快速发展。
随着分子生物学的发展，基因工程技术为黑莓育种开辟了新途径。可以通过基因工程的方法，有针对性地引入特定基因，从而获得具有优良性状的转基因植株。而基因成功实现转化的关键在于拥有一个高效而稳定的不定芽离体再生体系。已有的黑莓组织培养的研究中，以茎尖、腋芽培养等快繁研究居多，但这些组织或器官多因取材时间或受农杆菌侵染的限制未能用于实践。叶片具有易于取材和培养操作的优势，而组培苗的叶片具有分生能力强、无菌不易污染等特点，有助于提高叶片的再生频率和遗传转化效率。目前黑莓离体再生研究已取得了较好成果，但都是单向的ー轮再生方法，国内外尚未见到有通过瓶外一次性取材，而达到瓶内永久循环再生黑莓苗的报道。
发明内容
发明目的本发明的目的是针对现有黑莓离体再生技术的不足，提供ー种利用黑莓试管苗叶片进行植株离体再生的方法，一方面为黑莓基因工程育种提供技术支撑，一方面为规模化生产快速提供优质苗木。本发明所述循环再生体系是指通过组织培养的手段，由不同培养阶段的不定芽提供叶片，多重循环获得再生苗的植物组织培养体系。具体内容为实现上述目的，本发明采用的解决方案是(1)瓶外获得黑莓茎段诱导产生初代试管苗；(2)黑莓试管苗叶片离体再生为完整植株；(3)愈伤组织分化所得不定芽叶片的离体循环再生；(4)继代増殖所得不定芽叶片的离体循环再生；(5)壮苗培养所得不定芽叶片的离体循环再生。(I)瓶外获得黑莓茎段诱导产生初代试管苗的方法是以黑莓一年生枝条的半木质化茎段为外植体，用浓洗衣液浸泡冲洗后，于体积比为(70 75) %的酒精中浸(30 60) S，用无菌水冲洗3 5次，再用(O. I O. 2) %升汞浸泡(5 8)min ;然后将外植体切成(I. O I. 5) cm长的带芽茎段，接种于不定芽诱导培养基上，培养(20 40) d，进行不定芽的继代増殖，每隔(20 30)d继代I次，继代2次以上的试管芽苗作为叶片离体再生的材料。
所述的茎段诱导不定芽培养基为MS+6-BA(0 O. 5)mg/L+ZT(O. 5 I. 0)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+ 琼脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2 ;所述的不定芽继代增殖培养基为MS+6-BA(0 O. 2)mg/L+TDZ (O O. l)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+ 琼脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2 ;所述的培养条件为培养室温度(25±3)で，光照度(1500 3000) lx，光照时间(12 14)h/d。上述解决方案中，诱导茎段形成不定芽的最佳培养基为MS+6-BA O. 3mg/L+ZT
O.5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5. 6g/L，ZT浓度过高会使不定芽出现玻璃化，并且抑制不定芽的生长；不定芽继代增殖最佳培养基为MS+TDZ0. 05mg/L+蔗糖(25 30) g/L+琼脂5. 6g/
し
(2)黑莓组培苗叶片离体再生为完整植株的方法包括以下步骤①组培苗及其叶片的选择当组培苗长至3叶以上时，选择最长边X最宽边为
O.5cmX0. 5cm以上的叶片，去掉边缘，修剪成(O. 4 O. 8) cm X (O. 4 O. 8) cm大小的叶块；②诱导叶片形成愈伤组织将步骤①修剪好的叶片在接种时背面紧贴于培养基表面；愈伤组织诱导培养基为MS+TDZ(0. I I. 0)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+琼脂5. 6g/L，pH值5. 8 6.2 ;培养时先在温度(25 ± 3) °C的条件下暗培养(10 15) d，当叶片边缘开始卷曲膨大产生少量愈伤颗粒时，转到光照度(1000 2000) lx、光照时间(12 14)h/d的条件下，培养(15 20) d后形成淡黄色、致密的愈伤组织；③诱导愈伤组织分化不定芽将步骤②所得愈伤组织取下，切成(O. 3 O. 6)cmX (O. 3 O. 6) cm的块状，接种到愈伤组织分化培养基上；愈伤组织诱导分化不定芽培养基为MS+6-BA(O. 5 2. 0)mg/L+TDZ(O I. 0)mg/L+IAA(0 O. 5)mg/L+ 蔗糖(25 30)g/L+琼脂5. 6g/L，pH值5. 8 6. 2 ;培养条件为培养室温度(25±3)で，光照度(1500 3000) lx，光照时间(12 14)h/d，培养时间为(25 35) d ;④不定芽的继代増殖将步骤③获得的不定芽转接于继代增殖培养基中；继代增殖培养基为MS+6-BA (O. 5 2. O) mg/L+ 蔗糖(25 30) g/L+ 琼脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2 ;培养条件为培养室温度(25±3) °C，光照度(1500 3000) lx，光照时间(12 14)h/d，培养时间为(20 30) d;⑤不定芽的壮苗培养将步骤④中株高大于I. 5cm的不定芽转接于壮苗培养基中；壮苗培养基为MS+6-BA (O. 3 O. 5)mg/L+NAA(0. 05 O. 2) mg/L+ 蔗糖(20 25) g/L+琼脂5. 68/し？!1值5.8 6.2;培养条件为:培养室温度(25 ±3) °C，光照度(1500 3000)lx，光照时间(12 14)h/d，培养时间为(15 20)d ;⑥不定芽的生根诱导将步骤⑤中获得的组培苗转接于生根培养基中；生根诱导培养基为1/2MS+NAA(0.03 O. l)mg/L+蔗糖(20 25) g/L+琼脂 5. 6g/L, pH 值 5. 8 6.2 ;培养条件为培养室温度(25±3) °C，光照度(1500 2000) lx，光照时间(12 14) h/山培养时间为(15 20) d;⑦生根苗的炼苗将步骤⑥获得的黑莓生根苗置于室内散射光处，炼苗(3 5)d，然后打开培养瓶盖，使组培苗于室内空气接触，(3 5) d后移栽至穴盘；⑧生根苗的移栽将步骤⑦炼好的黑莓生根苗从培养瓶中取出，挑选叶数为3 6个，生根数达3条以上，根系长达2. Ocm的生根苗，用水冲洗根部残留的培养基，移栽入蛭石泥炭土 珍珠岩园土= 1:1:1:2的混合基质(经过高压灭菌)中，移栽时应将组培苗的根系完全埋入基质中；浇足水后，保持温度(20 25)で，湿度(70 80) %，放置于阴凉处，每周浇I次透水，(35 45) d后，黑莓组培苗的移栽成活率可达97%以上。上述解决方案中，其中几个步骤的最佳优选培养基分别如下诱导叶片形成愈伤的最佳培养基为MS+TDZ O. 5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5. 6g/L，高浓度的TDZ诱导形成的愈伤过于紧实，不利于不定芽的分化，还会使愈伤组织变红，成为无分化能力的愈伤；愈伤组织分化的最佳培养基为MS+6-BAl. 5mg/L+IAA0. 3mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5. 6g/L，添加TDZ的分化率较高，但是不定芽极易产生玻璃化，添加IAA有助于不定芽的分化和生长；
不定芽继代增殖的最佳培养基为MS+6-BAl. Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂5. 6g/L，黑莓不定芽的继代増殖中只要添加一定浓度的6-BA即可达到较高的増殖系数，6-BA浓度高于I. 5mg/L时，所得不定芽虽然较多，但是芽体较小，当6-BA浓度高于2. Omg/L时，増殖系数开始下降，不定芽还出现不同程度的玻璃化；不定芽壮苗的最佳培养基为MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L+蔗糖25g/L+琼脂5. 6g/L，较低浓度的细胞分裂素和一定浓度的生长素进行搭配有利于不定芽的壮苗培养；不定芽生根的最佳培养基为1/2MS+NAA0. 05mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5. 6g/L，黑莓属于较易生根的植物，其组培苗在低盐的培养基中只要较低浓度的生长素即可快速生根，生根率达95%以上。(3)愈伤组织分化所得不定芽叶片的离体循环再生方法挑选(2)中由愈伤组织分化所得优质不定芽苗，把不定芽苗上大于O. 5cmX0. 5cm的叶片剪切下来，修剪成(O. 4
O.8) cmX (O. 4 O. 8) cm大小的叶块，接种于(2)中步骤②的愈伤组织诱导培养基中，进入下ー轮的循环再生，后续步骤同(2)中所述；修剪过叶片的不定芽苗和不符合条件的不定芽苗，转接于继代增殖培养基中，继续进行继代増殖培养。(4)继代増殖所得不定芽叶片的离体循环再生方法挑选(2)中继代増殖所得优质不定芽苗，把不定芽苗上大于O. 5cmX0. 5cm的叶片剪切下来，修剪成(O. 4 O. 8)cmX (O. 4 O. 8) cm大小的叶块，接种于(2)中步骤②的愈伤组织诱导培养基中，进入下一轮的循环再生，后续步骤同(2)中所述；修剪过叶片的不定芽苗和不符合条件的不定芽苗，转接于壮苗培养基中，继续进行组培苗的壮苗培养。(5)壮苗培养所得不定芽叶片的离体循环再生方法挑选(2)中壮苗培养所得优质不定芽苗，把不定芽苗上大于O. 5cmX0. 5cm的叶片剪切下来，修剪成(O. 4 O. 8)cmX (O. 4 O. 8) cm大小的叶块，接种于(2)中步骤②的愈伤组织诱导培养基中，进入下一轮的循环再生，后续步骤同(2)中所述；修剪过叶片的不定芽苗和不符合条件的不定芽苗，转接于生根培养基中，继续进行组培苗的生根诱导。本发明的技术方案是瓶外获取黑莓茎段，瓶内诱导产生不定芽，以继代培养获得不定芽的叶片为外植体，诱导形成愈伤组织，由愈伤组织诱导分化不定芽，对不定芽进行继代増殖和壮苗培养，最后诱导生根，炼苗、移栽。由实施案例I可知，愈伤组织诱导率可以达到100%，愈伤组织的分化率可以达到64. 4%以上，分化得到的不定芽的増殖倍数可达5. 74，生根诱导的生根率最高可达100%，平均生根数3. 61，移栽成活率96. 9%。
植株再生体系是获得转基因纯合体的关键环节，本发明提供了一种黑莓试管苗叶片离体循环再生的方法，成功解决了黑莓叶片愈伤分化及再生难的问题，为黑莓基因工程育种提供了技术支撑。本发明的独特在于利用试管苗叶片建立了黑莓植株循环离体再生体系，具有节本、高效、循环再生的优点。
图I本发明黑莓叶片循环再生技术路线图2本发明中修剪好的黑莓组培苗叶片图3本发明中组培苗叶片诱导的愈伤组织图4本发明中愈伤组织分化不定芽图5本发明中不定芽的继代増殖 图6本发明中生根组培苗图7本发明中移栽成活的黑莓组培苗
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步详细说明，但实施例仅是示例性的，对本发明不构成任何限制。本领域的技术人员应该理解的是在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，而这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。以下实施例所采用的黑莓栽培品种为“Kiowa”，如无特殊要求，所用植物组织培养的培养基的配制方法均按常规植物组织培养培养基的配制方法配制。实施例一诱导大田植株茎段产生不定芽以“Kiowa”一年生枝条的半木质化茎段为外植体，用浓洗衣液浸泡冲洗后，于体积比70%的酒精中浸45s，用无菌水冲洗3 5次，再用O. I %升汞浸泡8min ;然后将外植体切成(I. O I. 5) cm长的带芽茎段，接种于MS+6-BA0. 3mg/L+ZT0. 5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂
5.6g/L，pH值6. O的培养基上，并在(25±3)°C，光照度25001x，光照时间12h/d的条件下培养，30d后不定芽的诱导率为85%以上，每茎段可产生2 4个不定芽。实施例ニ黑莓组培苗叶片离体再生为完整植株当组培苗长至3叶以上时，选择最长边X最宽边为O. 5cmX0. 5cm以上的叶片，去掉边缘，修剪成O. 5cmX0. 5cm左右大小的叶块；将修剪好的叶片背面紧贴于MS+TDZO. 75mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5. 6g/L，pH值6. 2的培养基上，先在(25 ±3) V的温度条件下，暗培养14d，叶片边缘开始卷曲膨大产生少量愈伤颗粒，然后转到光照度15001x，光照时间12h/d的条件下，培养20d后形成淡黄色、致密的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100% ；将愈伤组织取下，切成(O. 3 O. 6) cmX (O. 3 O. 6) cm的块状，接种到MS+6-BA1. 0mg/L+IAA0. 2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 的培养基上，在(25±3)°C，20001x，光照时间12h/d的条件下培养，30d后不定芽的分化率为53. 3%，每块愈伤分化的平均不定芽数为2. 4个；将不定芽转接于MS+6-BA2. Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂5. 6g/L，pH值6. O的培养基上，在(25±3)°C，30001x，光照时间14h/d的条件下培养，30d后不定芽的增殖倍数达6. 44，但是有少量不定芽出现轻微玻璃化；将株高大于I. 5cm 的不定芽转接于 MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 05mg/L+ 鹿糖 25g/L+琼脂5. 6g/L，pH值6. O的培养基上，在(25±3)°C，30001x，光照时间12h/d的条件下培养15d即可转入生根培养基；将经过壮苗培养的组培苗转接于1/2MS+NAA0. 05mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5. 6g/L，pH值6. O的培养基上，在(25 ±3) V，2000x,光照时间12h/d的条件下培养，20d后的生根率达93. 3 %，平均生根数为3. 18 ；
将黑莓生根苗，置于室内散射光处，炼苗5d，然后打开培养瓶盖，使组培苗于室内空气接触，3d后挑选叶数为3 6个，生根数达3条以上，根系长达2. Ocm的生根苗，用水冲洗根部残留的培养基，移栽入蛭石泥炭土 珍珠岩园土= 1:1:1:2的混合基质(经过高压灭菌)中，移栽时应将组培苗的根系完全埋入基质中；浇足水后，保持温度(20 25)で，湿度70%左右，放置于阴凉处，每周浇I次透水，40d后，黑莓组培苗的移栽成活率可达93. 8%以上。
权利要求
1.一种黑莓组培苗叶片高效循环再生的方法，其特征在于包括以下步骤①大田黑莓茎段外植体的获取、消毒，②茎段不定芽的诱导发生，③不定芽的继代培养；④不定芽苗叶片的循环使用不定芽的生根诱导；⑥试管苗的炼苗、移栽。
2.权利要求I所述的步骤①，其特征在于外植体茎段的获取、消毒的方法以黑莓一年生枝条的半木质化茎段为外植体，用浓洗衣液浸泡冲洗后，在体积比为(70 75) %的酒精中浸(30 60) s,用无菌水冲洗3 5次,再用(O. I O. 2) %升萊浸泡(5 8)min。
3.权利要求I所述的步骤②，其特征在于诱导茎段产生不定芽的方法将外植体切成(I. O I. 5) Cm长的带芽茎段，接种于不定芽诱导培养基上，培养(20 40) d ;所述的诱导茎段形成不定芽的培养基为MS+6-BA(0 O. 5)mg/L+ZT (O. 5 I. 0)mg/L+蔗糖(25 30)g/L+ 琼脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2。
4.权利要求I所述的步骤③，其特征在于不定芽的继代培养的方法将步骤②诱导产生的不定芽接种在继代増殖培养基上増殖，每隔(20 30)d继代I次；所述的不定芽的继代增殖培养基为MS+6-BA(0 O. 2)mg/L+TDZ(0 O. l)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+琼脂5. 6g/L, pH 值 5. 8 6. 2。
5.权利要求I所述的步骤④，其特征在于包括以下步骤(1)组培芽苗及其叶片的选择选步骤③中继代2次以上的组培芽苗作为循环使用的叶片离体再生材料，当组培芽苗长至3叶以上时，选择最长边X最宽边为O. 5cmX O. 5cm以上的叶片，去掉边缘，剪成(O. 4 O. 8) cm X (O. 4 O. 8) cm大小的叶块；(2)诱导叶片形成愈伤组织将步骤(I)修剪好的叶片背面紧贴于培养基表面，先在温度(25±3) °C的条件下暗培养(10 15) d，当叶片边缘开始卷曲膨大产生少量愈伤颗粒时，转到光照度(1000 2000) lx、光照时间(12 14)h/d的条件下，培养(15 20) d后形成淡黄色、致密的愈伤组织；所述的诱导叶片形成愈伤的培养基为MS+TDZ(0. I I. 0)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+ 琼脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2 ;(3)诱导愈伤组织分化不定芽将步骤(2)所得愈伤组织取下，切成(O.3 O. 6)cmX (O. 3 O. 6) cm的块状，接种到愈伤组织分化培养基上，在培养室温度(25±3)で、光照度(1500 3000) lx、光照时间(12 14)h/d的条件下培养(25 35) d ;所述的愈伤组织分化的培养基为MS+6-BA (O. 5 2. 0)mg/L+TDZ (O I. 0)mg/L+IAA(0 O. 5)mg/L+ 蔗糖(25 30) g/L+ 琼脂 5. 6g/L，pH 值 5. 8 6. 2 ;(4)不定芽的继代増殖将步骤(3)获得的不定芽转接于继代增殖培养基中，在培养室温度(25±3)で、光照度(1500 3000) lx、光照时间(12 14)h/d的条件下培养(20 30) d ;所述的不定芽继代增殖培养基为MS+6-BA(0. 5 2. 0)mg/L+蔗糖(25 30) g/L+琼脂 5. 68/し？!1值5.8 6.2;(5)不定芽的壮苗培养将步骤(4)中株高大于I.5cm的不定芽转接于壮苗培养基中，在培养室温度(25±3)で、光照度(1500 3000) lx、光照时间(12 14)h/d的条件下培养(15 20) d ;所述的不定芽壮苗的培养基为MS+6-BA (O. 3 O. 5)mg/L+NAA(0. 05 O. 2)mg/L+ 鹿糖(20 25) g/L+ 琼脂 5. 6g/L, pH 值 5. 8 6. 2。
6.权利要求I所述的步骤④中愈伤组织分化所得不定芽苗的叶片离体循环再生，其特征在于选择继代2次以上的组培芽苗的叶片作为循环使用的离体再生材料。
7.权利要求I所述的步骤④中壮苗培养所得不定芽苗的叶片离体循环再生，其特征在干选择壮苗培养所得优质不定芽苗的叶片作为循环使用的离体再生材料。
8.权利要求I所述的步骤⑤，其特征在于不定芽的生根诱导将步骤④中获得的组培芽苗转接于生根培养基中，在培养室温度(25±3)°C、光照度(1500 2000) lx、光照时间(12 14)h/d的条件下培养(15 20) d ;所述的生根培养基为1/2MS+NAA(0. 03 O. I)mg/L+ 鹿糖(20 25) g/L+ 琼脂 5. 6g/L, pH 值 5. 8 6. 2。
9.权利要求I所述的步骤⑥，其特征在于生根苗的炼苗将步骤⑤获得的生根试管苗，置于室内散射光处炼苗(3 5) d，然后打开培养瓶盖，使组培苗于室内空气接触，(3 5)d后即可移栽至穴盘；生根苗的移栽将炼苗后的试管苗从培养瓶中取出，挑选叶数为3 6个，生根数达3条以上，根系长达2. Ocm的生根苗，用水冲洗根部残留的培养基，移栽入蛭石泥炭土 珍珠岩园土= I : I : I : 2的混合基质(经过高压灭菌)中，移栽时应将组培苗的根系完全埋入基质中；浇足水后，保持温度(20 25)で，湿度(70 80) %，放置于阴凉处，每周浇I次透水，(35 45) d后，黑莓组培苗的移栽成活率可达97%以上。
全文摘要
本发明涉及一种用黑莓组培苗叶片离体循环再生的方法。其特征在于以黑莓试管苗的叶片为外植体，诱导形成愈伤组织，从愈伤组织诱导分化不定芽，对不定芽进行继代增殖、壮苗培养和生根诱导，最后进行炼苗移栽。此解决方案愈伤组织诱导率达100％，分化率达64.4％以上，不定芽的增殖倍数可达5.74，生根率最高可达100％，平均生根数3.61，移栽成活率达96.9％。本发明利用取材方便和材料丰富的组培苗的叶片为外植体，建立黑莓叶片离体再生体系，同时利用不同阶段形成的不定芽苗为母本，多方位获取叶片，从而形成黑莓叶片多重循环离体再生体系，成功解决了黑莓组培苗叶片再生难的问题。
文档编号A01H4/00GK102823505SQ20121036395
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者王小敏, 胡淑英, 吴文龙, 张春红, 李维林 申请人:江苏省中国科学院植物研究所