专利名称：一种杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法
技术领域：
本发明属于杂交水稻种子测定技术领域，尤其涉及一种杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法。
背景技术：
种子是农业生产最基本的生产资料，种子活力是种子重要的质量性状，高活力种子具有明显的生长优势和生产潜力，对农业生产具有十分重要的意义。随着种子产业化和信息化的发展，种子活力快速测定在种子质量检测和种子贸易中显得越来越重要。目前种子活力的检测方法可分为幼苗生长特性测定、逆境抗性测定和生化测定三大类，其中最常用的活力测定方法有幼苗生长测定、抗冷测定、低温发芽、加速老化、种子浸出液电导率测定和ATP含量测定等。目前水稻种子活力测定最常用的方法仍然是基于发芽试验的生长测定，常用发芽率、发芽势、发芽指数等指标来评价其活力状况。但在种子发芽试验中常遇到种子因水分偏差、病菌蔓延等原因造成的烂床、霉变，从而导致发芽率不可靠的现象，并且·标准发芽试验存在手续烦，设备多，时间长等缺点。多年来，许多种子科学家都在寻找快速方法来代替发芽试验。例如，在豌豆种子活力测定中的标准化方法电导法已广泛应用于大豆、棉花、玉米等种子的活力测定。但电导法在水稻种子活力测定中因稳定性差，因此它主要作为辅助补充方法。经世界许多种子科学家用标准发芽与四唑测定的对比试验表明，四唑测定结果与标准发芽率一般很接近，但检测过程较繁琐，且需要检测者相当的经验，检测效率低。由此可见，目前的活力测定方法无法适应现代规模化的大批量种子的快速测定。氧传感技术(Q2技术)是荷兰ASTEC Global公司基于荧光猝灭原理开发的，通过测定种子萌发过程中的耗氧量来鉴定种子的质量水平。其自动化检测的特点为种子活力的快速检测提供了有效途径。但目前氧传感技术目前仅用于少数几个植物(如甜菜、番茄、辣椒、杉木、马尾松等)种子的活力检测。笔者多年的研究结果表明，氧代谢指标IMT(萌发启动时间)与杉木和马尾松种子活力相关关系不稳定，但其它指标如氧气消耗速率(OMR)与它们的活力呈正相关、与理论萌发时间(RGT)、关键氧气压力(COP)呈负相关。笔者利用氧传感技术检测引发后番茄种子的活力获得了与发芽试验一致的结果，引发后番茄种子的活力显著提高(MT、RGT值降低，OMR值增加)，与发芽试验中发芽势、发芽指数反映的结果一致。但并不是所有的氧代谢指标均能较好的反映其活力状况，一些氧代谢指标与上述植物种子活力之间的关系并不密切，氧传感检测方法的准确性还有待进一步验证。但水稻种子目前还没有专门的氧传感测定程序，且迄今未见应用氧传感技术检测杂交水稻种子活力的报道。
发明内容
针对上述问题，本发明实施例的目的在于提供一种快速、准确的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法。本发明实施例是这样实现的，一种杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，所述测定方法包括以下步骤称取琼脂，加入超纯水，配制琼脂溶液，加热至全溶，每个塑料试管加入琼脂溶液，待冷却；夹取种子，放入装有已凝固琼脂的塑料试管中，每个塑料试管中装一粒水稻种子，在托板的边缘贴上标签，标注样品及重复；待种子全部放入塑料试管后，统一盖上盖子，最后将托板按样品及重复依次摆放在Q2仪(氧传感仪)上；打开Q2的运行程序，创建新程序，对每个托板进行设置；设置运行时间、测定间隔时间、运行温度等参数信息，以及样品名称、重复编号；开始自动化测量，每次测量记录I次氧气浓度，Q2软件会根据测定的氧气浓度和时间绘制成耗氧曲线，计算氧代谢指标。进一步，所述琼脂溶液的配置方法为称取琼脂5. 0g，加入IOOOml超纯水，配制O. 4% O. 6%琼脂溶液，加热至全溶，每个塑料试管加入琼脂溶液1000 μ 1，待冷却。进一步，所述杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，根据水稻种子大小选用
I.5ml的塑料试管。进一步，所述的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法在加琼脂溶液的过程中，根据水稻种子的呼吸强度在每个塑料试管中加入琼脂溶液1000 μ I。进一步，每次程序运行16个托板，每次取4个水稻品种，每个品种设4次重复，一个托板48粒种子为一次重复。进一步，用镊子夹取种子，放入装有已凝固琼脂的塑料试管中，每个塑料试管中装一粒水稻种子，以靠近种胚部分接触琼脂面为宜。进一步，所述快速测定方法中水稻种子以O. 5%的浓度为最佳。进一步，放置在密闭试管中的杂交水稻种子在不同的光温条件下的耗氧曲线是不同的，水稻种子在20-30°C，光照或黑暗条件下均比较合适，尤以25°C黑暗条件下最适宜。进一步，检测时间的确定方法为为保证每次重复48粒种子萌发，杂交籼稻和杂交粳稻种子在密闭试管中需分别培养60h和140h ;此外，为保证耗氧曲线的完整性，每次检测间隔的时间以30min最佳。进一步，确定1.5ml试管后，还需选择试管盖的大小。试管盖除与试管匹配外，拧紧后其空间空气体积以300 μ I为宜。最后将荧光染料涂在试管盖顶端内侧，以利于仪器扫描。本发明提供了一种快速、准确的水稻种子活力测定方法，该方法将为我国水稻种子质量检测水平提升、产业化发展并加强其核心竞争力具有重要意义。此外，还可帮助我们正确掌握种子质量状况，确保安全贮藏；可以做到精确播种、节约用种；可以通过农业行政主管部门正确、合理地行使质量监督权限，扶优治劣，保证农业生产安全用种。
图I是本发明实施例提供的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法的流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。I、本发明实施例提供的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，该测定方法包括以下步骤在步骤SlOl中，称取Q2专用琼脂5.0g，加入IOOOml超纯水，配制O. 4% O. 6%琼脂溶液，放入微波炉加热至全溶，每个塑料试管(I. 5ml)加入琼脂溶液1000 μ 1，待冷却；在步骤S102中，夹取种子，放入装有已凝固琼脂的塑料试管中，每个塑料试管中装一粒水稻种子，在托板的边缘贴上标签，标注样品及重复；在步骤S103中，待种子全部放入塑料试管后，统一盖上顶端内侧涂有荧光染料的 盖子；最后将托板按样品和重复依次放在Q2仪(氧传感仪)上；在步骤S104中，打开Q2的运行程序，创建新程序，对每个托板进行设置；设置运行时间、测定间隔时间、运行温度等信息，以及样品名称、重复编号；在步骤S105中，开始自动化测量，每次测量记录I次氧气浓度，Q2软件会根据测定的氧气浓度和时间绘制成耗氧曲线，计算氧代谢指标。在步骤S106中，以下结合21个杂交籼稻品种和20个杂交粳稻品种具体的实验方法和实验结果分析对本发明作进一步的说明。2、不同检测方法的杂交水稻种子活力比较2. I试验方法2. I. I氧传感检测I、试管大小的选择用于氧传感检测的种子需在密闭的试管中进行，试管需摆放在48孔托板中。目前试管规格有O. 5ml、l. 5ml,2. Oml等3种。根据水稻种子的实际大小，虽均可摆放在3中试管中，但I. 5ml试管大小适中,最适合水稻种子的检测。2、试管盖大小的选择和填涂荧光染料部位的确定确定I. 5ml试管后，还需选择试管盖的大小。试管盖除与试管匹配外，拧紧后其空间空气体积以300 μ I为宜。最后将荧光染料涂在试管盖顶端内侧，以利于仪器扫描。3、配备琼脂溶液琼脂溶液作为种子的吸水介质，可以提供种子萌发过程中所需的水分，同时凝固后可以支撑种子作为发芽基质。琼脂溶液浓度一般为O. 4% O. 6%，不同植物种子适宜浓度不同，水稻种子以O. 5%的浓度为最佳。称取琼脂5. 0g，加水1000ml，放入微波炉加热至全溶。4、管内空间大小的确定不同植物的种子，萌发过程中的耗氧量存在明显差异。因此，除考虑种子的大小夕卜，还需考虑种子的呼吸强度。对于呼吸旺盛的种子，密闭试管内的空间要大；呼吸强度不大的种子，密闭试管内的空间要小；密闭试管内合适的空间大小可以保证密闭试管内的氧气在种子萌发后刚好被消耗殆尽，种子耗氧曲线具备典型的反“S”型消耗型，从而保证分析的结果更可靠。在试验过程中，我们可以通过控制加入试管中琼脂溶液的量来调整密闭试管中残留空气的体积。水稻种子大小适中,耗氧量适中,在I. 5ml试管中加入900-1100 μ I琼脂溶液比较适宜，尤以ΙΟΟΟμ I最适宜。这样保证拧紧试管盖后空管内残留空气的体积在800 μ I为宜。5、种子的摆放由于每次程序运行16托板，每次取4个水稻品种，每个品种设4次重复，一个托板为I次重复，即48粒种子为I次重复。用镊子夹取种子，放入装有已凝固琼脂的塑料试管中，每个塑料试管中装一粒水稻种子，以靠近种胚部分接触琼脂面为宜。在托板的边缘贴上标签，标注样品及重复。待种子全部放入塑料试管后，统一盖上顶端内侧涂有荧光染料的盖子。最后将托板按品种和重复依次摆放在Q2仪(氧传感仪，荷兰ASTEC Global公司提供)上。6、发芽条件的确定
放置在密闭试管中的杂交水稻种子在不同的光温条件下的耗氧曲线是不同的。水稻种子在20-30°C，光照或黑暗条件下均比较合适，尤以25°C黑暗条件下最适宜。7、检测时间的确定籼型水稻和粳型水稻种子的呼吸强度不一，因此完成萌发的时间有别。为保证每次重复48粒种子萌发，杂交籼稻和杂交粳稻种子在密闭试管中需分别培养60h和140h。此外，为保证耗氧曲线的完整性，每次检测间隔的时间以30min最佳。8、试验正负对照的确定为保证试验的对比性，需设置正负对照。我们在Q2仪的正负对照孔中分别放置空管作为正对照，放置加Na2S03过饱和溶液的试管作为负对照。9、程序设置、运行与数据分析打开Q2的运行程序，创建新程序，设置不同杂交稻类型对每个托板进行参数设置；设置试管总体积、琼脂浓度及体积、管内残留空气的体积、运行时间、每次测定间隔时间、运行温度等参数信息，以及样品名称，重复编号(A、B、C、D)。启动运行按钮，开始自动化测量，每次测量记录I次氧气浓度，Q2软件会根据测定的氧气浓度和运行时间绘制成耗氧曲线。然后通过软件分析试管中氧气浓度随时间变化的曲线，得到几个曲线的特征指标，即氧代谢指标。萌发启动时间IMT(increased metabolism time)表示氧气消耗速率从开始的缓慢速度开始增加的时间，这个指标反映了种子吸胀萌动至胚根突破种皮的快慢。氧气消耗速率OMR(oxygen metabolism rate)是种子胚根突破种皮后到受低氧胁迫氧气消耗速率变慢之间的呼吸速率，反映了种子萌发过程的代谢活动强弱。关键氧气压力C0P(criticaloxygen pressure)是呼吸速率开始减速时氧气百分比浓度,反应了种子耐低氧胁迫萌发的能力。理论萌发时间RGT(relativegermination time)为假设在非低氧胁迫条件下氧气消耗到零时推断的发芽时间，与种子的实际发芽时间直接相关。理论萌发率RGR(relativegerminationrate)是与理论萌发时间相对应的推断出来的发芽率，与种子的实际发芽率直接相关。一般来说，OMR、RGR与种子活力呈正相关，MT、COP、RGT与种子活力呈负相关。2. I. 2发芽检测I、发芽方法发芽试验按国家种子质量检验标准(GB/T3543. 4-1995)进行。种子以100粒为一重复，试验为4次重复，种子在发芽床上的分布要均匀，粒与粒之间保持一定距离，既防止发霉种子的相互感染，又能保证正常种子足够的生长空间。纸床充分吸足水分后浙去多余水分，防止水分过多，增加种子霉烂和病菌感染的几率。在发芽盒的侧面贴上标签，注明样品名称和重复序号及置床日期。将发芽盒盖好，放入30°C恒温箱内培养14d。种子开始发芽后，每天统计发芽种子数。即从第2d开始计数，计数时把发芽合格的种子从发芽床中拣出，记录每天每盒拣出数，即为当天发芽种子数。2、结果计算根据以上数据，分别计算与种子活力相关的发芽测定指标。发芽率是检测种子质量的重要指标之一，农业生产上常常依此来计算用种量，发芽率用每天正常发芽种子总数占检测种子总数的百分比来表示。发芽势为种子发芽速度和整齐度，是水稻种子活力测定的重要指标，计算从发芽开始到第5d发芽高峰时段内正常发芽种子数占检测种子总数的百分比。发芽指数是每天正常发芽种子数除以当天天数之商的累加值，反映了种子的发芽速度，比发芽势更能体现种子的活力状况。·
2. 2结果分析2. 2. I不同检测方法的杂交籼稻种子质量的比较由表I的方差分析结果可以看出，杂交籼稻中，MT值表现活力较强的是籼优64、协优413、中优208、中优205、内5优8015、II优7954、株两优609、株两优06、钱优0506等品种，活力较差的是汕优48-2等品种；0MR值表现活力较强的是钱优0506、株两优06、II优7954等品种，活力较差的是汕优48-2等品种；C0P值表现活力较强的是株两优609、浙辐两优12等品种，活力较差的是钱优0506、II优7954、中优208、中优205、新两优6号、协优413、籼优64等品种；RGT值表现活力较强的是钱优0506、株两优06、II优7954、内5优8015、浙辐两优12、Y两优689、钱优I号、中优205、中优208、新两优6号、协优413、中浙优8号、II优1259、丰两优I号、协优982等品种，活力较差的是汕优48_2等品种；RGR值表现活力较高的是钱优0506、株两优06、株两优609、内5优8015、II优7954、浙辐两优12、Y两优689、钱优I号、中优205、中优208、新两优6号、协优413、C两优87、中浙优8号、II优1259、籼优64、协优982等品种，活力较差的是汕优48-2、两优培九、丰两优香I号等品种。综上各项氧代谢指标，杂交籼稻种子活力较高为钱优0506、株两优06、株两优609、II优7954、浙辐两优12等品种,而活力较差的是汕优48-2、两优培九、丰两优香I号、C两优87等品种，其他品种种子活力中等。表I杂交籼稻种子氧代谢指标的比较
权利要求
1.一种杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，其特征在于，所述测定方法包括以下步骤 称取琼脂，加入超纯水，配制琼脂溶液，加热至全溶，每个塑料试管加入琼脂溶液，待冷却； 夹取种子，放入装有已凝固琼脂的塑料试管中，每个塑料试管中装一粒水稻种子，在托板的边缘贴上标签，标注样品及重复； 待种子全部放入塑料试管后，统一盖上盖子，最后将托板按样品及重复依次摆放在Q2仪(氧传感仪)上； 打开Q2的运行程序，创建新程序，对每个托板进行设置；设置运行时间、测定间隔时间、运行温度等参数信息，以及样品名称、重复编号； 开始自动化测量，每次测量记录I次氧气浓度，Q2软件会根据测定的氧气浓度和时间绘制成耗氧曲线，计算氧代谢指标。
2.如权利要求I所述的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，其特征在于，所述琼脂溶液的配置方法为 称取琼脂5. Og，加入IOOOml超纯水，配制O. 4% O. 6%琼脂溶液，加热至全溶，每个塑料试管加入琼脂溶液1000 μ 1，待冷却。
3.如权利要求I所述的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，其特征在于，所述杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，根据水稻种子大小选用1.5ml的塑料试管。
4.如权利要求I所述的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，其特征在于，所述的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法在加琼脂溶液的过程中，根据水稻种子的呼吸强度在每个塑料试管中加入琼脂溶液1000 μ I。
5.如权利要求I所述的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，其特征在于，每次程序运行16个托板，每次取4个水稻品种，每个品种设4次重复，一个托板48粒种子为一次重复。
6.如权利要求I所述的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，其特征在于，用镊子夹取种子，放入装有已凝固琼脂的塑料试管中，每个塑料试管中装一粒水稻种子，以靠近种胚部分接触琼脂面为宜。
7.如权利要求I所述的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，其特征在于，所述快速测定方法中水稻种子以O. 5%的浓度为最佳。
8.如权利要求I所述的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，其特征在于，放置在密闭试管中的杂交水稻种子在不同的光温条件下的耗氧曲线是不同的，水稻种子在20-30 0C，光照或黑暗条件下均比较合适，尤以25 °C黑暗条件下最适宜。
9.如权利要求I所述的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，其特征在于，检测时间的确定方法为 为保证每次重复48粒种子萌发，杂交籼稻和杂交粳稻种子在密闭试管中需分别培养60h和140h ;此外，为保证耗氧曲线的完整性，每次检测间隔的时间以30min最佳。
10.如权利要求I所述的杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，其特征在于，确定I.5ml试管后，还需选择试管盖的大小。试管盖除与试管匹配外，拧紧后其空间空气体积以300μ I为宜。最后将荧光染料涂在试管盖顶端内侧，以利于仪器扫描。
全文摘要
本发明公开了一种杂交水稻种子活力氧传感快速测定方法，称取琼脂，加水，配制琼脂溶液，加热至全溶，每个试管加入琼脂溶液，待冷却；夹取种子，放入装有已凝固琼脂的塑料试管中，拧紧涂有荧光染料的试管盖；将托板按样品及重复依次放在Q2仪上；创建新程序，对每个托板进行参数设置；设置试管总体积、琼脂浓度及体积、管内残留空气的体积、运行时间、每次测定间隔时间、运行温度等信息，开始自动测量，绘制耗氧曲线，计算氧代谢指标。该方法对我国水稻种子质量检测水平提升、产业化发展具有重要意义；还可帮助我们快速掌握种子质量状况，确保安全贮藏和农业生产安全用种；在种子处理方法选择中，对处理后种子的活力状况进行快速评判。
文档编号A01C1/02GK102870526SQ20121039401
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月8日 优先权日2012年10月8日
发明者赵光武, 羊敏杰 申请人:浙江农林大学