专利名称：蝴蝶兰防褐变专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种防止蝴蝶兰组织培养过程中褐变的培养基。技术背景
蝴蝶兰[phalaenopsis ]为兰科蝴蝶兰属植物，它是一种热带气生兰，俗称“洋兰”。蝴蝶兰花型似蝴蝶，形态美妙、色彩丰富、花期长，在热带兰中素有“兰花皇后”美称。 蝴蝶兰种类丰富，分布广，东起菲律宾、新几内亚，南达澳大利亚北部，西苏门答腊，北到我国台湾、云南、四川西部均有原种(野生蝴蝶兰)存在，约有50多种，其中我国有7种，全部为附生兰。蝴蝶兰商品化大规模栽培十分成功，是近年来国际花卉市场上最受欢迎的洋兰。
由于蝴蝶兰是单茎性气生兰，植株很少发育侧枝，很难采用常规分株方式进行无性繁殖。其种子也不含胚乳或其他组织，在自然条件下萌发率极低，因此无法利用播种方式进行有性繁殖。而采用组织培养方法进行种苗繁殖是目前蝴蝶兰大规模生产的唯一途径。蝴蝶兰快速繁殖的途径主要是利用无菌播种和利用各种类型的外植体诱导类原球茎， 进而诱导分生苗实现快繁，不用通过诱导愈伤组织而直接分化丛生芽。其中，类原球茎是一类呈珠粒状的幼嫩器官(种子萌发时先是胚的膨大，种皮破裂，一定时间后发育成肉眼可见浅黄色的原胚呈球状，称为原球茎，由其它外植体诱导产生的称类原球茎)。
蝴蝶兰和其他兰科植物一样，在组培快繁生产中存在着易褐化死亡的问题，因此如何克服褐变成了组培快繁生产成功与否的关键。在目前的研究和生产中，对于如何预防蝴蝶兰组培过程中的褐变已经有了较多的研究和应用。
赵滢等在《蝴蝶兰组织培养中褐变发生及控制的研究进展》(北方园艺，2009 (11) 110 114)中对蝴蝶兰组织培养中褐变的机理进行了解析外植体组织被切割和接种时， 酚、酶的区域化分布被打破，在有氧条件下，释放或合成的酚氧 化酶将组织切口表面的酚类物质氧化成醌，这些褐色或黑色物质逐渐扩散到整个培养基中抑制了其它酶的活性，毒害整个外植体组织。通过对蝴蝶兰褐变外植体的显微结构观察发现褐变叶片外植体的上表皮已变形，维管束完全破坏，被有毒的鞣质填充，有些薄壁细胞中发现有不明物质沉积。因此，褐变发生的关键原因在于细胞膜完整性被破坏。
同时，本人还对蝴蝶兰组织培养中褐变的控制提出了几种措施，包括选择合适的外植体、控制光照温度等培养条件、连续转移外植体等控制条件，另外还包括优化培养基 (MS纸桥培养基)及加入抗褐剂(吸附剂和抗氧化剂)。并有研究表明，在培养基中加入吸附剂活性炭2 g/L，或PVP I g/L，蝴蝶兰褐变控制效果显著；抗氧化剂谷胱甘肽控制褐变效果虽不及活性炭，但综合效果最佳。
中国发明专利(申请号201010190129. 5)公开了一种蝴蝶兰培养基，主要包括大量化合物类、微量化合物类、有机元素类、激素类、添加物，所述大量化合物类主要包括无水氯化钙、硝酸氨等，其中每一种物质的浓度均为20 1700mg/L;所述微量化合物类主要包括硫酸锰、硫酸锌等，其中每一种物质的浓度均为O. 01 20mg/L;所述有机元素类主要包括维生素B1、烟酸等，其中每一种物质的浓度均为O. 05 200mg/L;所述激素类为O. 05 lmg/L的萘乙酸；所属添加物主要包括马铃薯、香蕉等，其中每一种物质的浓度均为I 60g/L;其余为水。本发明通过调节添加物的种类及加入量，使培养基营养更全面，可很好的促进蝴蝶兰壮苗生根，减少翘根和褐变，提高种苗的质量。但其中没有专门针对控制褐变的措施和组分。
王栋等在《植物组织培养中的褐化现象及其防止措施》(黑龙江农业科学2008(1)7 10)中分析了植物组织培养过程中出现褐变的若干因素，并公开了利用吸附剂(有聚乙烯吡咯烷酮、活性炭等)和抗氧化剂(抗坏血酸、硫代硫酸钠、柠檬酸、L 一半胱氨酸、谷胱甘肽、芸香苷、二硫苏糖醇、酪氨酸、巯基乙醇、卵清蛋白、维生素B、维生素E、有机酸、蛋白质水解产物、氨基酸、亚硫氢酸钠、氰化钾、多胺)等用来减少植物组织培养中的褐变现象。其主要原理在于通过吸附组织培养过程中由于切割造成机械损伤处分泌的酚类化合物，或者通过上述抗氧化剂防止扩散到培养基中的酚类化合物被氧化成褐色的醌类物质，从而达到防止褐变的作用。但是，这种方法的不足之处在于只能被动解决扩散到培养基质中的酚类化合物，在实际生产过程中还是会存在较高的褐变现象。发明内容
本发明的目的在于提供一种相对于现有防褐变技术能更有效预防蝴蝶兰组织培养过程中发生褐变的专用培养基。
本发明的技术方案是一种能有效预防蝴蝶兰组织培养过程中发生褐变的专用培养基，以含有2. 5 mg/L的苄氨基腺嘌呤(BA)和O. 2mg/L萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基为基本培养基，并添加浓度为5-15 mg/L的抗坏血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素内酯 (BR)。
上述的蝴蝶兰防褐变专用培养基，抗坏血酸(VC)的浓度为8-12 mg/L，油菜素内酯 (BR)的浓度为 O. 05-0. 3 mg/L。
上述的蝴蝶兰防褐变专用培养基，其中的抗坏血酸(VC)的浓度为10 mg/L，油菜素内酯(BR)的浓度为O.1 mg/L。
上述的蝴蝶兰防褐变专用培养基中O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)可以用O. 2mg/ L的吲哚乙酸(IAA)来代替。
上述的蝴蝶兰防褐变专用培养基的pH保持在5. 4-5. 6。
本发明的有益效果在于利用本发明提供的培养基，即以含有2. 5 mg/L的苄氨基腺嘌呤(BA)和O. 2mg/L萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基为基本培养基，再添加浓度为5_15 mg/L的抗坏血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素内酯而组成的培养基，在进行诱导培育过程中，其中的抗坏血酸和油菜素内酯可以发挥防褐变方面的协同作用，一方面通过发挥抗坏血酸对渗入到培养基中酚类物质的抗氧化作用体现直接还原作用，另一方面油菜素内酯在外植体内部能增强蝴蝶兰组织内部抗氧化酶的活性，减少褐变根本因素醌类物质的产生和扩展；两者的结合能有效防止蝴蝶兰诱导培养中褐变现象的产生，将褐变率从常规的 30%以上降低到20%以下。
具体实施方式
实施例取已过盛花期带休眠芽的花梗作为外植体材料，切下其带芽茎段，长约2 - 3cm，用自来水清洗干净，在饱和漂白粉上清液中浸泡15 min，浸泡时不断搅动，浸泡后的茎段用流水冲洗干净，置于超净工作台上，先用75 %的酒精消毒30 s，无菌水清洗I次，再用O.1 %的升汞浸泡10 min，经无菌水冲洗数次，将带芽茎段接种到经设计的不同激素组合的诱导培养基上，重复3次。
诱导培养基为1/2 MS +BA 2.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L作为基础培养基，并添加浓度为5-15 mg/L的抗坏血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素内酯(BR)，其中pH值调节到 5. 4-5. 6。
在MS培养基中添加不同浓度激素和配方组成的蝴蝶兰防褐变专用培养基，在培养条件每天光照12 h，光强I 600Lx，温度25 ±2 °C下诱导培养效果如下表所示
权利要求
1.一种蝴蝶兰防褐变专用培养基，以含有2. 5 mg/L的苄氨基腺嘌呤(BA)和O. 2mg/L 萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基为基本培养基，其特征在于还含有浓度为5 15 mg/L的抗坏血酸(VC)和O. 001 O. 5 mg/L的油菜素内酯(BR)。
2.根据权利要求1所述的蝴蝶兰防褐变专用培养基，其特征在于其pH值保持在5.4 5. 6。
3.根据权利要求1所述的蝴蝶兰防褐变专用培养基，其特征在于所述的抗坏血酸 (VC)的浓度为8-12 mg/L,油菜素内酯(BR)的浓度为O. 05 O. 3 mg/L。
4.根据权利要求1所述的蝴蝶兰防褐变专用培养基，其特征在于所述的抗坏血酸 (VC)的浓度为10 mg/L，油菜素内酯(BR)的浓度为O.1 mg/L。
5.根据权利要求1所述的蝴蝶兰防褐变专用培养基，其特征在于所述的其中O.2 mg/ L的萘乙酸(NAA)可以用O. 2mg/L的吲哚乙酸(IAA)来代替。
全文摘要
本发明公开了一种蝴蝶兰防褐变专用培养基。其中以含有2.5mg/L的苄氨基腺嘌呤(BA)和0.2mg/L萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基为基本培养基，并加入了浓度为5-15mg/L的抗坏血酸(VC)和0.001-0.5mg/L的油菜素内酯(BR)。本发明可大幅度降低蝴蝶兰组织培养过程中的褐变率。
文档编号A01H4/00GK102986533SQ20121054066
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者毕德 申请人:苏州和美生物科技有限公司