专利名称：一种生物农药和昆虫防治方法
技术领域：
本发明涉及化学合成及修饰的小分子干扰RNA领域，具体地，是涉及一种生物农药和昆虫防治方法。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指外源或内源的双链RNA(dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象，它是进化上高度保守且在生物界普遍存在的一种基因调控机制。1998年在线虫Caenorhabditis elegans中首次发现了这种现象，随后在真菌、植物、昆虫和动物中也发现了这种现象。RNAi的作用机制是体外导入的或内源性转录生成的长链dsRNA 被 Dicer 家族 RNase-III 切割成 21_25nt(喊基)的 siRNA, siRNA 进一步与 Argonaute蛋白结合形成RISC(RNA-induced silencing complex),最后由RISC介导siRNA反义链与靶mRNA分子互补结合引起同源靶mRNA分子的特异性降解。近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一,并名列2002年十大科学进展之首。以特异性副除或关闭昆虫特定基因的表达为基本思路，探索害虫防治的新策略，有望成了新型生物农药创制的热门技术。线虫在摄入或局部注射dsRNA后，其RNAi效应能传遍整个有机体甚至是传递到后代，此被定义为系统性RNAi。昆虫必须具有体内传播RNAi效应的机制，才能有望实现以siRNA为主效因子的生物农药防治策略。昆虫系统性RNAi效应首次在赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)中发现，此虫幼虫期注射Tc-ASH基因的dsRNA,在成虫期表现出缺失鬃的显型(Tomoyasu Y, Denell RE. Larval RNAi in Tribolium(Coleoptera)for analyzing adult development. Dev Genes Evol. 2004, 214:575-578),并且此昆虫Distalless等基因的RNAi效应会从亲代传递至子代(Bucher G. Parental RNAi inTribolium(Coleoptera)-Curr Biol, 2002，12:R85_R86)。目前，系统性 RNAi 效应已存在如下昆虫中得已验证双翅目昆虫采采蝇；鞘翅目昆虫赤拟谷盗；膜翅目昆虫蜜蜂；直翅目昆虫蝗虫；蜚蠊目昆虫德国小蠊；鳞翅目昆虫斜纹夜蛾、小菜蛾、甜菜夜蛾、浅棕苹果蛾；半翅目昆虫豌豆蚜。系统性RNAi效应在昆虫中的广泛性，表明siRNA在害虫防治方面具有广泛的应用潜力。鳞翅目(L印idoptera)昆虫纲中第二大目。完全变态。幼虫一般称为毛虫，亦称“蛄撕”。蛹为被蛹。成虫称蛾或蝶，其翅和体上密被鳞片，故名。具吸收口器，形成长形而能卷起的喙；复眼大；触角变化多，呈丝状、羽状或栉状等。全世界已知有十四万种左右，我国已有记载的约两万种。大多数种类与国民经济有重大关系，如螟虫、粘虫、松毛虫和菜粉蝶、小菜蛾等，为农林植物的重要害虫；家蚕、柞蚕和蓖麻蚕等，是著名的资源昆虫。
据最近几年的相关报道，昆虫通过饲喂表达dsRNA的植物或菌株，能有效的阻断昆虫目标基因的表达。毛颖波等(2007)通过转基因手段，让植物自身产生P450基因的dsRNA。然后,将植物喂食棉铃虫(Helicoverpa armigera)。dsRNA从食道进入细胞,抑制棉铃虫体内P450基因的表达，致使棉铃虫 对棉子酚的抗性降低。最后，对棉铃虫造成致命的影响。玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera Leconte)饲喂含有 V-ATPaseA等基因的dsRNA植物饲料，幼虫出现滞育或死亡，显著降低了此虫对玉米根部的危害。田宏刚等(2009)利用具有双17启动子的载体L4440和RNase III缺失的HT115(DE3)菌株，构建了诱导表达能产生seCHSA基因dsRNA的工程菌株，饲喂甜菜夜蛾，导致个别虫体出现畸形或死亡。RNA干扰技术已应用于小菜蛾功能基因的研究。如Z.-X. Yang等用微注射的方法导入cadherin基因的dsRNA，导致该虫的死亡率和性别比率增加，并且幼虫期出现滞育现象。通过饲喂的方法，导入小菜蛾细胞色素P450 (CYP6BG1)基因的dsRNA，致使该虫对除虫菊脂类农药的抗性降低(Ma, A. M. B. , Tadashi, M. , Ken M. , Toshiharu, T.RNAinterference-mediated knockdown of a cytochrome P450,CYP6BG1, from thediamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin.Insect. 2009. Biochem. Mol. Biol. 39:38 - 46.)。据此，我们认为小菜蛾具有系统性RNA干扰的能力，有可能实现以RNA干扰技术为手段的防治策略。虽然目前的研究开启了 RNAi技术在害虫防治方面应用的新一页，但其中基因特异dsRNA仅来自于转基因植物或是工程菌株，抑或是体外转录生成。目前制约利用RNAi技术生产新型生物农药的重大共性和关键技术是一、现有利用转基因技术转入作物体系防治害虫的技术体系和策略存在转基因植物食品安全性问题；二、表达dsRNA的工程菌株见效慢、防效低，且环境适应性难以评估；三、dsRNA的体外转录合成成本高、稳定性不好等。这些问题极大的限制了该技术在害虫防治领域的广泛应用。
发明内容
为克服以上的缺点，本发明提供一种新的昆虫防治方法。具体技术方案如下一种昆虫防治方法，主要包括将针对鳞翅目昆虫特定靶标基因的SiRNA喂食鳞翅目昆虫，所述siRNA为体外化学合成17-50nt的双链RNA，所述靶标基因为Y -氨基丁酸受体基因、或为Y-氨基丁酸受体基因和乙酰胆碱酯酶基因和、或为Y-氨基丁酸受体基因和线粒体复合物III Fe-S亚基基因、或为Y -氨基丁酸受体基因和线粒体复合物III Fe-S亚基基因以及乙酰胆碱酯酶基因。更优选地，将上述siRNA直接喷雾在鳞翅目昆虫食用的农作物的叶片上，让昆虫自然取食。本发明所述的昆虫防治方法，通过体外化学合成17-50nt双链RNA (siRNA)的方法，还可通过化学修饰以及与阳离子聚合物配伍增强了 siRNA的稳定性和药效，通过自然饲喂或喷雾含有特定靶标基因siRNA的饲料来有效的阻断昆虫靶基因mRNA的表达，对昆虫造成致命影响。该方法制备以siRNA为主效因子的生物农药，具有周期短、见效快、无毒、无环境污染等优点，可以广泛地使用。
本发明的另一目的是提供一种生物农药。一种生物农药，以针对鳞翅目昆虫特定靶标基因的siRNA为有效成份，所述siRNA为体外化学合成17_50nt的双链RNA。优选地，所述生物农药还包括有阳离子聚合物为有效成份，更优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸或明胶。优选地，所述siRNA经化学修饰或siRNA3’末端还设有以两个脱氧核苷的组合的悬挂碱基，所述化学修饰为2’ -甲基化，氟代，5’ -PEG，胆固醇，或多肽等。优选地，所述siRNA包括有针对Y -氨基丁酸受体基因的siRNA为SEQ ID NO. 19和 SEQID NO. 20,SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24 中的一对
或多对。更优选地，所述siRNA为还包括有针对线粒体复合物III Fe-S亚基基因的siRNA为SEQ IDN0.1 及 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 及 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 中的一对或多对；和/或针对乙酰胆碱酯酶基因的siRNA为SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8、SEQIDN0.9 及 SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18 中的一对或多对。优选地，所述鳞翅目昆虫为小菜蛾。本发明对昆虫直接饲喂含有特定靶标基因的siRNA，导致昆虫该基因mRNA水平或蛋白质水平的变化，通过该方法对昆虫对应的某一特定基因的表达进行抑制。由于采用化学合成的方法制备17-50nt siRNA，生产快捷，并可以通过化学修饰和与阳离子聚合物配伍增强siRNA的稳定性和效果，方法简便；由于把所生产的siRNA直接喷雾在叶片上，让昆虫自然取食即可，操作简单，实现了真正意义上的农药施药方式，可以广泛地推广。因此，采用本方法抑制昆虫基因的表达，可以为害虫防治提供新的方法。进一步通过盆栽实验结果，显示这是一类高效的生物杀虫剂。
图I :为实施例I中饲喂siRNA的小菜蛾幼虫表现出死亡结果示意图；图2 :为实施例I中的qRT-PCR结果示意图；图3 :为实施例I中western blot结果示意图；图4 :为实例I中的ATP测定结果示意图；图5 :为实施例3中施药后第5天的防治效果比较示意图；图6 :实施例5中小菜蛾表现出脱皮未尽的症状示意图。
具体实施例方式本发明所述生物农药中的siRNA的浓度通常大于lppm，优选大于lOppm，更优选为50ppm-500ppm。本领域的技术人员也可根据常识，按照实际需要，配比成合适的浓度，以及选择合适的施药时的叶面浓度，通常，浓度越大，效果越好。阳离子聚合物的浓度和siRNA一样，可以根据实际需要，配比成合适的浓度，通常可大于lOppm。优选地，在所述生物农药中N (阳离子聚合物)P (siRNA)的比为I :1-100 :1。具体无需赘述。
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定。实施例一本实例特别提供了小菜蛾线粒体复合物III IFe-S亚基基因的siRNA，通过自然饲喂此靶标基因siRNA后对鳞翅目昆虫如小菜蛾造成了致命的影响。本实例是用于防治鳞翅目昆虫小菜蛾(Plutella xylostella)的方法。通过喂食含有沉默线粒体复合物III Fe-S亚基基因(GeneBank登录号为EU815629)的siRNA，从而阻断昆虫线粒体电子传递，抑制昆虫ATP的形成，进而实现了对昆虫的有效治理。线粒体复合物III又称泛醌细胞色素C还原酶(Ubiquinol-cytochrome creductase),由9_11个亚基组成,包括两个细胞色素b(b562和b566)、一个细胞色素Cl和一个Fe-S蛋白。其中Fe-S蛋白亚基负责将一个电子从还原型辅酶Q传递给细胞色素Cl，并将一个质子释放到膜间隙，以此产生膜电位用于ATP的形成(Trumpower B L. Cytochrome bclcomplexes ofmicroorganisms. Microbiological reviews, 1990，54:101-29)。本实施例的生物学原理就是通过沉默昆虫线粒体复合物III Fe-S亚基基因mRNA，进而阻断昆虫线粒体电子传递，抑制ATP的形成，从而来达到害虫防治的目的。将化学合成的siRNA用DEPC稀释后均匀涂布于甘蓝叶面，通过对昆虫幼虫进行自然饲喂涂有针对线粒体复合物III Fe-S亚基基因siRNA的甘蓝叶片，从而在阻断昆虫特定基因如小菜蛾线粒体复合物III Fe-S亚基基因的表达，来实现对该昆虫的有效治理。此干扰效果可通过检测昆虫mRNA或蛋白水平的改变来确定，如可通过检测小菜蛾线粒体复合物III IFe-S亚基mRNA表达情况和其蛋白表达情况，抑或是小菜蛾幼虫ATP的合成情况，来确定干扰效果。如实验表明，小菜蛾取食其线粒体复合物III Fe-S亚基的siRNA后，该基因mRNA和蛋白表达水平降低，表现出电子传递受阻，最终因无法正常合成ATP而死亡。所述方法主要包括以下步骤(一)昆虫特定功能基因的选择考虑到昆虫复合物III Fe-S亚基基因在线粒体电子传递中的关键作用，因此本发明选择该特定功能的基因为沉默对象，其基因序列参见GeneBank登录号为EU815629。(二)小菜蛾线粒体复合物III Fe-S亚基基因siRNA的设计和合成Si-UQCR_001 GCAAGTCCGTCACCTTCAA (19nt)正义链(5，-3，)5'GCAAGUCCGUCACCUUCAA dTdT 3’SEQ ID NO. I反义链(3，-5，)3’dTdT CGUUCAGGCAGUGGAAGUU 5’SEQ ID NO. 2、Si-UQCR_002 CATCCAGTGTAGTGAGCAA (19nt)正义链(5，-3，)5’CAUCCAGUGUAGUGAGCAAdTdT 3’SEQ ID NO. 3反义链(3，-5，)3’dTdT GUAGGUCACAUCACUCGUU 5’SEQ ID NO. 4Si-UQCR_003 CAACAACCTCTGAGAAGTT (19nt)正义链(5，-3，)5，CAACAACCUCUGAGAAGUUdTdT 3，SEQ ID NO. 5反义链(3，-5，)3’dTdT GUUGUUGGAGACUCUUCAA 5’SEQ ID NO. 6上述SEQ ID NOl — 6的siRNA的3’末端设有两个TT的悬挂碱基。以上述每对siRNA做为有效成份，DEPC水稀释，制备成所述生物农药。(三)将上述以siRNA为活性成份的生物农药均匀涂布于甘蓝叶片并喂食小菜蛾二龄幼虫将siRNA用DEPC (diethypyrocarbonate)水稀释成浓度为IOOppm的溶液(生物农药)，然后均匀涂布于甘蓝叶片上，叶面浓度为3. Oii g/cm2，将该叶片喂食二龄小菜蛾。每对siRNA处理30头虫，设3个重复，并用DEPC水作为阴性对照组。之后，于12h、24h、36h、48h、60h、72h分别调查虫子的死亡数，计算死亡率。(四)用荧光定量PCR的方法检测昆虫体内ISP基因mRNA的沉默水平待调查完虫子的死亡数，便收集表现出显形症状的昆虫，如表现出死亡性状的个体，提取总RNA，反转成第一链cDNA，用于qRT-PCR的模板。之后用荧光定量PCR仪配套软件计算出相对表达值。荧光定量PCR引物EU815629_FP GTTGTGAGGTCAGGGCATTT SEQ ID NO. 31EU815629_RP GGAGAGGCTGAGACACCAAC SEQ ID NO. 32(五)用WB检测饲喂了siRNA的昆虫体内目的蛋白的表达待昆虫饲喂特定的siRNA，如Si-UQCR_003 (SEQ ID NO 5 和 6) siRNA 后，在 12h，24h，48h，72h 收集表现出显性症状的个体，提取总蛋白，用BCA法测定每个样品的蛋白浓度，在调整上样总蛋白量一致的情况下，用15%SDS-PAGE凝胶电泳分离各样品的总蛋白，之后，经一抗、二抗孵育后，曝光显影，得到如图3结果。(六)饲喂了siRNA的昆虫体内ATP量的检测待昆虫饲喂特定的的siRNA，如51-即0 _0038丨1 應后，在611，1211，2411，3611，4811，7211收集活体昆虫样品，并同时收集饲喂了DEPC水的活体昆虫样品，之后用碧云天公司生产ATP检测试剂盒(产品编号S0026)测定其ATP的含量。通过本实验发现，经过自然饲喂涂有选定基因的SiRNA叶片后，昆虫体内的线粒体复合物III Fe-S亚基基因的表达沉默，目的基因mRNA表达水平降低，同时蛋白表达水平也受到抑制，进而阻断昆虫电子传递，抑制ATP的形成，从而导致昆虫个体显著死亡。表I :饲喂涂有含ISP基因siRNA的生物农药甘蓝叶片后对小菜蛾死亡率的对比统计
权利要求
1.一种生物农药，其特征是，以针对鳞翅目昆虫靶标基因的siRNA为有效成份，所述siRNA为体外化学合成17-50nt的双链RNA,所述祀标基因为Y -氨基丁酸受体基因、或为Y-氨基丁酸受体基因和乙酰胆碱酯酶基因和、或为Y -氨基丁酸受体基因和线粒体复合物III Fe-S亚基基因、或为Y -氨基丁酸受体基因和线粒体复合物III Fe-S亚基基因以及乙酰胆碱酯酶基因。
2.根据权利要求I所述的生物农药，其特征是，还包括有阳离子聚合物为有效成份。
3.根据权利要求2所述的生物农药，其特征是，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸或明胶。
4.根据权利要求I一 3任一项所述的生物农药，其特征是，所述siRNA经化学修饰或siRNA3’末端还设有以两个脱氧核苷的组合的悬挂碱基。
5.根据权利要求I一 3任一项所述的生物农药，其特征是，针对线粒体复合物III IFe-S亚基基因的 siRNA 为 SEQ ID NO. I 及 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 及 SEQ IDNO. 4、SEQ IDNO. 5和SEQ ID NO. 6中的一对或多对；针对乙酰胆碱酯酶基因的siRNA为SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10,SEQID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18 中的一对或多对；针对Y-氨基丁酸受体基因的siRNA为SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20、SEQ IDNO. 21 和 SEQID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24 中的一对或多对。
6.根据权利要求I一 3任一项所述的生物农药，其特征是，所述鳞翅目昆虫为小菜蛾。
7.—种昆虫防治方法，其特征是，将权利要求I 一 6任一项所述的生物农药喂食鳞翅目昆虫。
8.根据权利要求7所述的昆虫防治方法，其特征是，所述喂食方式为将所述生物农药直接喷雾在鳞翅目昆虫食用的农作物的叶片上，让昆虫自然取食，所述siRNA的叶面浓度大于 0. I u g/cm2。
9.一种用于制备针对鳞翅目昆虫的生物农药的siRNA，其特征是，所述siRNA包括有针对Y -氨基丁酸受体基因的siRNA为SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20、SEQID NO. 21和SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24 中的一对或多对。
10.根据权利要求9所述的用于制备针对鳞翅目昆虫的生物农药的siRNA，其特征是，所述siRNA还包括有针对线粒体复合物III Fe-S亚基基因的siRNA为SEQ IDNO. I及SEQ IDNO. 2、SEQ ID NO. 3 及 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ IDNO. 6 中的一对或多对，和 / 或针对乙酰胆碱酯酶基因的siRNA为SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9及SEQ IDNO. 10、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ IDNO. 18 中的一对或多对。
全文摘要
本发明提供了一种昆虫防治方法，该方法为将针对鳞翅目昆虫特定基因的siRNA与阳离子聚合物配伍喂食鳞翅目昆虫，所述siRNA为体外化学合成17-50nt的双链RNA，阳离子聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖、聚赖氨酸和明胶。本发明还涉及了一种生物农药，该农药以针对鳞翅目昆虫特定基因的siRNA为有效成。本发明涉及通过饲喂含有昆虫特异基因如干扰昆虫线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因、乙酰胆碱酯酶基因、γ-氨基丁酸受体基因等的siRNA对鳞翅目昆虫的基因表达进行抑制，从而干扰昆虫正常的生长发育，进而实现对昆虫的有效治理；进一步通过盆栽实验结果，显示这是一类高效的生物杀虫剂。
文档编号A01N57/16GK102960363SQ20121040880
公开日2013年3月13日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者张必良, 龚亮, 胡美英 申请人:广州市锐博生物科技有限公司